Luận văn Đánh giá đa dạng di truyền một số mẫu giống lúa thu thập tại lào về đặc điểm nông sinh học

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------------------- NGUYỄN THANH NHUNG ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU GIỐNG LÚA THU THẬP TẠI LÀO VỀ ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------------------- NGUYỄN THANH NHUNG ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU GIỐNG LÚA THU THẬP TẠI LÀO VỀ ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 604230 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ HÙNG LĨNH TS. ĐỖ THỊ PHÚC Hà Nội – 2014 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong luận văn này. Mọi kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao chép từ các nghiên cứu khác. Các số liệu, sơ đồ kết quả của luận văn này chưa từng được công bố. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên! Học viên Nguyễn Thanh Nhung ii LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Lê Hùng Lĩnh và TS. Đỗ Thị Phúc, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và chỉ bảo và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình công tác cũng như trong thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và cán bộ công tác tại Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, anh chị em trong Bộ môn Sinh học phân tử- Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình công tác và thực hiện luận văn. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè và người thân đã động viên, khuyến khích giúp tôi vượt qua những khó khăn trong suốt quá trình nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên Nguyễn Thanh Nhung iii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................. v DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. vi DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................vii MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ....................................................................................... 1 2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài ............................................................................. 2 2.1. Mục tiêu ........................................................................................................... 2 2.2. Yêu cầu ............................................................................................................ 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................. 3 3.1. Ý nghĩa khoa học .............................................................................................. 3 3.2. Ý nghĩa thực tiễn .............................................................................................. 3 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài ........................................................ 3 4.1. Đối tượng ......................................................................................................... 3 4.2. Phạm vi nghiên cứu .......................................................................................... 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI4 1.1. Giới thiệu chung về cây lúa ............................................................................. 4 1.1.1. Nguồn gốc, sự phân bố của cây lúa ............................................................... 4 1.1.2 . Phân loại lúa ................................................................................................. 5 1.2. Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa ................................................. 7 1.2.1. Vị trí và tầm quan trọng của đa dạng di truyền ............................................... 7 1.2.2. Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa ở nước ngoài ............................................. 8 1.2.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa ở Việt Nam và Lào .................................. 11 1.2.4. Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền ........................................... 13 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 22 2.1. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................... 22 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 24 2.2.1. Bố trí thí nghiệm .......................................................................................... 24 iv 2.2.2. Các tính trạng theo dõi và đánh giá .............................................................. 24 2.2.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền bằng chỉ thị ADN .......................................... 27 2.2.4. Phương pháp phân loại dưới loài.................................................................. 33 2.2.5. Phân tích và xử lý số liệu ............................................................................ 33 CHƯƠNG 3: KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 35 3.1. Kết quả đánh giá một số đặc tính nông học của các mẫu giống lúa Lào. ........ 35 3.1.1. Đa dạng các tính trạng hình thái số lượng .................................................... 35 3.1.2. Đa dạng các tính trạng hình thái chất lượng ................................................. 45 3.2. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền các mẫu giống lúa Lào bằng chỉ thị SSR 55 3.2.1. Tỷ lệ khuyết số liệu và dị hợp tử của các giống lúa nghiên cứu. ................... 55 3.2.2. Hệ số PIC, số alen thể hiện trên từng cặp mồi. ............................................. 57 3.2.3. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của các mẫu giống lúa Lào............ 60 3.3. Kết quả phân loại dưới loài các mẫu giống lúa Lào ......................................... 61 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................... 64 4.1. Kết luận .......................................................................................................... 64 4.2. Đề nghị .......................................................................................................... 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 65 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TĂT ADN Axit Deoxyribonucleic AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa dạng chiều dài đoạn nhân bản) BT7 Bắc Thơm 7 cs. Cộng sự CTAB Cetyltrimethyl Amonium Bromide D/R Tỷ lệ dài/rộng hạt thóc ĐC Đối chứng IRRI International Rice Research Institute (Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế) Kb Kilo base KL Khối lượng NSLT Năng suất lý thuyết PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PIC Polymorphism Information Content - Chỉ số thông tin đa hình của mồi RAPD Random Amplified Polymorphic DNA (ADN đa hình được nhân bội ngẫu nhiên) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa dạng chiều dài đoạn giới hạn) RGA Resistance Gene Analog – Vùng tương đồng gen kháng SNPs Single nucleotide polymorphism - Đa hình của các nucleotit đơn SSR Simple Sequence Repeats (Sự lặp lại trình tự đơn giản) STS Sequence Tagged Site - Điểm trình tự được đánh dấu TBE Tris-Boric Acid-EDTA TE Tris-EDTA TGST Thời gian sinh trưởng TT Thứ tự vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại chi Oryza ................................................................................. 6 Bảng 2.1. Danh sách các mẫu giống lúa Lào dùng trong nghiên cứu ..................... 22 Bảng 2.2. Danh sách các chỉ thị SSR dùng trong nghiên cứu ................................. 73 Bảng 23. Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR ........... 29 Bảng 2.4. Chương trình chạy của phản ứng PCR .................................................. 29 Bảng 3.1. Sự đa dạng các tính trạng hình thái số lượng của 33 mẫu giống lúa Lào vụ mùa 2012. .............................................................................................................. 35 Bảng 3.2. Các yếu tố cấu thành năng suất của 33 mẫu giống lúa thu thập tại Lào vụ mùa 2012 ............................................................................................................... 41 Bảng 3.3. Sự đa dạng kích thước hạt thóc của 33 mẫu giống lúa Lào ..................... 43 Bảng 3.4. Tần số biểu hiện các tính trạng hình thái chất lượng của thân ................ 46 Bảng 3.5. Tần số biểu hiện các tính trạng hình thái chất lượng của lá .................... 48 Bảng 3.6. Tần số biểu hiện các tính trạng hình thái chất lượng thìa lìa ................... 49 Bảng 3.7. Tần số biểu hiện các tính trạng hình thái chất lượng của bông ............... 50 Bảng 3.8. Tần số biểu hiện các tính trạng hình thái chất lượng hoa và hạt ............. 51 Bảng 3.9. Tỷ lệ khuyết số liệu và dị hợp tử của các giống lúa nghiên cứu .............. 55 Bảng 3.10. Chỉ tiêu số alen và chỉ số đa dạng di truyền PIC của các chỉ thị nghiên cứu ........................................................................................................................ 59 Bảng 3.11. Kết quả phân loại bằng dung dịch phenol của 33 mẫu giống lúa Lào và 2 giống đối chứng ..................................................................................................... 62 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Sơ đồ tiến hóa hai loài lúa trồng ............................................................... 5 Hình 2.1. Bản đồ những vùng thu thập mẫu giống lúa tại Lào ..................................... 22 Hình 3.1. Sự đa dạng chiều cao cây của 33 mẫu giống lúa Lào .............................. 37 Hình 3.2. Sự đa dạng khối lượng 1000 hạt của các mẫu giống lúa ......................... 40 Hình 3.3. Sự đa dạng các tính trạng hình thái về thân ............................................ 47 của các mẫu giống lúa nghiên cứu ......................................................................... 47 Hình 3.4. Đa dạng hình thái tính trạng chất lượng lá lúa của 33 mẫu giống lúa Lào47 Hình 3.5. Đa dạng tính trạng hình thái chất lượng thìa lìa của 33 mẫu giống lúa Lào50 Hình 3.6. Đa dạng hình thái chất lượng bông của 33 mẫu giống lúa Lào ............... 51 Hình 3.7: Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi RM110 .................................... 58 Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi RM18 ...................................... 58 Hình 3.9. Quan hệ di truyền của 33 giống lúa Lào và BT7 dựa trên 20 chỉ thị SSR 61 Hình 3.10. Phân loại dưới loài các mẫu giống lúa nghiên cứu ................................ 63 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Nguồn tài nguyên di truyền thực vật đóng vai trò rất quan trọng đối với sản xuất nông nghiệp theo hướng đa dạng hóa, hiện đại hóa. Do sự khác biệt điều kiện tự nhiên mà mỗi nước có nguồn tài nguyên thực vật khác nhau. Trong xu thế hội nhập quốc tế, sự hợp tác chia sẻ thông tin kinh nghiệm và trao đổi nguồn gen đã và sẽ góp phần khai thác có hiệu quả tiềm năng nguồn gen bản địa cũng như nhập nội hoặc lai tạo được nhiều các giống mới, thúc đẩy phát triển sản xuất nông nghiệp của mỗi nước. Hợp tác khu vực và quốc tế trong lĩnh vực sử dụng hiệu quả và bền vững nguồn tài nguyên thực vật là thực sự cần thiết để góp phần thực hiện mục tiêu an ninh lương thực mà Hội thảo kỹ thuật quốc tế về tài nguyên di truyền thực vật lần thứ IV đã đề ra, nhằm phấn đấu giảm lượng dân số đói nghèo xuống còn một nửa vào năm 2015. Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng. Hàng năm, các quốc gia Châu Á tiêu thụ tới 90% sản lượng lúa gạo của thế giới. Cộng hào Dân chủ Nhân dân Lào là nước có nhiều giống lúa cổ truyền với nguồn gen phong phú có thể dùng để tạo ra những giống lúa cải tiến với những đặc tính mong muốn. Theo điều tra, đánh giá sơ bộ về tập đoàn lúa địa phương của Lào cho thấy đây là nguồn vật liệu quý phong phú về các tính trạng chất lượng, chống chịu sâu bệnh cũng như các điều kiện bất thuận của môi trường như chịu úng, chịu ngập, chịu mặnBên cạnh công tác thu thập và bảo tồn, công tác nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen này có ý nghĩa rất quan trọng trong việc lưu giữ, bảo tồn nguồn gen lúa phục vụ công tác chọn giống. Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa vào các tính trạng hình thái, nông học là phương pháp cổ điển nhưng hiện nay vẫn được sử dụng rộng rãi vì nó không đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền, bố trí thí nghiệm phức tạp mà vẫn đảm bảo hiệu quả nhất định, giúp các nhà nghiên cứu có thể phân biệt các giống một cách nhanh chóng trên đồng ruộng [8]. 2 Ngày nay, với sự phát triển của Sinh học Phân tử, chỉ thị phân tử ADN được sử dụng rộng rãi trong việc đánh giá, bảo tồn và quản lý nguồn gen nói chung và công tác nghiên cứu đa dạng di truyền nói riêng. Các chỉ thị phân tử thường được sử dụng để nghiên cứu, xác định mối quan hệ di truyền của các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài là cơ sở cho việc phân loại dưới loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hóa giữa loài [26]. Trong số các chỉ thị phân tử đánh giá đa dạng di truyền, chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats) hay còn gọi là chỉ thị vi vệ tinh có độ tin cậy và chính xác cao thường được sử dụng trong các nghiên cứu sâu ở mức độ phân tử đối với tất cả các đối tượng động thực vật. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá đa dạng di truyền một số mẫu giống lúa thu thập tại Lào về đặc điểm nông sinh học ” 2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 2.1. Mục tiêu Nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại dưới loài để cung cấp thông tin về các mẫu giống thu thập nhằm phục vụ công tác chọn tạo giống, bảo tồn và khai thác sử dụng. 2.2. Yêu cầu - Đánh giá được một số đặc điểm nông sinh học, năng suất và yếu tố cấu thành năng suất của các mẫu giống lúa Lào nghiên cứu. - Xác định được mối tương quan di truyền giữa các mẫu giống lúa Lào nghiên cứu bằng chỉ thị SSR. - Phân loại dưới loài các mẫu giống nghiên cứu phục vụ cho quá trình chọn tạo giống. 3 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Đề tài kết hợp đánh giá các tính trạng hình thái nông học với chỉ thị phân tử để nghiên cứu đa dạng di truyền. Kết quả của đề tài góp phần tạo cơ sở khoa học để xây dựng phương pháp đánh giá đa dạng di truyền và phân loại các mẫu giống lúa Lào nói riêng và tài nguyên cây lúa nói chung. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của đề tài có ý nghĩa trong việc xây dựng cơ sở dữ liệu ở mức độ hình thái và phân tử phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng nguồn gen lúa của Lào. Những chỉ thị có hệ số đa dạng gen cao sẽ rất có ích cho các phân tích đa dạng di truyền, lập bản đồ liên kết và nghiên cứu mối quan hệ về nguồn gốc phát sinh của các giống lúa Từ các kết quả nghiên cứu giới thiệu một số giống lúa Lào có các tính trạng tốt về năng suất, hình thái có khả năng thích ứng trong điều kiện trồng tại Việt Nam. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4.1. Đối tượng 33 mẫu giống lúa thu thập tại các vùng sinh thái khác nhau của Cộng hòa Dân chủ Nhân dân Lào. 4.2. Phạm vi nghiên cứu Đề tài nghiên cứu này nằm trong đề tài: “Hợp tác nghiên cứu phát triển nguồn gen lúa bản địa với Cộng hòa Dân chủ Nhân dân Lào” thuộc chương trình Hợp tác theo Nghị định thư của Bộ Khoa học và Công nghệ thực hiện từ 2010 – 2012. 4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1.1. Giới thiệu chung về cây lúa 1.1.1. Nguồn gốc, sự phân bố của cây lúa Tổ tiên của cây lúa đã tồn tại từ đầu kỷ Phấn trắng. Vào giữa thế kỷ này, xuất hiện một loại nguyên thủy nhất thuộc tộc Oryzae, đó là loại Streptochasta Schard. Đến cuối kỷ Phấn trắng xuất hiện loài tre (Bambusta) và loài lúa Oryza. Một số loài khác xuất hiện muộn hơn vào kỷ thứ 3, thời kỳ phát triển mạnh nhất của họ hòa thảo (Gramineae). Các loài lúa Oryza spp có cùng tổ tiên chung vào thời kỳ địa cầu Gondwanaland, sau khi trái đất tách rời thành năm lục địa [7]. Tác giả Chang (1985) cho rằng lúa trồng Oryza sativa được tiến hóa từ cây lúa dại Oryza nivara. Do thích ứng với khí hậu, đặc biệt là điều kiện nhiệt độ lúa Oryza sativa lại tiếp tục chia thành ba nhóm: Indica thích hợp với khí hậu nhiệt đới, Japonica thích hợp với khí hậu lạnh, Javanica có đặc tính trung gian [29]. Cheng (2003) khi nghiên cứu di truyền tiến hóa của 101 giống lúa, bao gồm cả lúa trồng và lúa dại cho thấy loài lúa trồng Oryza sativa chia thành hai nhóm tương ứng với loài phụ là Indica và Japonica. Trong khi đó Oryza rufipogon chia thành bốn nhóm là Oryza rufipogon hàng niên và ba nhóm Oryza rufipogon đa niên. Kết quả cho thấy các giống lúa Japonica có quan hệ gần gũi với một nhóm Oryza rufipogon đa niên, còn các giống còn lại có quan hệ với nhóm lúa Oryza rufipogon hàng niên [33]. Nhiều chuyên gia lúa gạo đồng ý rằng lúa Glaberrima và lúa Sativa có cùng chung nguồn thủy tổ vào thời kỳ lục địa nguyên thủy, nhưng sau khi các lục địa tách rời nhau, lúa Sativa và Glaberrima tiến hóa từ các loài lúa dại bản địa ở hai châu lục là châu Á và châu Phi [44]. 5 Hình 1.1. Sơ đồ tiến hóa hai loài lúa trồng 1.1.2 . Phân loại lúa Cây lúa thuộc họ Poaceae, trước đây gọi là họ Hòa thảo (Gramineae), họ phụ Pryzoidea, tộc Oryzae, chi Oryza, loài Oryza sativa và Oryza glaberrima. Morinaga là người đầu tiên đã sử dụng kỹ thuật phân tích genome để định danh các loài lúa dại. Công trình nghiên cứu dựa trên cơ sở khoa học này đã giúp phân tích các loài lúa chính xác hơn [6]. Hội nghị di truyền lúa Quốc tế họp tại Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế năm 1963 chia chi Oryza thành 19 loài. Căn cứ trên các phát kiến mới về tế bào học và di truyền cây lúa, năm 1967 Hội nghị Di truyền lúa Quốc tế khẳng định chi Oryza có 22 loài trong đó có 22 loài lúa dại và hai loài lúa trồng [30]. Danh sách loài, số lượng nhiễm sắc thể, bộ gen của từng loài được trình bày ở bảng 1.1. Sau này Vaughan (1994) phát hiện thêm một loài lúa dại mới ở Papua New Ginea là loài Oryza rhizomatis, đưa số loài của chi Oryza lên thành 23 loài và chia thành 6 nhóm genome [65]. Tổ tiên chung Tây châu Phi O. longistamina Nam và Đông Nam Á O. rufipogon O. nivara O. breviligutala O. glaberrima O. sativa indica Lúa dại đa niên O. sativa japonica Lúa dại hàng niên 6 Ngày nay, các nhà phân loại học đều nhất trí là chi Oryza có 23 loài trong đó 21 loài hoang dại và hai loài lúa trồng là Oryza sativa và Oryza glaberrima thuộc loài nhị bội 2n = 24 có bộ gen AA. Loài Oryza glaberrima phân bố chủ yếu ở Tây và Trung Phi còn loài Oryza sativa được gieo trồng khắp thế giới và phân chia thành hai loài phụ là Japonica và Indica [6]. Bảng 1.1. Phân loại chi Oryza Phức hệ Tên khác NST Hệ gen I. Phức hệ O. sativa 1. O. sativa L 24 AA 2. O. nivara Shama et Shastry O. rufipogon 24 AA 3. O. rufipogon Griff O. perennis 24 AA 4. O. glaberrima Steud AA 5. O. barthii A.Chev O. breviligutala 24 AA 6. O. longistaminata Chev. Et O. barthii 24 AA 7. O. meridionalis AA II. Phức hệ O. officinalis Ng O. latifola 8. O. officinalis Wall ex Watt O .minuta 24 CC 9. O.minuta Presl et Presl 48 BBCC 10. O.rhizomatis Vaughan 24 CC 11. O. eichigeni Peter 24 CC 12. O. panctata Kotschy ex Steud 24, 48 BB, BBCC 13. O. latifolia Desv 48 CCDD 14. O. alta Swallen 48 CCDD 15.O. grandilumis Prod 48 CCDD 16. O. australiensis Domin 24 EE 17. O. brachyantha Chev.et Roehr 24 FF 18. O.schlechteri Pilger 48 Chưa rõ III. Phức hệ O.ridleyi 19. O.ridleyi Hook.f 48 Chưa rõ 20. O.longilumis Jansen 48 Chư