Luận văn Khảo sát một số đặc tính azospirillum sp. và ảnh hưởng của chúng trên vài dạng cây trồng ngắn ngày

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THANH ĐÀO KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH AZOSPIRILLUM SP. VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA CHÚNG TRÊN VÀI DẠNG CÂY TRỒNG NGẮN NGÀY LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC TP. HỒ CHÍ MINH – 2005 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến : TS. Trịnh Thị Hồng, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này. Quý thầy cô Khoa Sinh nói chung và Bộ môn Vi sinh nói riêng của Trường Đại học Sư phạm Tp. Hồ Chí Minh đã cung cấp cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt khóa học và giúp đỡ nhiệt tình trong suốt quá trình tôi thực hiện luận văn. Quý thầy cô và các bạn trong Bộ môn Vi sinh, Sinh lý Thực vật, Sinh hóa, Sinh học Phân tử Trường Đại học Khoa học tự nhiên và Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam đã hỗ trợ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực nghiệm. Gia đình ông Võ Văn Giúp và ông Nguyễn Ngọc Yên đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi thực hiện các thí nghiệm thực tiễn. Sở Giáo dục và Đào tạo tỉnh An Giang, Ban Giám hiệu Trường Trung học Phổ thông Nguyễn Khuyến đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt khóa học. Và thật hạnh phúc biết bao khi trong cuộc sống, trong lao động và học tập luôn có sự chăm sóc, động viên, giúp đỡ của người thân, bạn bè. Tôi luôn biết ơn vì những tấm chân tình đó và gửi lời cảm ơn chân thành đến những người thân yêu của tôi – gia đình và bạn bè trong suốt thời gian qua. Nguyễn Thanh Đào MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các ký hiệu, các chữ viếr tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình Danh mục các đồ thị MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................................................. 3 1.1 Vai trò của đạm và tầm quan trọng của quá trình cố định đạm ............ 4 1.1.1 Đạm trong cây và vai trò của đạm đối với đời sống của cây trồng ............................................................................................... 4 1.1.1.1 Tỷ lệ đạm và các dạng đạm trong cây.............................. 4 1.1.1.2 Vai trò của đạm đối với đời sống cây trồng ..................... 4 1.1.2 Tầm quan trọng của quá trình cố định đạm .................................. 7 1.1.2.1 Cố định đạm hóa học ......................................................... 7 1.1.2.2 Cố định đạm sinh học......................................................... 9 1.2 Vi sinh vật cố định đạm và cơ chế của quá trình cố định đạm sinh học ........................................................................................................... 10 1.2.1 Các loài vi sinh vật cố định đạm ................................................... 10 1.2.1.1 Vi khuẩn cố định nitơ sống tự do....................................... 10 1.2.1.2 Vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh ........................................ 10 1.2.1.3 Vi khuẩn cố định nitơ sống trên rễ hay trong rễ một số loài cỏ nhiệt đới............................................................ 11 1.2.1.4 Đạm do vi sinh vật cố định được ....................................... 11 1.2.2 Cơ chế của quá trình cố định đạm ................................................. 11 1.3 Vi khuẩn Azospirillum ............................................................................. 14 1.3.1 Đặc tính hình thái ........................................................................... 14 1.3.2 Sự phân bố của Azospirillum trong đất.......................................... 17 1.3.3 Ảnh hưởng của Azospirillum đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật ................................................................................... 18 1.3.3.1 Ảnh hưởng nhiễm khuẩn đến sự phát triển bộ rễ ............. 18 1.3.3.2 Sự hình thành khuẩn lạc Azospirillum ở rễ ....................... 19 1.3.4 Các cơ chế hoạt động của Azospirillum giúp tăng trưởng thực vật ................................................................................................... 21 1.3.4.1 Sự cố định nitơ không khí của Azospirillum...................... 21 1.3.4.2 Ảnh hưởng của hormon ngoại tiết Azospirillum lên sinh trưởng và phát triển ở thực vật.................................. 22 1.3.4.3 Azospirillum kích thích sự hấp thu các chất dinh dưỡng khoáng của thực vật .......................................................... 23 1.3.4.4 Quan hệ giữa nitratreductase của cây chủ và vi khuẩn Azospirillum ....................................................................... 24 1.4 Phân vi sinh vật ........................................................................................ 24 1.4.1 Định nghĩa .................................................................................... 24 1.4.2 Phân loại ...................................................................................... 25 1.4.3 Mục tiêu của việc sử dụng phân vi sinh vật ............................... 26 1.4.4 Quy trình chung để sản xuất phân vi sinh vật từ vi khuẩn ........ 26 1.4.5 Phân vi sinh từ Azospirillum ......................................................... 30 Chương 2 - VẬT LIỆU-NỘI DUNG-PHƯƠNG PHÁP ................................. 34 2.1 Vật liệu ..................................................................................................... 35 2.1.1 Thiết bị và dụng cụ......................................................................... 35 2.1.2 Hóa chất và môi trường.................................................................. 35 2.1.3 Vật liệu thí nghiệm......................................................................... 39 2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu ................................................... 40 2.2.1 Phân lập .......................................................................................... 40 2.2.2 Tuyển chọn chủng Azospirillum có khả năng cố định đạm và sinh IAA tốt .................................................................................... 41 2.2.3 Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng được chọn ....................................................................................... 43 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn .......................... 46 2.2.4.1 Chuẩn bị ............................................................................. 46 2.2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn trên cây mạ trong ống nghiệm, cây lúa trong chậu và cây lúa ngoài ruộng.................................................................. 47 2.2.5 Tạo chế phẩm “phân vi sinh” ....................................................... 52 2.2.5.1 Chuẩn bị ............................................................................. 52 2.2.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm “phân vi sinh” trên cây lúa trong chậu và rau cải ngắn ngày ......................... 54 Chương 3 – KẾT QUẢ-THẢO LUẬN ............................................................ 57 3.1 Phân lập ................................................................................................... 58 3.2 Tuyển chọn chủng Azospirillum có khả năng cố định đạm và sinh IAA tốt ..................................................................................................... 61 3.2.1 Khả năng cố định đạm của 5 chủng A1 , A2 , A3 , A4 và A5 ......... 61 3.2.2 Khả năng sinh IAA của 5 chủng A1 , A2 , A3 , A4 và A5 ............... 62 3.3 Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng A2 và A3.............................................................................................................. 65 3.3.1 Đặc điểm hình thái ......................................................................... 65 3.3.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa............................................................ 66 3.4 Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn..................................... 69 3.4.1 Thời gian thích hợp nhiễm dịch nuôi cấy vi khuẩn đạt hiệu quả ................................................................................................. 69 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn trên cây mạ trong ống nghiệm, cây lúa trong chậu và cây lúa ngoài ruộng.... 71 3.4.2.1. Cây mạ trong ống nghiệm ............................................... 71 3.4.2.2. Cây lúa trong chậu .......................................................... 76 3.4.2.3. Cây lúa ngoài ruộng ......................................................... 78 3.5 Tạo chế phẩm “phân vi sinh”.................................................................. 88 3.5.1 Chuẩn bị ........................................................................................ 88 3.5.1.1. Dịch nuôi cấy vi khuẩn .................................................88 3.5.1.2. Chế phẩm “phân vi sinh” .................................................. 95 3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm “phân vi sinh” trên cây lúa trong chậu và rau cải ngắn ngày ............................................. 97 3.5.2.1 Lúa trong chậu.................................................................... 97 3.5.2.2 Cải thìa................................................................................ 99 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ......................................................................... 106 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Đặc điểm khuẩn lạc của 5 chủng trên môi trường NFb rắn có bổ sung congo đỏ sau 5 ngày nuôi cấy ............................................. 60 Bảng 3.2. Hàm lượng đạm của 5 chủng trong môi trường Dobereiner dịch thể 61 Bảng 3.3. Hàm lượng IAA trong dịch nuôi cấy (μg/ ml) theo thời gian ........... 64 Bảng 3.4. Chiều cao trung bình cây lúa (mm) sau 7 ngày theo thời gian ngâm hạt................................................................................................ 70 Bảng 3.5. Giá trị trung bình các lượng giá cây mạ sau 7 ngày cấy trong ống nghiệm của chủng A2 ...................................................................................................73 Bảng 3.6. Giá trị trung bình các lượng giá cây mạ sau 7 ngày cấy trong ống nghiệm của chủng A3 ...................................................................................................74 Bảng 3.7. Giá trị trung bình các lượng giá cây lúa trong chậu .......................... 77 Bảng 3.8. Chiều cao trung bình cây lúa ngoài ruộng (cm) của chủng A2 .......... 80 Bảng 3.9. Chiều cao trung bình cây lúa ngoài ruộng (cm) của chủng A3.81 Bảng 3.10. Số nhánh trung bình của cây lúa ngoài ruộng (nhánh/cây) vào thời điểm 45 ngày của chủng A2 và A3 ...........................................83 Bảng 3.11. Ảnh hưởng A2 trên chỉ tiêu cây lúa vào thời điểm thu hoạch ........ 85 Bảng 3.12. Ảnh hưởng A3 trên chỉ tiêu cây lúa vào thời điểm thu hoạch ........ 86 Bảng 3.13. Sự thay đổi mật độ tế bào của chủng A2 theo thời gian ................. 88 Bảng 3.14. Sự thay đổi mật độ tế bào của chủng A3 theo thời gian ................. 89 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của A2 và A3 dựa vào giá trị OD610nm .............................................................................. 91 Bảng 3.16. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của A2 và A3 dựa vào giá trị OD610nm 93 Bảng 3.17. Mật độ tế bào A2 và A3 trong 1 gram chế phẩm theo thời gian với sự thay đổi độ ẩm 95 Bảng 3.18. Ảnh hưởng của NH3 lên sự gia tăng số lượng tế bào ....................... 96 Bảng 3.19. Sự biến đổi mật độ tế bào A2 và A3 theo thời gian 96 Bảng 3.20. Giá trị trung bình các lượng giá cây lúa trong chậu .........................98 Bảng 3.21. Số lá trung bình của cây cải thìa (lá/cây) ....................................... 100 Bảng 3.22. Chiều cao trung bình của cây cải thìa (cm/cây) 102 Bảng 3.23. Giá trị trung bình các lượng giá cây cải thìa vào thời điểm thu hoạch ................................................................................................104 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 3.1. Phân lập Azospirillum từ đất vùng rễ lúa ........................................... 58 Hình 3.2. Hình dạng khuẩn lạc của các chủng sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường NFb rắn có bổ sung congo đỏ ........................................... 59 Hình 3.3. Định tính IAA của các chủng thông qua thuốc thử Salkowski ......... 62 Hình 3.4. Phản ứng màu IAA với thuốc thử Salkowski của các chủng nuôi cấy 5 ngày ................................................................................... 65 Hình 3.5. Khả năng sử dụng nguồn carbon trên môi trường dịch thể - NFb của chủng A2 và A3 ...................................................................... 67 Hình 3.6. Khả năng sử dụng nguồn carbon trên môi trường dịch thể Andrade của chủng A2 và A3 ............................................................... 68 Hình 3.7. Ảnh hưởng của sự nhiễm khuẩn (cây mạ 7 ngày tuổi trên môi trường MS) ........................................................................................... 72 Hình 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của A2 và A3 dựa vào chỉ thị màu bromothymol blue ...................................................... 92 Hình 3.9. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của A2 và A3 dựa vào chỉ thị màu bromothymol blue 94 DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Trang Đồ thị 3.1. Đường tương quan tuyến tính giữa hàm lượng IAA chuẩn và OD530nm ............................................................................................... 63 Đồ thị 3.2. Hàm lượng IAA trong dịch nuôi cấy (μg/ml) theo thời gian ........... 64 Đồ thị 3.3. Hiệu quả của thời gian ngâm hạt mầm thông qua chiều cao cây (mm) sau 7 ngày trồng lúa trong ống nghiệm............................. 71 Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng của sự nhiễm khuẩn trên chiều cao cây lúa ngoài ruộng (cm/cây) của chủng A2 và A3....79 Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của sự nhiễm khuẩn đến khả năng phân nhánh của cây lúa ngoài ruộng (nhánh/cây) vào thời điểm 45 ngày của chủng A2 và A3.. .......................................................................... 82 Đồ thị 3.6. Sự thay đổi mật độ tế bào của chủng A2 theo thời gian ................. 89 Đồ thị 3.7. Sự thay đổi mật độ tế bào của chủng A3 theo thời gian ................. 90 Đồ thị 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của A2 và A3 dựa vào giá trị OD610nm .............................................................................. 91 Đồ thị 3.9. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của A2 và A3 dựa vào giá trị OD610nm .. ............ 93 Đồ thị 3.10. Ảnh hưởng của chế phẩm “phân vi sinh” đến số lượng lá cải thìa .................................................................................................... 101 Đồ thị 3.11. Ảnh hưởng của chế phẩm “phân vi sinh” trên chiều cao cây cải thìa (cm/cây) ............................................................................... 103 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT A2 : Chủng Azospirillum 2 A3 : Chủng Azospirillum 3 CFU (colony forming unit) : Mật độ tế bào CP : Chế phẩm CV% (Coefficient of Variation) : hệ số đo lường chính xác của thí nghiệm ĐC : Đối chứng IAA : Indole-3-acetic acid LSD (Least significant difference test) trắc nghiệm phân hạng các lô thí nghiệm MT1 : Môi trường vô đạm NFb MT2 : Môi trường vô đạm NFb rắn có bổ sung congo đỏ MT3 : Môi trường Dobereiner và cộng sự MT4 : Môi trường Andrade MT5 : Môi trường nuôi cấy thử khả năng khử nitrate MT6 : Môi trường MS MS : Murashige & Skoog N : Đạm NFb : nitrogen-fixing broth OD (Optical Density) : Mật độ quang PL : Phân loại a, b, c, trong xử lý thống kê TN : Thí nghiệm 1 MỞ ĐẦU Đồng Bằng Sông Cửu Long là nơi cung cấp gạo lớn nhất nước, góp phần xuất khẩu gạo ra thế giới. Thế nhưng hàng năm lũ lụt kéo về đã gây thiệt hại về người cũng như mùa màng. Nhằm chăm lo đời sống cho người dân vùng lũ đồng thời vẫn đáp ứng đủ gạo cho nhu cầu tiêu dùng và xuất khẩu, chính quyền khu vực chỉ đạo bao đê một số vùng ngập lũ. An Giang cũng không thuộc ngoại lệ. Từ đó, đất không còn độ màu mỡ do phù sa mang lại. Chính vì vậy, để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cho cây trồng, đất phải thường xuyên được bón phân. Việc sử dụng phân bón hóa học liên tục làm cho đất bị bạc màu và chua, vai trò của vi sinh vật đất giảm, chất lượng nông sản kém thậm chí gây ô nhiễm môi trường. Trong khi đó, phân vi sinh vật là loại sản phẩm chứa một hoặc nhiều chủng vi sinh vật sống, có ích đã được tuyển chọn mà hoạt động của chúng tạo nên trong đất trồng các chất dinh dưỡng hay các chất có hoạt tính kích thích sinh trưởng, tạo điều kiện nâng cao năng suất hoặc chất lượng nông sản, tăng độ màu mỡ cho đất. Các chủng vi sinh vật này không ảnh hưởng xấu đến người, vật nuôi, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản. Hiện nay người ta đã nghiên cứu sản xuất phân vi sinh vật bao gồm phân bón vi sinh vật cố định đạm, phân bón vi sinh phân giải các hợp chất phospho khó tan, phân bón vi sinh vật phân giải cellulose, phân bón vi sinh vật quang hợp. Các loại phân đạm vi sinh hiện nay đều được sản xuất từ các loại vi khuẩn cố định đạm như Azotobacter và Azospirillum. Các vi khuẩn này phân bố nhiều trong đất và quanh vùng rễ. Ngoài khả năng cố định đạm chúng có thể tiết ra một số hoạt chất có tác dụng kích thích sinh trưởng ở thực vật đưa vào môi trường đất. Đáng chú ý là khả năng cố định đạm của Azospirillum được Beijerinck phát hiện 2 từ năm 1922, nhưng vai trò của nó trong hoạt động cố định đạm vùng rễ cây hòa thảo chỉ được biết đến vào những năm đầu của thập niên 70 nhờ việc tìm ra nơi cư trú của chúng. Khi đánh giá những dữ liệu thu thập khắp thế giới hơn 30 năm qua ở đồng ruộng thử nghiệm nhiễm Azospirillum trên các đối tượng cây trồng khác nhau, người ta kết luận rằng các vi khuẩn này có khả năng làm tăng năng suất trên những loại đất trồng khác nhau và ở những vùng khí hậu khác nhau. Ở Việt Nam, trong thời gian qua, người ta đã đề cập tới sự tồn tại, phân lập, xác định đặc điểm của Azospirillum trong đất và rễ lúa khu vực ngoại thành Hà Nội và nghiên cứu khả năng cố định nitơ của một s