Luận văn Hoàn thiện kỹ thuật trung hòa vi lượng (Miconeutralization) trong nghiên cứu huyết thanh dịch tễ học trên người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------------- Nguyễn Hoà Bình HOÀN THIỆN KỸ THUẬT TRUNG HOÀ VI LƯỢNG (MICRONEUTRALIZATION) TRONG NGHIÊN CỨU HUYẾT THANH DỊCH TỄ HỌC TRÊN NGƯỜI TIẾP XÚC VỚI VIRUS CÚM GIA CẦM H5N1 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2007 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------- Nguyễn Hoà Bình HOÀN THIỆN KỸ THUẬT TRUNG HOÀ VI LƯỢNG (MICRONEUTRALIZATION) TRONG NGHIÊN CỨU HUYẾT THANH DỊCH TỄ HỌC TRÊN NGƯỜI TIẾP XÚC VỚI VIRUS CÚM GIA CẦM H5N1 Chuyên ngành: Hoá sinh học Mã số: 1.05.10 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. Nguyễn Vân Trang Hà Nội - 2007 LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình Lời cảm ơn Trong suốt thời gian thực hiện luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình, chu đáo của các thầy cô giáo và các cán bộ khoa học công tác tại Phòng Hoá sinh, Khoa Miễn dịch và Sinh học Phân tử, Viện Vệ sinh Dịch tễ TW và Bộ môn Hoá sinh học - Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, ĐHQGHN. Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Vân Trang, phụ trách phòng Hoá sinh, Khoa Miễn dịch và Sinh học Phân tử, Viện Vệ sinh Dịch tễ TW người đã trực tiếp hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu vừa qua. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Nguyễn Văn Mùi và PGS. TS. Vũ Tân Trào – những người đã có định hướng quan trọng và đưa ra những lời khuyên bổ ích trong quá trình nghiên cứu. Đồng thời, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới lãnh đạo khoa, các anh chị cùng các bạn đã và đang công tác tại Khoa Miễn dịch và Sinh học Phân tử, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã giúp đỡ tôi trong việc thu thập mẫu ngoài thực địa và luôn nhiệt tình chỉ bảo cho tôi những kinh nghiệm thực tiễn quý báu trong công tác nghiên cứu khoa học. Đặc biệt, tôi xin cảm ơn chị Đỗ Quỳnh Nga đã giúp đỡ tôi về mặt kĩ thuật trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo trong Bộ môn Hoá sinh học và Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên. Thầy, các cô là những người mang đến cho tôi niềm đam mê khoa học và truyền đạt cho tôi những kiến thức cơ bản, bổ ích. Tôi cũng xin cảm ơn sự PGS. TS. Đinh Duy Kháng (Viện Công nghệ Sinh học), TS. Nguyễn Tiến Dũng (Viện Thú y Quốc gia), TS. Carl Mason (AFRIMS) và TS. Roland Levandowski (NIH) đã cung cấp virus và những hướng dẫn kĩ thuật cần thiết. Cảm ơn các tổ chức SIDA, AFRIMS và NIH đã cấp kinh phí và hoá chất cho nghiên cứu. Cảm ơn phòng Công nghệ cao - Công ty vacxin & Sinh phẩm số 1 đã cho phép chụp ảnh các thí nghiệm. Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo cùng các đồng nghiệp tại công ty Tư vấn và Đại diện Sở hữu Trí tuệ Trường Xuân, đã tạo điều kiện tốt nhất về mặt thời gian và công việc, cùng hỗ trợ về kinh phí để tôi hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình tôi, những người thân yêu đã luôn bên tôi, tin tưởng và cổ vũ cho tôi trong suốt thời gian qua. Hà Nội, ngày 28 tháng 11 năm 2007 Học viên: Nguyễn Hoà Bình LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AA : Axit amin BSA : Albumin huyết thanh bò CPE : Hiệu ứng huỷ hoại tế bào CTL : Tế bào Lympho độc DMEM : Môi trường Dulbecco’s Modified Eagles EID50 : Liều gây nhiễm 50% số trứng FBS : Huyết thanh bào thai bê HA : Hemagglutinin Assay HEPES : Acid 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic HI : Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu IL : Interleukin KN : Kháng nguyên KT : Kháng thể MDCK : Tế bào thận chó (Madin-Darby Canine Kidney) MN : Trung hoà vi lượng (Microneutralization) MOI : Số virus xâm nhiễm NA : Neuraminidase Assay NP : Nucleocapsid OPD : o-phenylenediamine-dihydrochloride RT-PCR : Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction TCID50 : Liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy TPCK : L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone WB : Western Blot WHO : Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization) LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU ...............................................................................................................1 Chương 1: TỔNG QUAN ..........................................................................................2 1.1 Dịch bệnh cúm gia cầm H5N1 .............................................................2 1.1.1 Dịch cúm gia cầm H5N1 trên thế giới ...............................................2 1.1.2 Dịch cúm gia cầm H5N1 tại Việt Nam ..............................................5 1.1.3 Sự lây truyền virus cúm gia cầm H5N1 .............................................6 1.2 Virus cúm A .........................................................................................9 1.2.1 Phân loại .............................................................................................9 1.2.2 Danh pháp ........................................................................................10 1.2.3 Đặc điểm cấu tạo virus cúm .............................................................10 1.2.4. Các subtype hiện nay của virus cúm ...............................................14 1.2.5. Sự xâm nhập và sao chép của virus cúm trong tế bào chủ .............14 1.2.6. Cơ chế hình thành chủng mới .........................................................16 1.2.7. Bệnh học nhiễm virus H5N1 ở người .............................................18 1.2.8. Các biện pháp phòng ngừa và điều trị nhiễm virus H5N1 ..............18 1.3 Đáp ứng miễn dịch chống virus cúm ..................................................19 1.3.1. Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu ................................................20 1.3.2. Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ...........................................................21 1.3.3. Tác dụng bảo vệ chéo .....................................................................23 1.4 Các phương pháp chẩn đoán virus .....................................................24 1.4.1. Phương pháp chẩn đoán trực tiếp ....................................................24 1.4.2. Phương pháp chẩn đoán gián tiếp ...................................................26 1.4.3. Phương pháp huyết thanh học .........................................................27 1.5 Kĩ thuật trung hòa vi lượng (MN) ......................................................29 1.5.1. Cơ sở của kĩ thuật ...........................................................................29 1.5.2. Ứng dụng kĩ thuật trong chẩn đoán virus .......................................29 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .........................................................31 2.1. Mẫu huyết thanh .................................................................................31 2.2. Vật liệu ...............................................................................................32 2.2.1. Dòng tế bào .....................................................................................32 2.2.2. Chủng virus .....................................................................................32 2.2.3. Kháng nguyên và kháng thể ............................................................32 2.2.4. Môi trường và hoá chất ...................................................................32 2.2.5. Trang thiết bị ...................................................................................33 2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................34 LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 2.3.1. Thu nhận, xử lý và bảo quản mẫu huyết thanh ...............................34 2.3.2. Chuẩn độ kháng thể ........................................................................34 2.3.3. Chuẩn bị tế bào MDCK ..................................................................35 2.3.4. Chuẩn bị virus dùng cho phản ứng .................................................36 2.3.5. Xác định liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy (TCID50) ..............37 2.3.6. Phản ứng trung hoà virus ................................................................38 2.3.7. Phản ứng ELISA .............................................................................40 2.4. Xử lý số liệu .......................................................................................41 2.4.1. Kết quả phản ứng trung hòa virus ...................................................41 2.4.2. Đọc kết quả .....................................................................................41 2.4.3. Xử lý thông tin về người tiếp xúc ...................................................42 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...............................................................43 3.1. Kết quả chuẩn độ kháng thể dùng cho phản ứng ELISA ...................43 3.1.1. Nồng độ protein của virus cúm gia cầm .........................................43 3.1.2. Chuẩn độ kháng thể dùng cho phản ứng ELISA ............................44 3.2. Chuẩn bị virus dùng cho phản ứng MN .............................................46 3.2.1. Xác định nồng độ trypsin sử dụng trong gây nhiễm virus ..............46 3.2.2. Xác định MOI của virus sử dụng trong gây nhiễm .........................49 3.2.3. Xác định TCID50 của virus P2 dùng cho phản ứng MN ................50 3.3. Chuẩn bị tế bào MDCK, thời gian và điều kiện gây nhiễm ...............51 3.3.1. Xác định mật độ tế bào MDCK thích hợp ......................................51 3.3.2. Xác định thời gian gây nhiễm virus vào tế bào ..............................54 3.4. Đánh giá kết quả thu được của phản ứng MN ....................................54 3.4.1. So sánh kết quả phản ứng MN ở điều kiện có và không có mặt của trypsin-TPCK ...........................................................................................................54 3.4.2. Đánh giá độ ổn định của phản ứng MN ..........................................56 3.4.3. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng MN .........................................58 3.4.4. Đánh giá độ nhạy của phản ứng MN ...............................................58 3.5. Ứng dụng kĩ thuật MN trong điều tra huyết thanh học ......................60 KẾT LUẬN .............................................................................................................64 KIẾN NGHỊ .............................................................................................................66 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................67 LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 1 MỞ ĐẦU Virus cúm type A được phân thành 16 phân nhóm dựa trên tính kháng nguyên (KN) của protein Hemagglutinin (HA) và 9 phân nhóm dựa trên tính KN của protein Neuraminidase (NA). Virus cúm đã được phân lập từ nhiều loài động vật như chim, hoang dã, thuỷ cầm, gia cầm, lợn, ngựa và người. Việc thay đổi nhanh chóng về tính KN của virus đã gây khó khăn lớn trong phòng ngừa, điều trị bệnh cúm, đặc biệt là trong sản xuất vaccine cúm. Lịch sử đã ghi nhận những vụ dịch do virus cúm A gây ra với thiệt hại nghiêm trọng, điển hình là đại dịch do cúm H1N1 năm 1918 gây tử vong cho 40-60 triệu người và đại dịch cúm H2N2 năm 1957 đã cướp đi sinh mạng gần 2 triệu người. Từ năm 1997 tới nay, nhiều vụ dịch do virus cúm gia cầm H5N1 đã liên tiếp bùng phát trên diện rộng tại nhiều quốc gia, các châu lục trên thế giới gây thiệt hại nặng nề về người và kinh tế. Virus cúm gia cầm H5N1 đã gây bệnh cho người với tỉ lệ tử vong lên tới 50%. Năm 2007, toàn thế giới đã có 71 ca nhiễm virus H5N1, trong đó có 47 ca tử vong. Trong đó, Việt Nam là quốc gia đứng thứ hai sau In-đô- nê-xia về số người nhiễm và tử vong do virus H5N1. Đứng trước tình hình đó, Việt Nam cần phải luôn chủ động ứng phó kịp thời với những diễn biến dịch. Bên cạnh việc phát hiện, khoanh vùng dịch bệnh sớm và chính xác để kiểm soát dịch, chúng ta cần phải có những nghiên cứu, điều tra dịch tễ học một cách toàn diện nhằm xác định khả năng miễn dịch của người đối với virus. Để thực hiện điều này, chúng ta cần có các kĩ thuật chẩn đoán đặc hiệu và có độ tin cậy cao giúp xác định sự có mặt của kháng thể (KT) kháng virus H5N1 trong huyết thanh người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1. Đáp ứng yêu cầu này, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Hoàn thiện kĩ thuật trung hòa vi lượng (Microneutralization) trong nghiên cứu huyết thanh dịch tễ học trên người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1”. Kĩ thuật được xây dựng, tối ưu hoá và bước đầu áp dụng để xác định KT kháng virus H5N1 trong mẫu huyết thanh thu thập tại các tỉnh Hà Tây, Hải Dương và Thái Bình trong các năm 2006-2007. LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 2 Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Dịch bệnh cúm gia cầm H5N1 1.1.1 Dịch cúm gia cầm H5N1 trên thế giới Trước khi phân lập được trên người, năm 1996, virus cúm gia cầm H5N1 có khả năng gây bệnh cao (HPAI) đã được phân lập từ ngỗng nuôi ở tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc[66]. Năm 1997, virus cúm gia cầm H5N1 là nguyên nhân gây bùng phát dịch tại các trang trại nuôi gà và các khu vực chợ buôn bán gia cầm sống ở Hồng Kông, đợt dịch này cũng ghi nhận trường hợp nhiễm virus cúm gia cầm H5N1 đầu tiên ở người, sau đó có thêm 18 người được xác định bị nhiễm virus H5N1, 6 người đã tử vong[66]. Vụ dịch này cũng dẫn đến việc phải tiêu huỷ 1,5 triệu gia cầm tại Hồng Kông, nhờ đó đã ngăn chặn được dịch bùng phát[57]. Từ năm 1997 tới cuối năm 2002, thế giới không có vụ dịch do virus H5N1 nào bùng phát. Đầu năm 2003, virus H5N1 với khả năng gây bệnh cao nêu trên đã xuất hiện trở lại ở cả gia cầm nuôi nhốt và chim hoang dã tại Trung Quốc và lần đầu tiên virus cúm gia cầm H5N1 đã xuất hiện tại Hàn Quốc[66]. Hồng Kông đã có hai trường hợp được khẳng định là nhiễm virus gia cầm H5N1 trên người, trong đó có một người tử vong[66]. Năm 2004, dịch đã bùng phát trên diện rộng, gây thiệt hại lớn tại các nước Đông Nam Á bao gồm Cam-pu-chia, In-đô-nê-xia, Lào, Thái Lan và Việt Nam. Trong năm này, Nhật Bản cũng đã ghi nhận trường hợp nhiễm virus cúm H5N1 đầu tiên trên gia cầm. Nhiều ca nhiễm virus cúm H5N1 ở người dẫn tới tử vong đã được ghi nhận tại Việt Nam và Thái Lan[66]. Năm 2004, trường hợp nhiễm virus cúm gia cầm H5N1 đầu tiên ở thú lớn thuộc họ mèo là hai con hổ và hai con báo đã được ghi nhận tại Thái Lan[66]. Kuiken cùng các cộng sự đã chứng minh được rằng mèo nhà cũng bị nhiễm virus H5N1 và có khả năng lây truyền từ mèo sang mèo[23]. Cùng thời gian này, 147 con hổ trong số 441 con hổ nuôi nhốt tại một vườn thú ở Thái Lan đã chết do ăn xác gia cầm sống. Các nghiên cứu đã khẳng định được rằng vịt nuôi có thể là vật chủ chứa virus khi chúng thải ra một lượng lớn virus có khả năng lây nhiễm cao song hoàn toàn không có các biểu hiện nhiễm bệnh[66]. Tuy nhiên, chủng virus H5N1 hiện tại đã thu nhận thêm kiểu hình khác và có khả năng gây chết cho vịt[19]. LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 3 Năm 2005, lần đầu tiên virus H5N1 gây chết 6.345 con chim thuộc nhiều loài chim hoang dã khác nhau tại hồ Qinghai, Trung Quốc, ảnh hưởng lớn tới số lượng chim hoang dã ở đây. Đợt dịch này làm giảm khoảng 10% tổng số ngỗng đầu khoang (Anser indicus) toàn cầu, đồng thời cảnh báo nguy cơ ảnh hưởng nghiêm trọng tới các loài động vật hoang dã[66]. Đến thời điểm năm 2005, virus cúm H5N1 đã xuất hiện ở cả người và gia cầm tại nhiều nước châu Á, châu Âu và Trung Đông. Năm 2006, dịch cúm gia cầm do virus H5N1 đã di dịch sang phía Tây, tiếp tục gây bùng phát dịch ở nhiều quốc gia, đặc biệt là các quốc gia ở châu Âu (Thổ Nhĩ Kỳ, Italia, Anh, Pháp, Đức). Đồng thời, các trường hợp người chết do nhiễm virus cúm H5N1 liên tục được ghi nhận tại Indonesia. Lần đầu tiên virus H5N1 đã xuất hiện trên gia cầm tại Mỹ và các nước châu Phi (Nigeria, Sudan, Bờ Biển Ngà …)[66]. Tính tới tháng 12 năm 2007, số ca nhiễm virus cúm H5N1 ở người liên tục được ghi nhận, nhiều nhất là tại Indonesia và Ai Cập. Dịch cúm trên gia cầm vẫn xảy ra rải rác ở nhiều nơi[66]. Các khu vực trên thế giới đã được khẳng định là có mặt của virus cúm H5N1 được thể hiện trên hình 1.1. Như vậy, kể từ khi xuất hiện tại Hồng Kông năm 1997 tới nay, chủng virus cúm H5N1 đã lan tràn, gây dịch bệnh cho gia cầm và chim hoang dã ở 60 quốc gia (hình 1.1), hơn 200 triệu gia cầm bị chết và tiêu hủy. Các loài động vật đã bị nhiễm virus H5N1 bao gồm gà, ngỗng, các loài chim hoang dã, mèo, hổ và báo. Thiệt hại về kinh tế ước tính hơn 10 tỉ đô la[3, 30, 66]. Đáng lo ngại là sức khoẻ và tính mạng của con người bị đe dọa nghiêm trọng. Bảng 1.1 cho thấy, tính đến năm 2005, Việt Nam là quốc gia có số người tử vong do virus H5N1 cao nhất (42 người), tuy nhiên, đến tháng 12 năm 2007 thì quốc gia có số người tử vong do virus H5N1 nhiều nhất là In-đô-nê-xia (91 người). Thế giới đã có 337 ca được khẳng định là nhiễm virus H5N1 với 207 trường hợp tử vong tại 11 quốc gia (hình 1.2), tỉ lệ tử vong do nhiễm virus cúm H5N1 lên tới hơn 61%. LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 4 Hình 1.1. Bản đồ lưu hành virus cúm A H5N1 trên gia cầm và chim hoang dã. Màu da cam: các vùng có dịch cúm H5N1 trên gia cầm, màu gạch: nơi phát hiện thấy virus cúm A H5N1 trên chim hoang dã (Tổ chức Y tế thế giới, 27/09/2007) website: www.who.int Hình 1.2. Bản đồ phân bố các ca bệnh nhiễm virus cúm gia cầm H5N1 tính từ năm 2003 (Tổ chức Y tế thế giới, 30/11/2007), website: www.who.int Các khu vực được khẳng định có bệnh nhân nhiễm Khu vực bùng phát dịch trên gia cầm Khu vực bùng phát dịch ở chim hoang dã LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 5 Bảng 1.1. Số người nhiễm và tử vong do virus H5N1 trên thế giới tới tháng 11 năm 2007 Quốc gia 2003 2004 2005 2006 2007 Tổng Nhiễm Tử vong Nhiễm Tử vong Nhiễm Tử vong Nhiễm Tử vong Nhiễm Tử vong Nhiễm Tử vong Nigeria 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 Irắc 0 0 0 0 0 0 3 2 0 0 3 2 Lào 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 2 2 Thổ Nhĩ Kỳ 0 0 0 0 0 0 12 4 0 0 12 4 Azerbaizan 0 0 0 0 0 0 8 5 0 0 8 5 Campuchia 0 0 0 0 4 4 2 2 1 1 7 7 Ai Cập 0 0 0 0 0 0 18 10 20 5 38 15 Trung Quốc 1 1 0 0 8 5 13 8 3 2 27 17 Thái Lan 0 0 17 12 5 2 3 3 0 0 25 17 Việt Nam 3 3 29 20 61 19 0 0 7 4 100 46 Indonesia 0 0 0 0 20 13 55 45 37 32 113 91 Tổng 4 4 46 32 98 43 115 79 70 46 337 207 Ghi chú: Số ca mắc bệnh bao gồm cả các ca tử vong. Tổ chức Y tế Thế giới chỉ ghi nhận những ca được xác nhận bằng xét nghiệm và được báo cáo chính thức. (Tổ chức Y tế thế giới, 28/11/2007), website: www.who.int 1.1.2 Dịch cúm gia cầm H5N1 tại Việt Nam Theo ghi nhận của WHO, dịch cúm gia cầm H5N1 bùng phát lần đầu tiên tại Việt Nam vào tháng 1 năm 2004[66]. Tính đến tháng 11 năm 2007, đã có 61/64 tỉnh bùng phát dịch trên gia cầm, tổng số 50 triệu gia cầm các loại đã bị chết hoặc phải tiêu huỷ. Cả nước đã có 30/64 tỉnh phát hiện bệnh nhân nhiễm virus cúm H5N1 (hình 1.3) với tổng số người bị nhiễm lên tới 100 trường hợp, trong số đó có 46 trường hợp đã tử vong[7]. LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 6 Hình 1.3. Bản đồ các tỉnh có trường hợp nhiễm cúm A H5N1 tại Việt Nam tính tới 28/11/2007. Màu vàng là các tỉnh đã bùng phát dịch trên gia cầm. Màu đỏ là các tỉnh có số người tử vong do virus H5N1 (Số ca mắc bệnh bao gồm cả các ca tử vong được xác nhận bằng xét nghiệm và được báo cáo chính thức). (*): Số trường hợp nhiễm virus H5N1/số trường hợp tử vong. Bắc Ninh(2/1) tức là tỉnh Bắc Ninh có hai người được xác định là nhiễm virus H5N1, trong đó 1 người đã tử vong. 1.1.3 Sự lây truyền virus cúm gia cầm H5N1 Sự lây truyền virus ở gia cầm: trong tự nhiên, tất cả các subtype của virus cúm A đã được tìm thấy ở các loài chim hoang dã, cụ thể là các loài chim nước như vịt, ngỗng, nhạn biển, hải âu và mòng biển, từ đó cung cấp các gen cho virus cúm nhiễm vào gia cầm được chăn nuôi, động vật có vú và cả con người[61]. Virus được