Luận văn Bước đầu khảo sát nguồn gốc chó phú quốc dựa trên vùng nhiễm sắc thể y

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Hà Thị Cầm BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT NGUỒN GỐC CHÓ PHÚ QUỐC DỰA TRÊN VÙNG NHIỄM SẮC THỂ Y LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Hà Thị Cầm BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT NGUỒN GỐC CHÓ PHÚ QUỐC DỰA TRÊN VÙNG NHIỄM SẮC THỂ Y Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. TRẦN HOÀNG DŨNG TS. CHUNG ANH DŨNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được các tác giả công bố trong bất kì công trình nào. Các trích dẫn về bảng biểu, kết quả nghiên cứu của những tác giả khác, tài liệu tham khảo trong luận văn đều có nguồn gốc rõ ràng và theo đúng quy định. TP. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 04 năm 2015 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Hà Thị Cầm LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, con xin gởi đến ba mẹ và các anh chị lời cảm ơn và lòng biết ơn vô vàn. Ba mẹ và anh chị luôn ủng hộ con, cho con niềm tin, nghị lực trong cuộc sống, luôn chăm lo, động viên và hỗ trợ con mọi mặt cả về vật chất lẫn tinh thần. Tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Hoàng Dũng – người thầy đã tận tụy, hết lòng quan tâm, hướng dẫn và hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong những lúc khó khăn nhất. Trong suốt quá trình làm đề tài thầy luôn nhắc nhở, sửa chữa những sai sót và cũng không ngừng động viên, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Chung Anh Dũng thuộc Phòng Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam và Viện Kỹ thuật Công nghệ cao NTT – Trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại Viện. Tôi xin trân trọng biết ơn tới quý thầy, cô thuộc Khoa Sinh học và Phòng Đào tạo sau Đại học - Trường Đại học Sư phạm Tp HCM đã tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành việc báo cáo luận văn này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn tất cả các anh, chị, em, bạn bè trong Phòng Genome & Bioinformatic - Viện Kỹ thuật Công nghệ cao NTT – Trường Đại học Nguyễn Tất Thành và Phòng Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong quá trình làm đề tài tại Viện. TP Hồ Chí Minh, tháng 04 năm 2015 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Hà Thị Cầm MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các hình Danh mục các bảng MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN .............................................................................................. 5 1.1. Tổng quan về chó Phú Quốc................................................................................. 5 1.1.1. Phân loại giống chó Phú Quốc Việt Nam .................................................... 5 1.1.2. Đặc điểm giống chó Phú Quốc Việt Nam ................................................... 6 1.1.3. Nguồn gốc của chó Phú Quốc Việt Nam ..................................................... 7 1.1.4. Các nghiên cứu về chó Phú Quốc ở Việt Nam ............................................ 8 1.2. Các nghiên cứu ứng dụng trình tự gene để truy tìm nguồn gốc chó. ................... 9 1.2.1. Genome ty thể và việc sử dụng trình tự genome ty thể trong truy tìm nguồn gốc chó. ....................................................................................... 9 1.2.2. NST Y và việc sử dụng trình tự NST Y trong truy tìm nguồn gốc chó. ...................................................................................................... 12 1.2.3. Các nghiên cứu ứng dụng trình tự gen để truy tìm nguồn gốc chó Phú Quốc ở Việt Nam. ............................................................................... 15 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................................................... 17 2.1. Vật liệu – hóa chất .............................................................................................. 17 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................... 17 2.1.2. Hóa chất ...................................................................................................... 17 2.1.3. Hóa chất tách chiết DNA ............................................................................ 17 2.2. Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng ....................................................... 20 2.2.1. Phương pháp thu mẫu – tách DNA tổng số ................................................ 20 2.2.2. Phương pháp điện di agarose ...................................................................... 23 2.2.3. Phương pháp PCR khuếch đại trình tự vùng D-loop .................................. 23 2.2.4. Phương pháp khuếch đại từng vùng NST Y bằng kỹ thuật PCR ............... 25 2.2.5. Phương pháp giải trình tự ........................................................................... 27 2.2.6. Phương pháp hiệu chỉnh trình tự ................................................................ 28 2.2.7. So sánh với cơ sở dữ liệu GenBank ............................................................ 29 2.2.8. Phương pháp xây dựng bộ dữ liệu DNA .................................................... 29 2.2.9. Phương pháp xây dựng đa dạng di truyền dựa trên cây phát sinh loài ....... 29 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................................................... 30 3.1. Kết quả tách chiết và thu nhận DNA tổng số ................................................... 30 3.2. Ðịnh loại haplotype 3 mẫu chó Phú Quốc bằng trình tự vùng kiểm soát ........................................................................................................... 31 3.2.1. Thiết lập phản ứng PCR khuếch đại vùng kiểm soát ........................................... 31 3.2.2. Kết quả giải và phân tích trình tự DNA vùng D-loop ......................................... 32 3.2.3. Lắp ráp trình tự ..................................................................................................................... 32 3.2.4. So sánh trình tự truy vấn của các mẫu nghiên cứu với cơ sở dữ liệu GenBank .................................................................................................................................. 33 3.2.5. Định loại haplotype cho chó Phú Quốc ..................................................................... 34 3.3. Xây dựng quy trình PCR khuếch đại từng vùng hệ gen NST Y của 2 mẫu chó PQ31 và PQ32. ............................................................................................ 36 3.3.1. Xây dựng quy trình khuếch đại từng vùng DNA trên NST Y bằng kỹ thuật PCR ....................................................................................................................... 36 3.3.2. Kết quả giải trình tự các mảnh genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32 .................................................................................................................... 49 3.3.3. Lắp ráp trình tự .................................................................................................................. 49 3.3.4. So sánh trình tự truy vấn của các mảnh DNA NST Y nghiên cứu với cơ sở dữ liệu GenBank ........................................................................................... 50 3.3.5. Tổng kết kết quả giải trình tự. ..................................................................................... 51 3.3.6. Phân tích tính đa hình của trình tự NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32 ................................................................................................................................. 52 3.3.7. Suy luận haplotype của cá thể PQ31 và PQ32 từ các SNP đã nhận diện .......................................................................................................................................... 54 3.3.8. Bàn luận về nguồn gốc chó Phú Quốc. ................................................................... 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 58 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp Base pair – Cặp base DNA Deoxyribonucleic acid DNAse Deoxyribonuclease dNTP Deoxyribounucleotide triphosphate EDTA Ethylenediamine tetraacetate EtBr Ethidium bromide IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry kb Kilo base mtDNA Mitochondrial DNA – DNA ty thể NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction R Reverse rDNA Ribosomal DNA RNA Ribonucleic acid RNAse Ribounuclease SDS Sodium dodecyl sulfate Tm Melting Temperature TBE Tris/Borate/EDTA TE Tris – EDTA Taq Thermus aquaticus U Unit UV Ultraviolet VKA Vietnam Kennel Association F Forward DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Chó Vện – một trong hai con chó Phú Quốc của Việt Nam tham dự cuộc thi Chó đẹp thế giới tại Paris vào tháng 7/2011 ............................... 5 Hình 1. 2. Các dạng xoáy lưng của chó Phú Quốc .................................................... 6 Hình 2. 1. Vị trí bắt cặp của mồi 15412F và 42R trên vùng D-loop ....................... 23 Hình 3. 1. Kết quả điện di ba mẫu DNA tổng số của chó Phú Quốc ....................... 30 Hình 3. 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng D-loop của 3 mẫu chó Phú Quốc ......................................................................................................... 32 Hình 3. 3. Ðại diện một đoạn trình tự đồng nhất vùng kiểm soát của mẫu PQ19. ... 33 Hình 3. 4. Ðại diện một đoạn trình tự đồng nhất vùng kiểm soát của ba mẫu chó khảo sát. ................................................................................................... 33 Hình 3. 5. Kết quả BLAST đại diện của mẫu PQ19 trên NCBI ............................... 34 Hình 3. 6. Phả hệ đồ (phylogeny tree) mô tả chi tiết vị trí phân bố của chó lưng có xoáy Phú Quốc . .................................................................................. 35 Hình 3. 7. Kết quả PCR mảnh 03 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. .................................................................................................. 39 Hình 3. 8. Kết Quả PCR mảnh 11 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32 (lần 1) ........................................................................................ 39 Hình 3. 9. Kết quả PCR mảnh 11 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32 (lần 2) ........................................................................................ 40 Hình 3. 10. Kết quả PCR mảnh 12 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. .................................................................................................. 41 Hình 3. 11. Kết quả PCR mảnh 16 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. .................................................................................................. 41 Hình 3. 12. Kết quả PCR mảnh 20 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. ................................................................................................. 42 Hình 3. 13. Kết quả PCR mảnh 21 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. .................................................................................................. 42 Hình 3. 14. Kết quả PCR mảnh 24 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. .................................................................................................. 43 Hình 3. 15. Kết quả PCR mảnh 27 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. .................................................................................................. 43 Hình 3. 16. Kết quả PCR mảnh 28 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. .................................................................................................. 44 Hình 3. 17. Kết quả PCR mảnh 29 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32 ................................................................................................... 44 Hình 3. 18. Kết quả PCR mảnh 30 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32 ................................................................................................... 45 Hình 3. 19. Kết quả PCR mảnh 31 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. .................................................................................................. 46 Hình 3. 20. Kết quả PCR mảnh B genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. .................................................................................................. 46 Hình 3. 21. Kết quả PCR mảnh R genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. .................................................................................................. 47 Hình 3. 22. Kết quả PCR mảnh N genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. .................................................................................................. 47 Hình 3. 23. Kết quả PCR mảnh K genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. .................................................................................................. 48 Hình 3. 24. Biểu đồ huỳnh quang đại diện một phần kết quả giải trình tự của sản phẩm PCR bởi cặp primer 03HAf1 và 03r2 của 2 cá thể PQ31 và PQ31 ................................................................................................... 49 Hình 3. 25. Ðại diện một đoạn trình tự đồng nhất mảnh 03 genome NST Y của mẫu PQ31. ............................................................................................... 50 Hình 3. 26. Kết quả BLAST đại diện của mảnh 03 cá thể PQ31 trên NCBI ................ 50 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Hóa chất tách chiết DNA ........................................................................... 17 Bảng 2.2. Hóa chất chạy PCR .................................................................................... 18 Bảng 2.3. Hóa chất chạy điện di ................................................................................. 18 Bảng 2.4. Dụng cụ và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ........................................... 18 Bảng 2.5. Danh sách của ba mẫu chó sử dụng trong nghiên cứu............................... 21 Bảng 2.6. Cặp mồi đặc hiệu sử dụng trong phản ứng khuếch đại vùng gen D-loop ........................................................................................................ 24 Bảng 2.7. Các thành phần có trong phản ứng khuếch đại vùng D-loop .................... 24 Bảng 2.8. Chu trình nhiệt khuếch đại vùng D-loop ................................................... 24 Bảng 2.9. Tên và trình tự 36 primer sử dụng trong đề tài .......................................... 25 Bảng 2.10. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại từng vùng hệ gen NST Y của chó Phú Quốc sử dụng Taq DNA 2X PreMix - Hãng GeneOn (BC0612).................................................................................................... 27 Bảng 2.11. Chương trình PCR khuếch đại từng vùng hệ gen NST Y của chó Phú Quốc .................................................................................................... 27 Bảng 3.1. Nồng độ và độ tinh sạch DNA của ba mẫu nghiên cứu. ............................ 31 Bảng 3.2. Các cặp mồi khuếch đại từng vùng DNA trên NST Y .............................. 36 Bảng 3.3. Bảng tóm tắt kết quả giải trình tự sau khi hiệu chỉnh và thống nhất 2 chiều trình tự .............................................................................................. 51 Bảng 3.4. Phân tích biến đổi đơn nucleotide (SNP) của 2 cá thể PQ31 và PQ32 dựa trên trình tự vùng DNA của NST Y. ................................................... 52 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Chó (Canis familiaris) là động vật thuần hóa lâu đời nhất và được cho là đã tiến hóa từ sói (Canis lupus) [34]. Trên toàn thế giới có hơn 400 giống, được nuôi sử dụng với nhiều mục đích khác nhau. Trong đó, chỉ có 3 giống chó có xoáy lưng là giống chó Phú Quốc của Việt Nam, chó xoáy Thái Lan và chó xoáy Nam Phi (Rhodesian Ridgebacks). Với những đặc tính như thông minh, nhanh nhẹn, hình dáng đẹp chó Phú Quốc hiện đang trở thành một giống chó quý của nước ta. Tuy nhiên, nguồn gốc chó Phú Quốc hiện nay vẫn còn nhiều tranh luận. Ngoài chó Phú Quốc Việt Nam, trên thế giới còn có hai giống chó khác cũng có dải lông xoáy trên lưng là chó xoáy Thái Lan và chó xoáy Rhodesian Nam Phi. Hai giống chó này đã được Liên đoàn Các hiệp hội Nuôi chó giống Quốc tế (Federation Cynologique Internationale - FCI) công nhận. Chó Phú Quốc vì chưa được đăng ký tại FCI nên nhiều nguời cho rằng nó có nguồn gốc từ chó xoáy Thái Lan [36]. Hiện nay, Việt Nam đã có một số nghiên cứu trên chó Phú Quốc. Tuy nhiên, những nghiên cứu này chỉ dừng lại ở việc khảo sát và ghi nhận lại các đặc điểm về hình thái bên ngoài, chưa có nghiên cứu nào đi sâu về mặt di truyền, nghiên cứu ở mức độ phân tử để có thể cho được một kết luận về nguồn gốc chó Phú Quốc mang tính khoa học nhất. Do đó, việc xác định nguồn gốc và bảo vệ nguồn gen chó Phú Quốc là mối quan tâm hàng đầu của các nhà khoa học. Hơn nữa, việc xác định các kiểu di truyền và tạo lập cơ sở dữ liệu DNA của các giống, loài, đăng kí ở ngân hàng gen thế giới về tài nguyên di truyền động vật đặc hữu của Việt Nam nói chung và giống chó Phú Quốc nói riêng đang là vấn đề rất quan trọng, mang tính khoa học và thực tiễn cao. Các nghiên cứu trên mtDNA của chó, cụ thể là vùng điều khiển (D-loop) đã xác định được 6 nhóm haplotype là A, B, C, D, E, và F [33], trong đó có đến 71,3 % chó mang haplotype A; 95,9 % mang haplotype A, B hoặc C, cả 3 nhóm đều phân bố trên toàn thế giới (trừ nhóm C không có ở Châu Mỹ). Ngược lại, ba nhóm haplotype D, E và F là nhóm hiếm, chỉ chiếm chưa đến 5% cá thể chó trên thế giới và phân bố hạn hẹp 2 ở khu vực Đông Á. Hơn nữa, các nghiên cứu trên mtDNA cũng cho thấy sự đa dạng di truyền cao nhất được tìm thấy trong số những con chó trong khu vực Đông Á, và dữ liệu mtDNA cũng chỉ ra rằng nguồn gốc của những con chó là từ thuần hóa sói trong khu vực Nam Á của Sông Dương Tử (ASY) [33], [27], [18]. Từ năm 2012, Phòng Genomics & Bioinformatics, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu giải trình tự hệ gen ty thể chó Phú Quốc để đánh giá độ đa dạng di truyền chó Phú Quốc giống tại Tp. Hồ Chí Minh” đã cho ra nhiều kết quả nổi bật. Theo đó, chó Phú Quốc mang kiểu gene đơn bội dạng E thuộc là dạng rất hiếm trên thế giới (chỉ chiếm 1-2%) phân bố hạn hẹp ở khu vực Đông Á như ShiBa Nhật Bản, Indo Hàn Quốc, Shar-Pei Trung Quốc và PungSang Triều Tiên. Mặc dù, sử dụng mtDNA cho kết quả xác thực nhưng nó hạn chế là chỉ nghiên cứu trên dòng mẹ. Còn nghiên cứu nguồn gốc theo dòng cha thì không có. Một nghiên cứu gần đây của Ding và cộng sự (2012), trong đó đã dựa trên kiểu di truyền dòng cha phân tích vùng DNA trên NST Y có kích thước 14.437 bp của 151 con chó lấy mẫu trên toàn thế giới và tìm thấy 28 haplotype phân phối trong năm nhóm gen đơn bội, trong đó có hai nhóm chủ yếu giới hạn trong khu vực Đông Á. Đồng thời định loại haplotype đã ghi nhận 1 cá thể chó Phú Quốc nằm trong nhóm H1a là một dẫn xuất của nhóm HG1, trong khi đó 2 cá thể chó Thái Ridgeback mang haplotype H6a và H8a là dẫn xuất từ nhóm HG6. Hai nhóm HG1 và HG6 được cho là xuất p