Luận văn Khảo sát sự kháng kháng sinh của klebsiella pneumoniae tại viện pasteur tp. Hồ Chí Minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Phạm Thị Hoài An KHẢO SÁT SỰ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA KLEBSIELLA PNEUMONIAE TẠI VIỆN PASTEUR TP. HỒ CHÍ MINH LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Phạm Thị Hoài An KHẢO SÁT SỰ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA KLEBSIELLA PNEUMONIAE TẠI VIỆN PASTEUR TP. HỒ CHÍ MINH Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. CAO HỮU NGHĨA Thành phố Hồ Chí Minh – 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong các công trình nào khác. Tác giả Phạm Thị Hoài An LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này, em đã nhận được sự hướng dẫn, hỗ trợ, giúp đỡ rất tận tình của các thầy cô, anh chị, gia đình và các bạn. Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu cùng thầy cô Khoa Sinh – Trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã giúp em có cơ sở lí luận và kỹ năng nghiên cứu khoa học vững chắc. Ban Giám đốc Viện Pasteur và đặc biệt là TS. Cao Hữu Nghĩa, Trưởng khoa Xét nghiệm Sinh học Lâm sàng - Viện Pasteur Tp. HCM đã tạo điều kiện cơ sở vật chất tốt nhất, tận tâm hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. ThS. Vũ Lê Ngọc Lan, ThS. Uông Nguyễn Đức Ninh cùng các Cô, Anh và Chị trong Phòng Vi sinh Bệnh Phẩm, khoa Xét nghiệm Sinh học Lâm sàng - Viện Pasteur Tp. HCM đã hết lòng chỉ dẫn, đóng góp ý kiến và cùng đồng hành, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em học tập, làm việc cũng như thu thập số liệu tại phòng để em có thể thực hiện khóa luận này. Cuối cùng, em muốn gửi lời cảm ơn đến tất cả những người thân trong gia đình, những người đã luôn bên cạnh ủng hộ em. Mong cho điều tốt đẹp nhất sẽ đến với mọi người. Em xin hết lòng cảm ơn. Tác giả Phạm Thị Hoài An MỤC LỤC Trang Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình - sơ đồ - biểu đồ MỞ ĐẦU .............................................................................................................................................. 1 Chương 1. TỔNG QUAN .............................................................................................................. 4 1.1. Klebsiella pneumoniae ............................................................................................. 4 1.1.1. Đặc điểm vi sinh học ...................................................................................... 4 1.1.1.1. Hình thái và cấu trúc ................................................................................ 4 1.1.1.2. Cấu trúc kháng nguyên ............................................................................. 4 1.1.1.3. Cấu trúc bộ gen......................................................................................... 5 1.1.1.4. Tính chất nuôi cấy .................................................................................... 5 1.1.1.5. Tính chất hóa sinh .................................................................................... 6 1.1.2. Khả năng gây bệnh ......................................................................................... 6 1.1.2.1. Cơ chế gây bệnh ....................................................................................... 6 1.1.2.2. Biểu hiện lâm sàng ................................................................................... 6 1.1.3. Chẩn đoán vi sinh vật ..................................................................................... 6 1.1.4. Phòng bệnh và điều trị .................................................................................... 6 1.2. Kháng sinh và cơ chế tác động của kháng sinh ........................................................ 7 1.2.1. Định nghĩa kháng sinh .................................................................................... 7 1.2.2. Phân loại kháng sinh ....................................................................................... 7 1.2.2.1. Dựa vào khả năng tác dụng ...................................................................... 7 1.2.2.2. Dựa vào phổ tác dụng ............................................................................... 8 1.2.2.3. Dựa vào nguồn gốc ................................................................................... 8 1.2.2.4. Dựa trên cấu trúc hóa học ......................................................................... 9 1.2.2.5. Dựa vào cơ chế tác dụng của kháng sinh ............................................... 11 1.3. Cơ chế tác động của kháng kháng sinh .................................................................. 11 1.4. Cơ chế kháng kháng sinh ........................................................................................ 14 1.4.1. Bản chất di truyền của tính đề kháng và các phương thức chuyển tải gen... 14 1.4.1.1. Đề kháng tự nhiên .................................................................................. 15 1.4.1.2. Đề kháng mắc phải ................................................................................. 15 1.4.2. Cơ chế kháng kháng sinh .............................................................................. 16 1.4.2.1. Tạo enzyme phân hủy kháng sinh làm bất hoạt kháng sinh ................... 17 1.4.2.2. Thay đổi tính thấm của tế bào vi khuẩn ................................................. 20 1.4.2.3. Thay đổi cấu trúc receptor của kháng sinh làm giảm gắn kết của kháng sinh với điểm tiếp nhận ......................................................................... 21 1.4.2.4. Bơm đẩy ................................................................................................. 22 1.4.3. Cơ chế kháng một số nhóm kháng sinh của vi khuẩn Gram âm .................. 22 1.4.3.1. Kháng Penicillin và Cephalosporin ........................................................ 22 1.4.3.2. Kháng Carbapenemes ............................................................................. 23 1.4.3.3. Kháng Aminoglycoside .......................................................................... 23 1.4.3.4. Kháng Fuoroquinolones ......................................................................... 24 1.4.3.5. Kháng Tetracyclin .................................................................................. 24 1.4.3.6. Kháng Sulfonamid .................................................................................. 24 1.5. Tình hình kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae trên thế giới và trong nước ...................................................................................................................... 25 1.5.1. Trên thế giới .................................................................................................. 25 1.5.1. Tại Việt Nam ................................................................................................ 29 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 32 2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................. 32 2.1.1. Đối tượng ...................................................................................................... 32 2.1.2. Cỡ mẫu ......................................................................................................... 32 2.1.3. Thời gian nghiên cứu .................................................................................... 32 2.1.4. Địa điểm thực hiện đề tài .............................................................................. 33 2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 33 2.2.1. Vật liệu .......................................................................................................... 33 2.2.2. Phương pháp thực hiện ................................................................................. 36 2.2.2.1. Nuôi cấy vi khuẩn từ bệnh phẩm: đàm, mủ, máu, dịch não tủy, nước tiểu ............................................................................................................... 39 2.2.2.2. Nhuộm Gram: xác định vi khuẩn Gram âm ........................................... 42 2.2.2.3. Dùng các thử nghiệm sinh hóa để định danh Klebsiella pneumoniae ... 43 2.2.2.4. Làm kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby- Bauer ............................. 47 2.2.2.5. Thử nghiệm đĩa đôi ................................................................................ 50 2.2.2.6 Thử nghiệm Hodge test ........................................................................... 51 2.2.2.7. Phương pháp PCR phát hiện gen kháng kháng sinh .............................. 52 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................................................... 57 3.1. Đặc tính mẫu ........................................................................................................... 57 3.1.1. Đặc tính về giới tính của bệnh nhân ............................................................. 57 3.1.2. Đặc tính về tuổi bệnh nhân ........................................................................... 57 3.2. Sự phân bố vi khuẩn Klebsiella pneumoniae trong các loại bệnh phẩm ................ 58 3.3. Khảo sát mức độ kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae ........................... 59 3.4. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh β-lactamase phổ rộng ........................................ 63 3.5. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh carbapenemase .................................................. 67 3.6. Kết quả PCR ........................................................................................................... 68 3.6.1. Gen CMY-2 .................................................................................................. 69 3.6.2. Gen blaOXA -1 ................................................................................................. 72 3.6.3. Gen blaNDM-1 ................................................................................................. 75 3.6.4. Gen blaIMP ..................................................................................................... 78 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 82 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AM Ampicilline AMC Amoxiclline/clavalanic acid AN Amikacine BHI Brain Heart Infusion CA Chocolate Agar + Polyvitex CAZ Caftazidime CDC Centers for Disease Control and Prevention - Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kì CFU Colony Forming Unit - Đơn vị tạo khuẩn lạc CIP Ciprofloxacine CN Cephalexine CLSI Clinical and Laboratory Standard Institute - Viện tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm CS Colistin CO Columbia Agar + 5% máu cừu ADN Acid đeoxyribonucleic DNT Dịch não tủy EPM Etapenem ESBL Extended Spectrum Beta Lactamase -β - lactamase phổ rộng EP Nước muối sinh lý vô trùng FT Nitrofurantoin I Intermediate - Trung tâm ISO International Organization for Standardiazation - Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế IPM Imipenem KPC Klebsiella pneumoniae Carbapenemase LPS Lipopolysaccharide MHA Mueller Hinton Agar MBL Metallo- β -lactamase MPM Meropenem MEC Mecillinam mARN messenger RNA NET Netilmicine PBP Penicillin-binding protein PIP Piperacilline R Resistant - Đề kháng ARN Acid ribonucleic S Susceptibility - nhạy cảm SXT Trimethoprim+Sulfamethoxazole TE Tetracyline TSA Tryptic Soy Agar UDP Uridindiphosphat WHO World Health Organization - Tổ chức y tế thế giới DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Lớp, phân lớp kháng sinh beta lactam....9 Bảng 1.2. Phân loại enzyme beta-lactamase theo Ambler....18 Bảng 1.3. Phân loại enzyme β-lactamase theo Karen Bush......18 Bảng 2.1. Thang điểm Barlett dùng đánh giá mẫu đàm....39 Bảng 2.2. Các đoạn mồi dùng trong PCR phát hiện gen kháng kháng sinh......53 Bảng 2.3. Các thành phần trong phản ứng PCR........54 Bảng 2.4. Chu trình nhiệt cho từng gen mục tiêu......55 Bảng 3.1. Tỉ lệ nhiễm Klebsiella pneumoniae theo giới tính....57 Bảng 3.2. Tỉ lệ nhiễm Klebsiella pneumoniae theo độ tuổi......58 Bảng 3.3. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae phân lập từ các loại bệnh phẩm..59 Bảng 3.4. Tính nhạy cảm kháng sinh của Klebsiella pneumoniae....60 Bảng 3.5. So sánh tỉ lệ kháng kháng sinh với các nghiên cứu trước.....61 Bảng 3.6. Tỷ lệ đa kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae............................63 Bảng 3.7. Kết quả của một số nghiên cứu về Klebsiella pneumoniae sinh ESBL64 Bảng 3.8. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh ESBL theo mẫu bệnh phẩm.....64 Bảng 3.9. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh ESBL kháng với các kháng sinh.65 Bảng 3.10. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh carbapenemase..67 Bảng 3.11. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh carbapenemase theo mẫu bệnh phẩm67 Bảng 3.12. Kết quả PCR phát hiện 4 gen kháng kháng sinh.....68 Bảng 3.13. Kết quả điện di gen CMY-2....70 Bảng 3.14. Kết quả điện di gen blaOXA-171 Bảng 3.15. Kết quả điện di gen blaNDM-1.......74 DANH MỤC CÁC HÌNH - SƠ ĐỒ - BIỂU ĐỒ Trang Hình 1.1. Klebsiella pneumoniae4 Hình 1.2. Khuẩn lạc Klebsiella pneumoniae trên môi trường CA.5 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của 4 nhóm β-lactam...9 Hình 1.4. Cơ chế tác động của kháng sinh....12 Hình 1.5. Các phương thức lan truyền gen đề kháng....16 Hình 1.6. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn.....17 Hình 2.1. Klebsiella pneumoniae bắt màu hồng trên phết nhuộm Gram......42 Hình 2.2. API định danh vi khuẩn của BIOMERIEUX – Pháp46 Hình 2.3. Kết quả định danh API 20E của Klebsiella pneumoniae......47 Hình 2.4. Kháng sinh đồ của Klebsiella pneumoniae...50 Hình 2.5. Thử nghiệm đĩa đôi...51 Hình 2.6. Thử nghiệm Hodge test.........52 Hình 3.1. Kết quả PCR gen CMY-2 đọc bằng máy chụp gel (GelDOc-It2 – Mỹ).69 Hình 3.2. Kết quả PCR gen blaOXA-1đọc bằng máy chụp gel (GelDOc-It2 – Mỹ).72 Hình 3.3. Kết quả PCR gen blaNDM-1đọc bằng máy chụp gel (GelDOc-It2 – Mỹ)....76 Hình 3.4. Kết quả PCR gen blaIMP đọc bằng máy chụp gel (GelDOc-It2 – Mỹ).......79 Sơ đồ 2.1. Phương pháp nghiên cứu sự kháng kháng sinh của K. pneumoniae37 Sơ đồ 2.2. Quy trình nuôi cấy Klebsiella pneumoniae từ bệnh phẩm: đàm, mủ, máu, dịch não tủy, nước tiểu..38 Sơ đồ 2.3. Quy trình thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh bằng kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán kháng sinh trên mặt thạch...48 Biểu đồ 3.1. Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae.61 Biểu đồ 3.2. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh β-lactamase phổ rộng..63 1 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Klebsiella là một loại vi khuẩn Gram âm thường được tìm thấy trong ruột của người (mà không gây bệnh), phân người hoặc ở đường hô hấp. Chúng xâm nhập vào đường hô hấp (hít thở) và là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây viêm phổi, hoặc xâm nhập vào đường máu gây nhiễm trùng máu hoặc nhiễm trùng vết thương, nhiễm khuẩn đường tiết niệu, viêm màng não, viêm tai giữa, viêm xoang... Ngày nay, có nhiều vi khuẩn Klebsiella đã kháng thuốc, nhất là với loại thuốc kháng sinh carbapenem, điển hình là ổ dịch hoành hành khắp các bệnh viện ở Israel khiến 120-200 người tử vong bắt đầu khoảng năm 2006 [65], cùng thời điểm đó tại các bệnh viện Hàn Quốc cho thấy Klebsiella pneumoniae kháng cephalosporin thế hệ 3 là 29%. (Theo số liệu nghiên cứu KONSAR từ 2005-2007). Tình hình kháng thuốc của Klebsiella pneumoniae không chỉ xuất hiện ở Israel và Hàn Quốc mà còn diễn ra tại một đất nước có nền y học phát triển đó là Hoa Kì, “dịch kháng thuốc” của Klebsiella pneumoniae do sản xuất carbapenemase (KPC) được mô tả lần đầu tiên vào năm 1996 gây chết người liên tiếp. Kể từ đó lan rộng ra 41 tiểu bang, thường xuyên xảy ra trong một số bệnh viện ở New York và New Jersey [63]. Riêng Việt Nam, theo kết quả tìm hiểu thực trạng sử dụng kháng sinh trong nhiễm khuẩn bệnh viện tại các đơn vị điều trị tích cực ở một số cơ sở khám, chữa bệnh cho thấy 4 chủng vi khuẩn phân lập được nhiều nhất là Acinetobacter spp., Pseudomonas spp., E.coli, Klebsiella spp. 4 chủng này đều là vi khuẩn đa kháng kháng sinh. Hiện nay, sự kháng thuốc của chủng vi khuẩn Klebsiella pneumoniae cực kì nguy hiểm bởi vì bản thân loại vi khuẩn này có khả năng sinh được hai loại enzyme: β lactamase phổ rộng và carbapenemase [15]. Các enzyme này làm biến đổi, phá hủy cấu trúc hóa học của kháng sinh [27]. β lactamase phổ rộng có khả năng phân giải hầu hết các loại kháng sinh thuộc nhóm β lactam đặc biệt đối với penicillins và cephalosporins thế hệ thứ 3 [47]. Quan trọng hơn nữa là Klebsiella pneumoniae còn có khả năng sản sinh được carbapenemase phân giải carbapenem như imipenem, 2 meropenem..., trong khi carbapenem được xem như là cứu cánh cuối cùng trong việc lựa chọn kháng sinh để điều trị [69]. Để tránh tình trạng đa kháng trên lâm sàng, điều cấp thiết nhất đặt ra cho chúng ta là làm thế nào để phát hiện nhanh, chính xác được vi khuẩn Klebsiella pneumoniae sinh β lactamase phổ rộng và carbapenemase càng sớm càng tốt giúp các bác sĩ lựa chọn kháng sinh phù hợp nhất để điều trị cho bệnh nhân. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát sự kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae tại viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh” 2. Mục đích nghiên cứu Xác định đặc tính kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae tại Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Các chủng Klebsiella pneumoniae phân lập được từ các bệnh phẩm tại Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh từ 01-06/2014. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Nuôi cấy, phân lập và định danh chủng Klebsiella pneumoniae. - Khảo sát tỷ lệ nhiễm Klebsiella pneumoniae ở giới tính, các lứa tuổi, bệnh phẩm khác nhau. - Khảo sát tỷ lệ kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae phân lập được. - Sàng lọc các chủng Klebsiella pneumoniae sinh ESBL bằng thử nghiệm đĩa đôi, sinh carbapenemase bằng Hodge test. - Xác định một số gen mã hóa cho tính kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae. 5. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp thu mẫu, nuôi cấy, phân lập, định danh, làm kháng sinh đồ, sàng lọc chủng vi khuẩn Klebsiella pneumoniae sinh carbapenemase, β-lactamases phổ rộng, phát hiện gen kháng thuốc được thực hiện theo quy trình chuẩn của Viện Pasteur Tp. HCM đạt chuẩn ISO 15189:2007. - Thu mẫu bệnh phẩm: đàm, mủ, máu, dịch não tủy, nước tiểu. - Phân lập và định danh các chủng Klebsiella pneumoniae bằng các thử nghiệm hóa sinh hoặc API 20E. 3 - Thử nghiệm kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby-Bauer. - Thử nghiệm đĩa đôi, thử nghiệm Hodge test sàng lọc các chủng Klebsiella pneumoniae sinh β-lactamases phổ rộng, carbapenemase. - Phát hiện các gen kháng kháng sinh bằng phương pháp PCR. 6. Thời gian, địa điểm thực hiện đề tài - Dự kiến thời gian : từ 01/2014 đến tháng 06/2014. - Địa điểm thực hiện đề tài: Khoa xét nghiệm sinh học lâm sàng, Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh. 4 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Klebsiella pneumoniae Năm 1882, Fridlander C.Uber đầu tiên phát hiện ra Klebsiella là tác nhân gây bệnh viêm phổi [45]. Vào năm 1884, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853- 1938) phát triển kỹ thuật nhuộm Gram để phân biệt các Pneumococcus với Klebsiella pneumoniae [17]. 1.1.1. Đặc điểm vi sinh học 1.1.1.1. Hình thái và cấu trúc Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Klebsiella Loài: Klebsiella pneumoniae [90] Klebsiella pneumoniae là thành viên quan trọng nhất của chi Klebsiella trong họ Enterobacteriaceae. Klebs