Luận văn Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của giống lan dendrobium mini lai trong điều kiện nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Phạm Thị Thu Ly KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA GIỐNG LAN DENDROBIUM MINI LAI TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY IN VITRO Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. BÙI VĂN LỆ Thành phố Hồ Chí Minh – 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: - Ban Giám hiệu trường Đại học Sư phạm TP. HCM, Phòng Đào tạo Sau đại học, Khoa Sinh học, tất cả thầy cô đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian theo học tại trường. - Thầy PGS. TS. Bùi Văn Lệ đã tận tình hướng dẫn, giảng dạy, bồi dưỡng kiến thức, đóng góp nhiều ý kiến quý báu và luôn tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành luận văn. - ThS. Hoàng Minh Tâm, ThS. Đặng Thị Ngọc Thanh – thầy cô đã quan tâm, tận tình chỉ bảo và cho em những ý tưởng đề tài. - Thạc sĩ Nguyễn Văn Vinh, Trạm huấn luyện và thực nghiệm nông nghiệp Văn Thánh thuộc Trung tâm khuyến nông thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. - ThS. Lê Minh Đức đã giúp đỡ và hỗ trợ cho em trong công tác phòng thí nghiệm để em thực hiện đề tài. - Quý Thầy Cô ngành Sinh học khoa Sư phạm Khoa học Tự nhiên trường Đại học Sài Gòn đã tạo điều kiện thuận lợi để em học tập và hoàn thành luận văn. - Các bạn sinh viên ngành Sư phạm Sinh học trường Đại học Sài Gòn đã nhiệt tình giúp đỡ trong quá trình thực hiện đề tài. - Cảm ơn tất cả những người thân, những người bạn đã luôn ở bên cạnh và động viên tôi trong suốt quá trình học tập. - Cuối cùng, con xin chân thành cảm ơn ba mẹ, hai chị và chồng đã luôn yêu thương, động viên và tạo điều kiện tốt nhất cho con hoàn thành qúa trình học tập. Một lần nữa xin chân thành cảm ơn. TP. Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2014 Phạm Thị Thu Ly MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 1.1. Sơ lược đặc điểm lan Dendrobium và lan Dendrobium mini ............................ 3 1.1.1. Đặc điểm hình thái ...................................................................................... 5 1.1.2. Điều kiện sinh thái ...................................................................................... 7 1.1.2.1. Nhiệt độ ................................................................................................ 7 1.1.2.2. Độ ẩm và chế độ tưới nước .................................................................. 8 1.1.2.3. Ánh sáng ............................................................................................... 8 1.1.2.4. Nhu cầu dinh dưỡng ............................................................................. 8 1.1.3. Các phương pháp nhân giống cây lan Dendrobium và Dendrobium mini ngoài tự nhiên ........................................................................................................... 9 1.1.3.1. Giao phấn .............................................................................................. 9 1.1.3.2. Phương pháp tách chiết ........................................................................ 9 1.2. Sơ lược phương pháp nhân giống in vitro ......................................................... 9 1.2.1. Lược sử phát triển của công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật ........................ 9 1.2.2. Tầm quan trọng của phương pháp nhân giống in vitro ............................. 10 1.2.3. Điều kiện nhân giống in vitro .................................................................... 11 1.2.4. Các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật .......................................................... 11 1.2.4.1. Giai đoạn 1: Chọn lựa và khử trùng mẫu ........................................... 11 1.2.4.2. Giai đoạn 2: Tạo thể nhân giống ........................................................ 11 1.2.4.3. Giai đoạn 3: Nhân giống in vitro ........................................................ 11 1.2.4.4. Giai đoạn 4: Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh .................................... 12 1.2.4.5. Giai đoạn 5: Chuyển cây con ra vườm ươm ...................................... 12 1.2.5. Những ưu điểm và khó khăn trong nhân giống in vitro ............................ 12 1.2.5.1. Ưu điểm .............................................................................................. 12 1.2.5.2. Khó khăn ............................................................................................ 13 1.2.6. Sơ lược các kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô thực vật ............................. 14 1.2.6.1. Nuôi cấy phôi ..................................................................................... 14 1.2.6.2. Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời ........................................................ 14 1.2.6.3. Nuôi cấy mô phân sinh ....................................................................... 15 1.2.6.4. Nuôi cấy bao phấn .............................................................................. 15 1.2.6.5. Nuôi cấy tế bào đơn ............................................................................ 15 1.2.6.6. Nuôi cấy protoplast ............................................................................ 16 1.2.7. Các phương pháp nhân giống in vitro cho lan Denrdobium ..................... 17 1.2.7.1. Nhân giống bằng chồi nách ................................................................ 17 1.2.7.2. Nhân giống bằng chồi đỉnh ................................................................ 17 1.2.7.3. Nhân giống bằng chồi bất định ........................................................... 17 1.2.7.4. Nhân giống qua nuôi cấy callus ......................................................... 17 1.2.7.5. Nhân giống bằng các đoạn giả hành ................................................... 17 1.2.7.6. Nuôi cấy hạt lai ................................................................................... 18 1.2.7.7. Dung hợp tế bào trần .......................................................................... 18 1.3. Sơ lược về phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) ............................. 18 1.4. Sơ lược phương pháp nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng lắc (nuôi cấy dịch treo tế bào) .................................................................................................................. 19 1.5. Giới thiệu về phôi soma và protocorm like bodies (PLBs) ............................ 20 1.5.1. Giới thiệu về phôi soma ............................................................................ 20 1.5.2. Giới thiệu về PLBs .................................................................................... 21 1.6. Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ................................... 22 1.7. Một số chất hữu cơ dùng trong nuôi cấy in vitro ............................................. 23 1.8. Một số công trình nghiên cứu về lan Dendrobium in vitro ............................... 24 1.8.1. Trong nước ................................................................................................ 24 1.8.2. Trên thế giới .............................................................................................. 24 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 26 2.1. Vật liệu ............................................................................................................. 26 2.1.1. Vật liệu nuôi cấy ....................................................................................... 26 2.1.2. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................... 26 2.1.3. Hóa chất ..................................................................................................... 26 2.2. Môi trường và điều kiện nuôi cấy .................................................................... 26 2.3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 27 2.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 27 2.4.1. Nội dung 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu .................................. 27 Thí nghiệm 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu......................................... 27 2.4.2. Nội dung 2: Khảo sát các loại môi trường nuôi cấy cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai ............................................................................................... 29 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng thành phần các loại môi trường nuôi cấy cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai .............................................................................. 29 2.4.3. Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai ................................................... 30 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng NAA và BA đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai ......................................... 30 2.4.4. Nội dung 4: Khảo sát các điều kiện nuôi cấy đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai ................................................................................. 31 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai ...................................................................................... 31 2.4.5. Nội dung 5: Khảo sát ảnh hưởng của các hợp chất hữu cơ: vitamin, đường, nước dừa, khoai tây, bánh dầu đến khả năng nhân nhanh chồi và sự sinh trưởng của giống lan Dendrobium mini lai ............................................................ 32 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ vitamin lên sự tăng sinh chồi trong môi trường lỏng lắc .................................................................................... 32 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của bánh dầu đến khả năng sinh trưởng chồi của giống lan Dendrobium mini lai ........................................................................... 33 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu đến khả năng sinh trưởng chồi của giống lan Dendrobium mini lai ............................................................. 35 Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu đến sinh trưởng của giống lan Dendrobium mini lai ở giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh................................... 36 2.4.6. Xử lý, phân tích số liệu, dữ kiện ............................................................... 37 2.5. Thời gian nghiên cứu ......................................................................................... 2 2.6. Nơi thực hiện đề tài ............................................................................................ 2 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................... 38 3.1. Kết quả 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu .............................................. 38 Thí nghiệm 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu......................................... 38 3.2. Kết quả 2: Khảo sát các loại môi trường nuôi cấy cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai .................................................................................................. 40 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng thành phần khoáng các loại môi trường nuôi cấy đến cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai ......................................................... 40 3.3. Kết quả 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai ....................................................................... 42 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng NAA và BA đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai ......................................... 42 3.4. Kết quả 4: Khảo sát các điều kiện nuôi cấy đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai .................................................................................................. 47 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai ...................................................................................... 47 3.5. Kết quả 5: Khảo sát ảnh hưởng của các hợp chất hữu cơ: vitamin, đường, nước dừa, khoai tây, bánh dầu và vitamin đến khả năng nhân nhanh chồi và sự sinh trưởng của giống lan Dendrobium mini lai ............................................................................ 50 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ vitamin lên sự tăng sinh chồi trong môi trường lỏng lắc .................................................................................... 50 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của bánh dầu đến khả năng sinh trưởng chồi của giống lan Dendrobium mini lai ........................................................................... 53 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu đến khả năng sinh trưởng chồi của giống lan Dendrobium mini lai ............................................................. 59 Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu đến sự sinh trưởng của giống lan Dendrobium mini lai ở giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh ............................. 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 67 1. Kết luận .................................................................................................................. 67 2. Kiến nghị ................................................................................................................ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 69 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT NAA : α-naphthaleneacetic acid BA : 6-benzyl adenin ABA : abcisic acid IAA : indol acetic acid IBA : indolbutyric acid TDZ : thidiazuron MS : Murasgige và Skoog WPM : Woody Plant Medium PLBs : Protocorm like bodies tTCL : Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào cắt theo chiều ngang lTCL : Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào cắt theo chiều dọc NT : Nghiệm thức DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Nồng độ javen và thời gian khử trùng mẫu ................................................... 27 Bảng 2.2. Nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật bổ sung vào các môi trường cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai ....................................................... 30 Bảng 2.3. Điều kiện nuôi cấy và nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật bổ sung vào các môi trường cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai .......................... 31 Bảng 2.4. Nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và vitamin bổ sung vào các môi trường ảnh hưởng đến sự tăng sinh chồi lan Dendrobium mini lai ................. 33 Bảng 2.5. Nồng độ bánh dầu bổ sung vào các môi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng chồi lan Dendrobium mini lai ............................................................................ 34 Bảng 2.6. Nồng độ cơm dừa và bánh dầu bổ sung vào các môi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng chồi lan Dendrobium mini lai ......................................................... 35 Bảng 2.7. Nồng độ cơm dừa và bánh dầu bổ sung vào các môi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng lan Dendrobium mini lai ở giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh ............... 36 Bảng 3.1. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ javen và thời gian lắc mẫu lên quá trình khử trùng ........................................................................................................................ 38 Bảng 3.2. Ảnh hưởng thành phần khoáng các loại môi trường nuôi cấy đến cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai ........................................................................... 41 Bảng 3.3. Tỉ lệ mẫu sống dưới ảnh hưởng của BA và NAA ........................................ 43 Bảng 3.4. Tỉ lệ mẫu tạo PLBs dưới ảnh hưởng của BA và NAA ................................ 43 Bảng 3.5. Tổng số chồi thu được dưới ảnh hưởng của BA và NAA ........................... 44 Bảng 3.6. Chiều cao chồi trung bình thu được dưới ảnh hưởng của BA và NAA ....... 44 Bảng 3.7. Tỉ lệ mẫu sống dưới ảnh hưởng của BA và NAA nuôi cấy trong điều kiện không có ánh sáng ................................................................................................. 47 Bảng 3.8. Tỉ lệ mẫu tạo PLBs dưới ảnh hưởng của BA và NAA nuôi cấy trong điều kiện không có ánh sáng ......................................................................................... 48 Bảng 3.9. Tổng số chồi thu được dưới ảnh hưởng của BA và NAA nuôi cấy trong điều kiện không có ánh sáng ......................................................................................... 48 Bảng 3.10. Chiều cao chồi trung bình thu được dưới ảnh hưởng của BA và NAA nuôi cấy trong điều kiện không có ánh sáng ................................................................. 49 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ vitamin lên sự tăng sinh chồi lan trong môi trường lỏng lắc sau 49 ngày nuôi cấy ............................................................................ 51 Bảng 3.12. Tỉ lệ nhân chồi lan dưới ảnh hưởng của bánh dầu ..................................... 54 Bảng 3.13. Chiều cao cây trung bình dưới ảnh hưởng của bánh dầu ........................... 55 Bảng 3.14. Số lá trung bình thu được dưới ảnh hưởng của bánh dầu .......................... 56 Bảng 3.15. Hình thái, màu sắc lá dưới ảnh hưởng của bánh dầu ................................. 57 Bảng 3.16. Tổng số chồi thu được dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu ............... 59 Bảng 3.17. Tỉ lệ nhân chồi dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu .......................... 60 Bảng 3.18. Chiều cao chồi trung bình thu được dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu ................................................................................................................................. 60 Bảng 3.19. Số lá trung bình thu được dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu .......... 61 Bảng 3.20. Hình thái, màu sắc lá dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu ................. 61 Bảng 3.21. Chiều cao cây trung bình thu được dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu ở giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh ......................................................................... 63 Bảng 3.22. Số lá trung bình thu được dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu ở giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh .................................................................................. 64 Bảng 3.23. Số rễ thu được dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu ở giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh ........................................................................................................ 64 Bảng 3.24. Hình thái, màu sắc lá dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu ở giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh.......................................................................................... 66 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1.1. Tổng quan về lan Dendrobium ........................................................................ 3 Hình 1.2. Cơ quan sinh sản của lan thuộc họ Ochidaceae .............................................. 7 Hình 1.3. Một số kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật .............................. 17 Hình 1.4. PLBs được hình thành từ phương pháp tTCL ................................................. 22 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình khử trùng mẫu ...................................................................... 29 Hình 3.1. Chồi lan non thu nhận ngoài vườn, cắt bớt b