Nền y học hiện đại đã phát hiện và điều trị được rất nhiều bệnh, nâng cao chất
lượng sức khỏe của con người. Nhưng bên cạnh đó còn nhiều bệnh nan y chưa tìm
ra phương pháp chữa trị, trong đó các bệnh di truyền vẫn là một trong những bài
toán khó giải đối với nền y học. Một trong những bệnh di truyền đang được quan
tâm rất nhiều hiện này là hội chứng Down ( Down syndrome ).
Hội chứng Down là hội chứng hay gặp nhất trong các hội chứng có biểu hiện
rối loạn nhiễm sắc thể. Các hậu quả do hội chứng Down gây ra cho con người là
rất lớn : sảy thai, sinh con mang dị tật, trẻ sơ sinh chết sớm, trí tuệ chậm phát triển
và vô sinh. Những người mang hội chứng Down cũng đã trở thành những gánh
nặng rất lớn cho gia đình và xã hội. Hiện nay y học vẫn chưa tìm ra được phương
pháp chữa trị hội chứng Down mà mới chỉ có thể hạn chế trẻ mang hội chứng
Down bằng phương pháp chẩn đoán trước sinh. Phương pháp để phát hiện hội
chứng Down phổ biến nhất ở Việt Nam hiện nay là sử dụng Tripple test và siêu âm
thai nhi, sau đó lập karyotype để xác định trisome 21 ( tam nhiễm nhiễm sắc thể
21 ). Nhưng phương pháp này hiện nay thường cho kết quả để phát hiện hội chứng
Down với độ chính xác chưa đạt được 100% [2].
Với sự phát triển vượt bậc của khoa học kỹ thuật hiện nay, kỹ thuật PCR
đang được áp dụng rất rộng rãi trong nền y học hiện đại. Kỹ thuật PCR được Kary
Mullis tìm ra đã giúp các nghiên cứu về DNA nói riêng, về sinh học phân tử nói
chung đạt được những thành tựu đáng kinh ngạc. Nhờ phản ứng này, một đoạn
DNA ở một vùng bất kỳ trong bộ gene được khuếch đại lên rất nhiều lần khi trình
tự nucleotide ở hai đầu đoạn DNA đó đã biết. Dựa vào trình tự đó, các cặp
oligonucleotide được tổng hợp nhân tạo, mỗi oligo tạo liên kết bổ sung với từng
2
sợi đơn. Chúng được sử dụng làm mồi để tổng hợp DNA trong in vitro nhờ
enzyme DNA polymerase. Đặc biệt phản ứng PCR chỉ đòi hỏi một lượng DNA
làm khuôn ban đầu rất nhỏ (khoảng 10-3µg). Điều này đặc biệt quan trọng và có ý
nghĩa đối với việc phát hiện những mẫu DNA ít như chẩn đoán nhiễm khuẩn trong
y học, xác định tội phạm gây án trong kỹ thuật hình sự, khi mà DNA thu được từ
các mẫu thường rất ít.
Hiện nay chúng ta đã tìm ra được rất nhiều gene nằm trên nhiễm sắc thể 21
có liên quan đến hội chứng Down, trong đó có 1 gene rất quan trọng là gene SOD1
( Superoxide Dismutase 1 hay Cu/Zn Superoxide Dismutase ). gene SOD -1 nằm
trên nhánh dài của nhiễm sắc thể số 21, quy định tổng hợp enzyme SOD -1. Enzym
SOD -1 nằm trong bào tương của các tế bào Eukaryota, có chức năng chống oxi
hóa bằng cách chuyển O2-thành H2O2 , sau đó enzym Catalase hoặc Glutathione
peroxidase (GPx) sẽ chuyển H2O2 thành O2 và H2O. Người mắc hội chứng Down
có thêm 1 nhiễm sắc thể 21, nên lượng enzyme SOD -1 được tổng hợp nhiều hơn
bình thường (gấp 1,5 lần), do đó lượng sản phẩm chuyển hóa của nó cũng tăng
theo. Thông thường ở hầu hết các mô thì sự tăng enzyme SOD-1 thường kéo theo
các enzyme Catalase và GPx tăng theo tương ứng. Nhưng trong các tế bào thần
kinh thì không có sự tăng theo của 2 enzyme trên, chính vì vậy dẫn đến dư thừa
lượng H2O2trong các tế bào thần kinh, dẫn đến thoái hóa và phá hủy tế bào thần
kinh. Tạo ra các biểu hiện lâm sàng của hội chứng Down như: đần độn, IQ thấp
(dưới 50), tỷ lệ mắc Alzheimer’s cao ở độ tuổi trung niên [16,17]. Vì vậy, chúng
tôi thực hiện đề tài “ Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích gene SOD1 ở tế bào ối bà
mẹ mang thai nghi hội chứng Down ” với mục tiêu :
1. Chuẩn hóa quy trình tách chiết DNA từ tế bào ối của bà mẹ mang thai.
2. Tối ưu hóa phản ứng PCR ( nồng độ DNA khuôn, chu trình nhiệt ) với
gene SOD1 ở bệnh nhân mang hội chứng Down với bệnh nhân chứng.
56 trang |
Chia sẻ: tuandn | Lượt xem: 2676 | Lượt tải: 1
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận văn Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích gene SOD1 ở tế bào ối bà mẹ mang thai nghi hội chứng Down, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nền y học hiện đại đã phát hiện và điều trị được rất nhiều bệnh, nâng cao chất
lượng sức khỏe của con người. Nhưng bên cạnh đó còn nhiều bệnh nan y chưa tìm
ra phương pháp chữa trị, trong đó các bệnh di truyền vẫn là một trong những bài
toán khó giải đối với nền y học. Một trong những bệnh di truyền đang được quan
tâm rất nhiều hiện này là hội chứng Down ( Down syndrome ).
Hội chứng Down là hội chứng hay gặp nhất trong các hội chứng có biểu hiện
rối loạn nhiễm sắc thể. Các hậu quả do hội chứng Down gây ra cho con người là
rất lớn : sảy thai, sinh con mang dị tật, trẻ sơ sinh chết sớm, trí tuệ chậm phát triển
và vô sinh. Những người mang hội chứng Down cũng đã trở thành những gánh
nặng rất lớn cho gia đình và xã hội. Hiện nay y học vẫn chưa tìm ra được phương
pháp chữa trị hội chứng Down mà mới chỉ có thể hạn chế trẻ mang hội chứng
Down bằng phương pháp chẩn đoán trước sinh. Phương pháp để phát hiện hội
chứng Down phổ biến nhất ở Việt Nam hiện nay là sử dụng Tripple test và siêu âm
thai nhi, sau đó lập karyotype để xác định trisome 21 ( tam nhiễm nhiễm sắc thể
21 ). Nhưng phương pháp này hiện nay thường cho kết quả để phát hiện hội chứng
Down với độ chính xác chưa đạt được 100% [2].
Với sự phát triển vượt bậc của khoa học kỹ thuật hiện nay, kỹ thuật PCR
đang được áp dụng rất rộng rãi trong nền y học hiện đại. Kỹ thuật PCR được Kary
Mullis tìm ra đã giúp các nghiên cứu về DNA nói riêng, về sinh học phân tử nói
chung đạt được những thành tựu đáng kinh ngạc. Nhờ phản ứng này, một đoạn
DNA ở một vùng bất kỳ trong bộ gene được khuếch đại lên rất nhiều lần khi trình
tự nucleotide ở hai đầu đoạn DNA đó đã biết. Dựa vào trình tự đó, các cặp
oligonucleotide được tổng hợp nhân tạo, mỗi oligo tạo liên kết bổ sung với từng
2
sợi đơn. Chúng được sử dụng làm mồi để tổng hợp DNA trong in vitro nhờ
enzyme DNA polymerase. Đặc biệt phản ứng PCR chỉ đòi hỏi một lượng DNA
làm khuôn ban đầu rất nhỏ (khoảng 10-3 µg). Điều này đặc biệt quan trọng và có ý
nghĩa đối với việc phát hiện những mẫu DNA ít như chẩn đoán nhiễm khuẩn trong
y học, xác định tội phạm gây án trong kỹ thuật hình sự, khi mà DNA thu được từ
các mẫu thường rất ít.
Hiện nay chúng ta đã tìm ra được rất nhiều gene nằm trên nhiễm sắc thể 21
có liên quan đến hội chứng Down, trong đó có 1 gene rất quan trọng là gene SOD1
( Superoxide Dismutase 1 hay Cu/Zn Superoxide Dismutase ). gene SOD -1 nằm
trên nhánh dài của nhiễm sắc thể số 21, quy định tổng hợp enzyme SOD -1. Enzym
SOD -1 nằm trong bào tương của các tế bào Eukaryota, có chức năng chống oxi
hóa bằng cách chuyển O2
-
thành H2O2 , sau đó enzym Catalase hoặc Glutathione
peroxidase (GPx) sẽ chuyển H2O2 thành O2 và H2O. Người mắc hội chứng Down
có thêm 1 nhiễm sắc thể 21, nên lượng enzyme SOD -1 được tổng hợp nhiều hơn
bình thường (gấp 1,5 lần), do đó lượng sản phẩm chuyển hóa của nó cũng tăng
theo. Thông thường ở hầu hết các mô thì sự tăng enzyme SOD-1 thường kéo theo
các enzyme Catalase và GPx tăng theo tương ứng. Nhưng trong các tế bào thần
kinh thì không có sự tăng theo của 2 enzyme trên, chính vì vậy dẫn đến dư thừa
lượng H2O2 trong các tế bào thần kinh, dẫn đến thoái hóa và phá hủy tế bào thần
kinh. Tạo ra các biểu hiện lâm sàng của hội chứng Down như: đần độn, IQ thấp
(dưới 50), tỷ lệ mắc Alzheimer’s cao ở độ tuổi trung niên [16,17]. Vì vậy, chúng
tôi thực hiện đề tài “ Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích gene SOD1 ở tế bào ối bà
mẹ mang thai nghi hội chứng Down ” với mục tiêu :
1. Chuẩn hóa quy trình tách chiết DNA từ tế bào ối của bà mẹ mang thai.
2. Tối ưu hóa phản ứng PCR ( nồng độ DNA khuôn, chu trình nhiệt ) với
gene SOD1 ở bệnh nhân mang hội chứng Down với bệnh nhân chứng.
3
CHƢƠNG I : TỔNG QUAN
1.Bệnh sử hội chứng Down :
1.1.Lịch sử nghiên cứu hội chứng Down :
Hội chứng Down hay gặp nhất trong các hội chứng có biểu hiện rối loạn NST
ở trẻ sơ sinh sống . Năm 1846 , Seguin lần đầu tiên mô tả những đặc điểm hình thái
của bệnh với tên gọi “ Furfuraceuos Indocy ”. Năm 1866 , John Langdon Down đã
mô tả một số bệnh nhân chậm trí tuệ với những dấu hiệu về hình thái rất đặc trưng
: mặt tròn , khe mắt xếch , nếp quạt , hình ảnh bất thường về nếp gấp ở lòng bàn
tay và giảm trương lực cơ , … Năm 1959 , Lejenue và các cộng sự đã phát hiện ở
những bệnh nhân mắc hội chứng Down có 47 NST và thừa 1 NST số 21 [2].
1.2.Nguyên nhân hội chứng Down :
Khoảng 92% trường hợp mắc hội chứng Down là thể tam nhiễm 2 NST số 21
thuần : 47,XX,+21 hoặc 47,XY,+21. Thể tam nhiễm 21 này xảy ra do rối loạn sự
phân ly cặp NST 21 trong quá trình tạo giao tử, karyotype của bố mẹ trong trường
hợp này là bình thường. Khoảng 1% những trường hợp này, người ta có thể quan
sát thấy thể khảm với dòng thể tam nhiễm 21 rất ít ở một trong hai bố mẹ hoặc rối
loạn cấu trúc của các NST khác ( không liên quan đến NST 21 ) trong bộ NST [2].
Khoảng 2-3% trường hợp là thể khảm với 2 dòng tế bào : một dòng tế bào
chứa 46 NST và một dòng tế bào chứa 47 NST, thừa 1 NST số 21 :
46,XX/47,XY,+21 hoặc 46,XY/47,XX,+21 hoặc thể khảm xảy ra do rối loạn phân
ly cặp NST 21 trong quá trình phân cắt hợp tử. Kết quả tạo nên dòng tế bào thể tam
4
nhiễm 21 bên cạnh dòng tế bào bình thường, dòng tế bào monosomi 21 bị loại bỏ
[2].
Khoảng 4-5% trường hợp là thể chuyển đoạn, trẻ mắc hội chứng Down thể
này có 46 NST với 2 NST số 21 và NST số 21 thứ 3 được chuyển đoạn với các
NST tâm đầu khác trong bộ NST ( hay gặp là NST số 13,14 hoặc 15 thuộc nhóm D
hoặc số 21.22 thuộc nhóm G ). Về triệu chứng lâm sàng không khác so với hội
chứng Down do thể tam nhiễm 21 thuần, nhưng là bệnh có tính chất gia đình. Bố
hoặc mẹ của những đứa trẻ mắc hội chứng Down do chuyển đoạn có thể là những
người bình thường nhưng mang NST chuyển đoạn cân bằng giữa NST 21 với các
NST số 13,14,15 (nhóm D) hoặc NST số 21,22 ( nhóm G) [2].
Bảng 1 : Khả năng tạo giao tử và hợp tử ở ngƣời mang NST chuyển đoạn
giữa NST số 14 và NST số 21 [2].
Người mang
NST chuyển
đoạn
Giao tử
Thụ tinh
(+14,21)
Hợp tử
Kiểu hình
14,t(14;21),21
- 14,21
- t(14;21)
+14;21 14,14,21,21
14t(14;21),21
(1)
(2)
- t(14;21)21
- 14
+14,21 14 t(14;21), 21
14,14,21
(3)
(4)
- 14 t(14;21) +14;21 14, 14t(14;21), 21 (5)
5
- 21 14,21,21 (6)
- 14, t(14;21)
- 0
+14;21 14,14t(14;21),21,21
14,21
(7)
(8)
(1): Bình thường.
(2): Lành mang NST chuyển đoạn.
(3): Hội chứng Down do chuyển đoạn.
(4): Monosomi NST số 21, chết phôi thai.
(5): Thể tam nhiễm NST 14, thường chết phôi thai.
(6): Monosomi NST số 14, chết phôi thai.
(7): Thể tam nhiễm kép NST 14,21, chết phôi thai.
(8): Monosomi kép NST 14,21, chết phôi thai.
Cơ chế di truyền hội chứng Down do chuyển đoạn t(21q;22q) cũng tương tự
như trường hợp hội chứng Down do chuyển đoạn t(14q;21q) [2].
6
1.3.Tỷ lệ mắc bệnh :
Hội chứng Down gặp khoảng 1/700-1/800 trẻ sơ sinh . Tần số này không có
sự khác biệt nhau giữa các chủng tộc và giữa các tầng lớp xã hội trên thế giới.
Theo những nghiên cứu gần đây nhất , tỷ lệ trẻ sơ sinh mắc hội chứng Down tỷ lệ
với tuổi của người mẹ [2]:
Ước tính tỷ lệ bị hội chứng Down
(Công trình nghiên cứu của tiểu bang New York)[15]
Tuổi người mẹ
20
25
30
33
35
36
38
40
Tỷ lệ ước tính
1/1925
1/1205
1/885
1/590
1/365
1/285
1/175
1/110
7
45
49
1/32
1/12
Ngoài ra, tuổi của người bố cũng ảnh hưởng tới tần số sinh con mắc hội chứng
Down [2].
1.4.Triệu chứng lâm sàng :
Hội chứng Down có những biểu hiện điển hình dễ nhận biết :
Đầu nhỏ , ngắn , mặt tròn , gốc mũi tẹt , khe mắt xếch , nếp quạt , khẩu cái
hẹp , vòm cung cao , lưỡi to và dày hay nứt nẻ , thường thè ra ngoài làm cho miệng
không đóng kín ( nửa mở )[2].
Tai nhỏ , có khi biến dạng , vị trí thấp [2].
Cổ ngắn , gáy phẳng rộng [2].
Bàn tay rộng , các ngón ngắn [2].
Chậm phát triển trí tuệ , chỉ số IQ trung bình khoảng 30-50. Giảm trương lực cơ và
nhão dây chằng [2].
Nếp vân da bàn tay : nếp ngang duy nhất ở lòng bàn tay, có thể gặp ở một
hoặc cả 2 bàn tay. Chạc ba trục ở vị trí cao thường gặp ở vị trí t”. Tần số hoa vân ở
mô út tăng[ 2].
8
Thường gặp là dị tật tim, tần số được xếp theo thứ tự là thông liên thất , thông
liên nhĩ , còn ống động mạch. Dị tật tiêu hoá : chủ yếu là hẹp tá tràng , không hậu
môn và phình to đại tràng ( Megacolon ) [2].
1.5.Tiên lƣợng :
Người mắc hội chứng Down thường bị chết sớm vì tật của tim hoặc tật của
ống tiêu hoá, thường bị nhiễm khuẩn, thường dễ cảm ứng với bệnh bạch cầu.
Trước đây khoảng 50% chết trong vòng 5 năm đầu, một số sống sót đến tuổi
trưởng thành. Hiện nay do điều kiện xã hội, sự chăm sóc y tế được cải thiện nên
bệnh nhân Down sống đến giai đoạn trưởng thành nhiều hơn, nhưng chỉ có một số
ít bệnh nhân nữ sinh con. Nam mắc hội chứng Down vô sinh [15,17].
1.6.Chẩn đoán hội chứng Down :
Hội chứng Down cho đến nay vẫn chưa có khả năng chữa được. Vì vậy,
chúng ta nên chẩn đoán trước sinh nhằm hạn chế sinh ra những đứa trẻ mắc hội
chứng Down.
1.6.1.Đối tƣợng cần chẩn đoán trƣớc sinh :
+ Tuổi của các cặp vợ chồng, nhất là tuổi của vợ ( ≥ 35 tuổi ).
+ Các cặp vợ chồng có tiền sử sẩy thai liên tiếp và đẻ con dị tật, đặc biệt là đẻ
con mắc hội chứng Down.
+ Vợ hay chồng là những người mang NST chuyển đoạn cân bằng :
45,XX(XY),t(Dq;21q) hoặc 45,XX(XY),t(21q;Gq).
+ Vợ hoặc chồng có tiếp xúc với các tác nhân gây đột biến : các chất phóng xạ
, các hoá chất , …[2].
9
1.6.2.Các phƣơng pháp chẩn đoán trƣớc sinh :
+ Xét nghiệm sàng lọc ( Triple test ) trong huyết thanh mẹ :
AFP: Alpha feto protein
HCG: Human chorionic gonadotropin
uE3: Unconjugated estriol (Estriol không liên hợp)
Nếu người mẹ mang thai mắc hội chứng Down thì αFP và uE3 giảm, βHCG
tăng.
+ Siêu âm thai : ở các tuần thứ 11 , 21 và 31 của thai nhi. Siêu âm thai có thể
chẩn đoán hội chứng Down dựa vào các dấu hiệu như: khoảng sáng sau gáy ≥
3mm ở 3 tháng đầu, ngắn xương cánh tay, xương đùi kèm theo dị tật tim, đa ối,…
+ Sinh thiết tua rau để phân tích NST.Sinh thiết tua rau hiện nay ít sử dụng vì
phương pháp này gây tỷ lệ sảy thai khá cao ( 2-3%) [2].
+ Nuôi cấy tế bào ối để phân tích NST. Hiện nay ở nước ta, đây là phương
pháp chẩn đoán sau cùng để xác định chính xác thai nhi có mắc hội chứng Down
hay không. Tế bào ối sau khi được nuôi cấy sẽ được xác định karyotype bằng
phương pháp nhuộm băng G để chẩn đoán trisome 21. Trong những năm gần đây,
kỹ thuật PCR đã có những thành tựu rất lớn trong nền y học giúp con người có thể
chẩn đoán được nhiều căn bệnh di truyền thông qua việc phân lập và khuếch đại
các gene gây bệnh, và đối với việc chẩn đoán hội chứng Down cũng vậy. Chúng ta
đã xác định được rất nhiều gene trên NST 21 gây nên hội chứng Down : APP
( Amyloid beta A4 precusor protein ), DYRK ( Dual-specificity Tyrosine
Phosphorylation-Regulated Kinase 1A), IFNAR ( Interferon, Alpha, Beta, and
Omega, Receptor ), DSCR1( Down Syndrome Critical Regional Gene 1),… và
10
trong đó có gene SOD1 ( Superoxide Dismutase 1). Chúng ta tiến hành chọc ối bà
mẹ mang thai ( thời gian chọc ối tốt nhất là khoảng khi thai được 16-19 tuần tuổi-
phương pháp chọc ối kinh điển ), sau đó tế bào ối sẽ được đem nuôi cấy, tách chiết
DNA và thực hiện phản ứng PCR để xác định gene đặc hiệu, sau đó đánh giá được
kết quả sau khi so sánh với mẫu bình thường để đánh giá kết quả. Trong tương lai,
kỹ thuật PCR được đánh giá sẽ là phương pháp chủ yếu để chẩn đoán trước sinh
hội chứng Down [16].
2.Tình hình nghiên cứu hội chứng Down :
2.1.Trên thế giới :
Trên thế giới hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu về hội chứng Down .
Trước đây , ở các nước tiên tiến vẫn áp dụng chủ yếu để chẩn đoán hội chứng
Down bằng phương pháp chỉ điểm huyết thanh. Rất nhiều nghiên cứu đã được đưa
ra nhằm ngày càng hoàn thiện phương pháp này.
Tại Châu Âu, Anh Quốc được xem là nước đi đầu trong nghiên cứu các xét
nghiệm tầm soát hội chứng Down ngay từ khởi thủy cho đến hiện nay. Trước khi
Integrated test ra đời, Double test, sau đó là Triple test là xét nghiệm được ưa
chuộng tại Châu Âu. Tại Pháp, cho đến hội nghị về chẩn đoán tiền sản 2002, vẫn
11
còn nhiều bàn cãi về việc có nên chuyển chương trình tầm soát dùng Tripple test
trong tam cá nguyệt thứ hai sang các test xét nghiệm ở giai đoạn sớm hơn không.
Hiện tại, một số nước đã áp dụng Integrated test như Anh, Đức, Ý, Hà Lan, Thụy
Sĩ, Bồ Đào Nha …
Cho đến 1995, tại Mỹ, Double test, Triple test hay AFP sử dụng đơn độc được
sử dụng trên nhiều labo xét nghiệm khác nhau. Tiếp sau đó, Quadruple test được
lựa chọn sử dụng do độ phát hiện khá cao. Sau nhiều công bố về hiệu quả của
Integrated test, ở Châu Mỹ hiện tại có Mỹ, Canada, Brazil, Venezuela đang sử
dụng test này trong tầm soát.
Tại Singapore, việc áp dụng Tripple test được bắt đầu những năm 90. Tổng
kết việc thực hiện tầm soát hội chứng Down bằng Tripple test 1993-1998 cho thấy
mặc dù tỷ lệ mẹ lớn tuổi sinh con có gia tăng nhưng tỷ lệ trẻ Down ra đời không
gia tăng, chứng tỏ chương trình tầm soát thực hiện có hiệu quả. Hiện tại, đã có
những nghiên cứu đánh giá về tầm soát hội chứng Down sớm trong tam cá nguyệt
thứ nhất.
Tại Đài Loan, từ 1995, đã có nghiên cứu khảo sát sự thay đổi hCG trong tam
cá nguyệt thứ hai. Double test được sử dụng trong nghiên cứu tầm soát hội chứng
Down từ 1996. Cho đến 2001, bắt đầu có nhiều khảo sát để sử dụng NT(Nuchael
translucency – phương pháp đo độ dày da gáy của thai nhi ở 11 tuần tuổi bằng
phương pháp siêu âm ) trong tầm soát [17].
Kết hợp NT và xét nghiệm PAPP-A trong tam cá nguyệt 1 cho phép chẩn
đoán sớm hội chứng Down.
12
Bảng 2: Các chƣơng trình tầm soát hội chứng Down[15].
Loại test Bắt đầu áp dụng CĐHT được sử dụng Thời điểm
Double test 1988 AFP, hCG/uE3 TCN2
Tripple test 1988 AFP hCG uE3 TCN2
Quadruple test 1996 AFP hCG uE3 InhA TCN2
Combined test 1997 NT + hCG + PAPP-
A
TCN1
Integrated test 1999 PAPP-A + NT
Tripple/Quadru
TCN1
+ TCN2
TCN: tam cá nguyệt
Có tính thêm yếu tố nguy cơ của tuổi mẹ
Bảng 3: Giá trị các chƣơng trình tầm soát [15].
Loại test Tỷ lệ phát hiện DR Giá trị OAPR
Double test 45-54% 1/85 – 1/70
Tripple test 59-69 1/65 – 1/55
13
Quadruple test 67-76 1/55 / 1/50
Combined test 85 1/45
Integrated test 94 1/9 – 1/13
Phát hiện với khả năng 5% âm tính giả
Đã tính thêm nguy cơ từ tuổi mẹ.
Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu để áp dụng kỹ thuật PCR vào
chẩn đoán hội chứng Down, tuy còn mới mẻ nhưng đã có rất nhiều thành công
được ghi nhận và trong tương lai sẽ là phương pháp chủ yếu để chẩn đoán hội
chứng Down .
2.2.Tại Việt Nam :
Ở Việt Nam hiện nay, siêu âm thai nhi, Triple test và kỹ thuật kariotype vẫn là
phương pháp chủ yếu để chẩn đoán hội chứng Down. Sau khi các bà mẹ mang thai
tiến hành siêu âm và được sàng lọc qua Triple test, nếu thấy thai nhi có nguy cơ bị
mắc hội chứng Down sẽ được tiến hành chọc ối để xác định kariotype của thai nhi.
Nếu thai nhi mắc hội chứng Down thì sẽ có karyotype bất thường ( 3NST 21), đây
14
là bước cuối cùng để xác định chính xác thai nhi có bị mắc hội chứng Down hay
không.
Nhưng những phương pháp này vẫn còn rất nhiều hạn chế : tỷ lệ phát hiện hội
chứng Down còn thấp ( 59-69% ) , chỉ phát hiện được các trường hợp 3NST số 21 ,
mất nhiều thời gian thực hiện xét nghiệm ,...[2]
Hiện nay, kỹ thuật PCR đã trở nên khá phổ biến ở trên thế giới cũng như ở Việt
Nam . Và việc sử dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán hội chứng Down cũng đã bắt
đầu được nghiên cứu ở một số trung tâm nghiên cứu y học hàng đầu ở Việt Nam :
Trường Đại học Y Hà Nội , Học viện Quân Y ,…
3.Gene SOD1:
Gene SOD1 ( Superoxide Dismutase 1 hay Cu/Zn Superoxide Dismutase ) là gene
được phát hiện trên NST 21 của người ở đoạn 21q22.1 và cũng là gene được
nghiên cứu là có liên quan đến hội chứng Down [16].
15
Hình 1: Vị trí của gene SOD1 trên NST 21.
3.1. Cấu tạo gene SOD1 :
SOD1 thực chất là 1 enzym kim loại , có nghĩa là trong amino acids của nó có
chứa ion kim loại , cụ thể ở đây là 2 ion Zn và Cu . Trong đó ion Zn được giới hạn
bởi 3 histidine bã là His61 , His69 , His78 và 1 aspartate bã là Asp81 . Còn ion Cu
16
được giới hạn bởi 4 histidine bã là His44 , His46 , His61 và His118. Hai ion kim
loại này được nối với nhau bởi 1 histidine cầu nối là His61 [16].
Hình 2 : Hình ảnh cấu tạo gene SOD1
Ngoài enzyme Cu/ZnSOD còn có các enzyme SOD khác nữa như: MnSOD
(thành phần chứa kim loại Mangan, loại này có trong ty thể), FeSOD (thành phần
chứa kim loại Sắt, loại này tìm thấy trong một số sinh vật nguyên thủy).
3.2. Sự liên quan của gene SOD1 đến hội chứng Down :
17
Gene SOD1 được tìm thấy trên NST số 21 của người tại vị trí 21q22.1. Hiện nay
gene SOD1 đã được phát hiện gây ra 2 bệnh : Xơ cứng cột bên teo cơ ( ALS ) và
hội chứng Down ( 3 NST 21 ) [12].
Theo những nghiên cứu khoa học gần đây cho biết , gốc O2
-
được sinh ra trong quá
trình vận chuyển electron của ty thể và gốc superoxide này gây hại cho tế bào
thông qua cơ chế : chúng hút các electron của các phân tử bên cạnh và cuối cùng
dẫn đến phá huỷ tế bào . Và enzyme Cu/ZnSOD can thiệp , ngăn chặn quá trình
này bằng cách biến đổi gốc O2
-
và không còn gây hại cho tế bào :
Cu
2+
+ O2
-
-> Cu
+
+ O2
Cu
+
+ O2
-
+ 2H
+
-> Cu
2+
H2O2
=> 2O2
-
+ 2H
+
-> H2O2 + O2
Sau đó , enzym catalase thoái hoá H2O2 :
2H2O2 -> 2H2O + O2
Hay :
H2O2 + 2H
+
-> 2H2O
Và không còn gây hại cho tế bào [16].
18
Nếu không có các enzym này thì H2O2 và O2
-
sẽ tấn công các acid béo không
bão hòa cấu tạo lipd màng tế bào gây ra sự biến chất của cấu trúc màng và sẽ phá
hủy tế bào. Điều này biểu hiện rất rõ trong bệnh xơ cứng cột bên teo cơ (ALS:
Amyotrophic lateral sclerosis) và hội chứng Down. Trong bệnh ALS, do chỉ còn 1
gene SOD -1 (bình thường là 2 gene trên 2 nhiễm sắc thể tương đồng), nên lượng
enzyme SOD -1 trong tế bào bị giảm đi so với điều kiện sinh lý bình thường. Nên
không chuyển hóa hết được các phân tử O2
-
được tạo ra. Điều này gây độc cho tế
bào đặc biệt là các tế bào thần kinh vận động (motor neurone) ở sừng trước tủy
sống, nhân vận động ở cuống não và các sợi thần kinh tủy sống. Hậu quả là làm
yếu cơ, teo cơ, suy hô hấp và tử vong. Trong hội chứng Down thì ngược lại. Người
mắc hội chứng Down có thêm 1 nhiễm sắc thể 21, nên lượng enzyme SOD -1 được
tổng hợp nhiều hơn bình thường (gấp 1,5 lần), do đó lượng sản phẩm chuyển hóa
của nó cũng tăng theo. Thông thường ở hầu hết các mô thì sự tăng enzyme SOD -1
thường kéo theo các enzyme Catalase và Glutathione peroxidase tăng theo tương
ứng, nên không gây hại gì. Nhưng trong các tế bào thần kinh thì không có sự tăng
theo của 2 enzyme trên, chính vì vậy dẫn đến dư thừa lượng H2O2 trong các tế bào
thần kinh, dẫn đến thoái hóa và phá hủy tế bào thần kinh. Tạo ra các biểu hiện lâm
sàng của hội chứng Down như: đần độn, IQ thấp (dưới 50), tỷ lệ mắc Alzheimer’s
cao ở độ tuổi trung niên...[12].
19
4.Phƣơng pháp và kỹ thuật phân tích nghiên cứu gene SOD-1 từ tế
bào ối :
Quy trình thực hiện xét nghiệm phát hiện tần suất gene SOD1 trong tế bào ối
bao gồm các bước sau :
+ Lấy mẫu : tiến hành lấy tế bào ối của bà mẹ mang thai nghi ngờ mắc hội
chứng Down.
+ Nuôi cấy mẫu tế bào ối.
+ Tách chiết DNA từ mẫu tế bào ối đã nuôi cấy.
+ Thực hiện kỹ thuật PCR với DNA thu được với primer của gene SOD1.
+ Tiến hành điện di sản phẩm PCR.
+ Phân tích kết quả.
4.1.Nguyên lý của phƣơng pháp tách chiết DNA từ tế bào ối :
Ở tế bào Eukaryota, phần ADN chủ yếu nằm trong nhân tế bào, trên các
NST, vì vậy trước hết cần bộc lộ ADN ra khỏi màng nhân, ra khỏi tế bào. Sau đây
là các bước chủ yếu của quy trình :
+ Bước 1 : giải phóng ADN ra khỏi màng tế bào bằng cách nghiền, dùng áp suất,
siêu