Luận văn Khảo sát về mặt thực vật học và tác dụng kháng vi sinh vật của cây lục bình [eichhornia crassipes (mart.) solms]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH ĐÀO THỊ KIM ANH KHẢO SÁT VỀ MẶT THỰC VẬT HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CÂY LỤC BÌNH [EICHHORNIA CRASSIPES (MART.) SOLMS] LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH ĐÀO THỊ KIM ANH KHẢO SÁT VỀ MẶT THỰC VẬT HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CÂY LỤC BÌNH [EICHHORNIA CRASSIPES (MART.) SOLMS] Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS. Trương Thị Đẹp TS. Nguyễn Tú Anh Thành phố Hồ Chí Minh - 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được các tác giả công bố trong bất kì công trình nào. Các trích dẫn về bảng biểu, kết quả nghiên cứu của những tác giả khác; tài liệu tham khảo trong luận văn đều có nguồn gốc rõ ràng và theo đúng quy định. TP. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 11 năm 2014 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Đào Thị Kim Anh LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Trương Thị Đẹp, TS. Nguyễn Tú Anh - người đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô của Trường, Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học, bộ môn Sinh học thực nghiệm - Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh, bộ môn Thực vật, bộ môn Vi sinh - Kí sinh - Trường Đại học Y dược TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn này. Qua đây, tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã giúp đỡ, động viên, cổ vũ tinh thần cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này. TP. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 11 năm 2014 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Đào Thị Kim Anh MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 I. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI ....................................................................................... 1 II. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ............................................................................. 1 III. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................ 1 IV. NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU ........................................................................... 2 V. PHẠM VI NGHIÊN CỨU ............................................................................... 2 VI. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN ..................................................... 2 Chương 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 3 1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC CỦA CÂY LỤC BÌNH .............................. 3 1.1.1. Phân loại ................................................................................................. 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật học ............................................................................. 3 1.1.3. Phân bố ................................................................................................... 3 1.1.4. Thành phần hóa học ................................................................................ 4 1.1.5. Bộ phận dùng .......................................................................................... 4 1.1.6. Tác dụng dược lí ..................................................................................... 4 1.2. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CÂY LỤC BÌNH .................................................................... 5 1.2.1. Một số nghiên cứu trên thế giới về hoạt tính kháng vi sinh vật của Lục bình ...................................................................................... 5 1.2.2. Nghiên cứu ở Việt Nam về hoạt tính kháng vi sinh vật của Lục bình .................................................................................................... 6 1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT HOẠT CHẤT TỪ DƯỢC LIỆU .......................................................................................................... 7 1.3.1. Các quá trình xảy ra trong chiết xuất ..................................................... 7 1.3.1.1. Sự hòa tan ......................................................................................... 7 1.3.1.2. Sự khuếch tán ................................................................................... 8 1.3.1.3. Sự thẩm thấu .................................................................................... 8 1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất ...................................... 8 1.3.2.1. Nguyên liệu ...................................................................................... 8 1.3.2.2. Dung môi .......................................................................................... 9 1.3.2.3. Kĩ thuật chiết .................................................................................. 10 1.3.3.1. Phương pháp ngâm ........................................................................ 10 1.3.3.2. Phương pháp ngấm kiệt ................................................................. 11 1.3.3.3. Phương pháp chiết phân bố lỏng – lỏng ........................................ 11 1.4. MỘT SỐ VI SINH VẬT GÂY BỆNH ........................................................ 12 1.4.1. Staphylococcus aureus .......................................................................... 12 1.4.2. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) .......................... 12 1.4.3. Streptococcus faecalis ........................................................................... 13 1.4.4. Escherichia coli ..................................................................................... 13 1.4.5. Pseudomonas aeruginosa ..................................................................... 13 1.4.6. Candida albicans .................................................................................. 14 1.5. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG VI SINH VẬT .............................................................................................. 14 1.5.1. Phương pháp khuếch tán ...................................................................... 14 1.5.2. Phương pháp pha loãng ........................................................................ 14 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 15 2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ............................................. 15 2.1.1. Thời gian nghiên cứu ............................................................................ 15 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 15 2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ......................................................................... 15 2.2.1. Vật liệu khảo sát về thực vật học .......................................................... 15 2.2.2. Nguyên liệu chiết xuất ........................................................................... 15 2.2.3. Vi sinh vật thử nghiệm ........................................................................... 16 2.2.4. Hóa chất ................................................................................................ 16 2.2.5. Môi trường nuôi cấy và thử hoạt tính kháng vi sinh vật ....................... 16 2.2.5.1. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật ..................................................... 16 2.2.5.2. Môi trường thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật ...................... 17 2.2.6. Thiết bị sử dụng ..................................................................................... 17 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 18 2.3.1. Phương pháp khảo sát về mặt thực vật học .......................................... 18 2.3.1.1. Đặc điểm hình thái ......................................................................... 18 2.3.1.2. Đặc điểm giải phẫu ........................................................................ 18 2.3.2. Phương pháp chiết xuất cao dược liệu ................................................. 19 2.3.2.1. Phương pháp chiết nguội ............................................................... 19 2.3.2.2. Phương pháp chiết nóng ................................................................. 19 2.3.2.3. Phương pháp chiết phân đoạn ........................................................ 20 2.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật .............................. 21 2.3.5. Phương pháp xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật ................. 22 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................. 24 3.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC ................................................................... 24 3.1.1. Đặc điểm hình thái ................................................................................ 24 3.1.2. Đặc điểm giải phẫu ............................................................................... 30 3.2. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT ................................... 38 3.2.1. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của dịch chiết ............................. 38 3.2.2. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao Lục bình sau khi chiết phân đoạn ........................................................................................ 43 3.3. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ TỐI THIỂU ỨC CHẾ SỰ PHÁT TRIỂN VI KHUẨN (MIC) .................................................................................. 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 49 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Chú giải ATCC American Type Culture Collection - Bộ sưu tập chủng chuẩn của Mĩ CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute - Tiêu chuẩn thử nghiệm tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh DMSO Dimethyl sulphoxide EtOH Ethanol OD Optical Density - Mật độ quang MHA Mueller - Hinton Agar MHB Mueller - Hinton Broth MIC Minimum Inhibitory Concentration - Nồng độ tối thiểu ức chế sinh trưởng vi sinh vật SDA Sabouraud Dextro Agar TP.HCM Thành phố Hồ Chí Minh TSA Trypticase Soy Agar TSB Trypticase Soy Broth DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Tỉ lệ khối lượng khô từng bộ phận của cây Lục bình .................................. 38 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của cao toàn phần ................. 39 Bảng 3.3. Tác động kháng khuẩn của cao EtOH từ căn hành với phương pháp chiết và dung môi khác nhau ................................................................. 42 Bảng 3.4. Tác động kháng khuẩn của các phân đoạn cao chiết từ căn hành của cây chưa ra hoa ở môi trường nước đứng .................................................... 43 Bảng 3.5. Tác động kháng khuẩn của các phân đoạn cao chiết toàn cây của cây đang ra hoa ở môi trường nước đứng .................................................... 43 Bảng 3.6. MIC của mẫu căn hành ở cây chưa ra hoa trong môi trường nước đứng ..... 44 Bảng 3.7. MIC của mẫu toàn cây ở cây đang ra hoa trong môi trường nước đứng ...... 45 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1. Phương pháp chiết nguội ............................................................................ 19 Hình 2.2. Phương pháp chiết nóng ............................................................................. 20 Hình 2.3. Sơ đồ chiết phân đoạn ................................................................................ 21 Hình 3.1. Cây Lục bình với lá mọc thành hình hoa thị .............................................. 25 Hình 3.2. Phiến lá hình thận hoặc hình tim ................................................................ 26 Hình 3.3. Lục bình ở các môi trường sống khác nhau ............................................... 26 Hình 3.4. Các cá thể Lục bình nối với nhau nhờ căn hành ......................................... 27 Hình 3.5. Lục bình với rễ chùm .................................................................................. 27 Hình 3.6. Rễ Lục bình ................................................................................................ 27 Hình 3.7. Cụm hoa ...................................................................................................... 28 Hình 3.8. Hoa màu xanh nhạt hoặc xanh tím ............................................................. 28 Hình 3.9. Các phiến rời của bao hoa .......................................................................... 29 Hình 3.10. Đài và tràng hoa ......................................................................................... 29 Hình 3.11. Hoa có 6 nhị (3 dài, 3 ngắn) ..................................................................... 29 Hình 3.12. Hạt phấn .................................................................................................... 30 Hình 3.13. Bầu noãn cắt ngang .................................................................................. 30 Hình 3.14. Vi phẫu rễ Lục bình ................................................................................... 32 Hình 3.15. Một phần vi phẫu căn hành ở các môi trường sống khác nhau ................. 33 Hình 3.16. Vi phẫu căn hành ...................................................................................... 34 Hình 3.17. Vi phẫu phiến lá ......................................................................................... 35 Hình 3.18. Một phần vi phẫu cuống lá ....................................................................... 36 Hình 3.19. Một phần vi phẫu phần phình cuống lá .................................................... 37 Hình 3.20. Tác động của cao chiết nguội EtOH 96% trên S. aureus .......................... 41 Hình 3.21. Tác động của cao chiết nguội EtOH 96% trên S. faecalis ......................... 41 Hình 3.22. MIC của mẫu căn hành ở cây chưa có hoa trong môi trường nước đứng ............ 46 Hình 3.23. MIC của mẫu toàn cây ở cây có hoa trong môi trường nước đứng ...................... 46 1 MỞ ĐẦU I. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI Kháng sinh là một trong những nhóm thuốc được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh nhiễm trùng. Kháng sinh có nguồn gốc tổng hợp hay bán tổng hợp thường có độc tính cao, nhiều tác dụng phụ không mong muốn. Bên cạnh đó, thực trạng kháng thuốc kháng sinh ngày càng tăng, đã và đang trở thành một thách thức đối với các bác sĩ lâm sàng. Do đó, các nhà khoa học luôn nỗ lực tìm kiếm các hoạt chất mới có tính kháng vi sinh vật, đặc biệt là các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc thực vật. Vì hợp chất thiên nhiên thường an toàn trong sử dụng và hiện tượng kháng thuốc xảy ra chậm hơn. Cây Lục bình [Eichhornia crassipes (Mart.) Solms] có xuất xứ từ Brasil, được du nhập và trồng làm cảnh ở Hà Nội (Việt Nam) từ năm 1905. Với đặc điểm sinh sản rất nhanh, Lục bình lan ra khắp nơi một cách nhanh chóng và phổ biến ở ao, hồ, kênh, rạch trong cả nước. Lục bình từ lâu đã được người dân biết đến như là một loài cây có nhiều công dụng: dùng làm thức ăn cho người, vật nuôi, làm phân bón hoặc dùng làm thuốc chữa sưng tấy, viêm đau. Ngoài ra, nhờ khả năng hấp thu một số kim loại nặng mà Lục bình được sử dụng để giảm ô nhiễm môi trường, đặc biệt là môi trường nước. Tuy nhiên, khi Lục bình sinh sản quá mức, chúng có thể gây tắc nghẽn dòng chảy. Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu về công dụng của cây Lục bình nhưng phần lớn đều tập trung vào tác dụng xử lí môi trường và chống ô nhiễm nguồn nước. Trên thế giới cũng có một số nghiên cứu đề cập đến khả năng kháng vi sinh vật của Lục bình. Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về tác dụng kháng vi sinh vật của loài cây này. Vì vậy, đề tài này tiến hành khảo sát về mặt thực vật học và tác dụng kháng vi sinh vật của cây Lục bình [Eichhornia crassipes (Mart.) Solms]. II. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Sàng lọc những dược liệu có nguồn gốc từ thực vật thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm. III. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Cây Lục bình [Eichhornia crassipes (Mart.) Solms]. 2 IV. NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU 1. Mô tả đặc điểm hình thái và giải phẫu của cây Lục bình ở môi trường nước đứng và môi trường nước chảy, bổ sung những điểm khác biệt của Lục bình ở hai môi trường (nếu có); tìm hiểu nguyên nhân ảnh hưởng đến sự sai khác. 2. Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của cao chiết từ cây Lục bình với các dung môi khác nhau. Từ đó, xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao dược liệu đối với các chủng vi sinh vật trên. V. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Khảo sát về mặt thực vật học và khả năng kháng vi sinh vật của Lục bình được thu hái tại sông Sài Gòn (TP.HCM) và các ao nước đọng ở Bình Dương, tại các vị trí môi trường nước đứng và môi trường nước chảy trên các chủng vi sinh vật thử nghiệm gồm các chủng vi khuẩn chuẩn của ATCC được lưu giữ tại Bộ môn Vi sinh – Kí sinh (Khoa Dược – Trường Đại học Y dược TP.HCM): Staphylococcus aureus ATCC 29213, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) ATCC 43300, Streptococcus faecalis ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 và nấm men Candida albicans ATCC 10231. VI. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 1. Ý nghĩa khoa học: góp phần xây dựng thư viện dữ liệu về các cao chiết có khả năng kháng vi sinh vật có nguồn gốc từ thực vật ở Việt Nam. 2. Ý nghĩa thực tiễn: cung cấp số liệu thực nghiệm nhằm giải thích dựa trên những bằng chứng khoa học một số bài thuốc dân gian sử dụng Lục bình để chữa một số bệnh nhiễm khuẩn ngoài da. Kết quả của đề tài sẽ làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo đánh giá khả năng kháng khuẩn in vivo của cao chiết từ Lục bình. 3 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC CỦA CÂY LỤC BÌNH 1.1.1. Phân loại Vị trí phân loại của cây Lục bình [3], [9] Giới Thực vật (Plantae) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Hành (Liliopsida) Phân lớp Hành (Liliidae) Bộ Lục bình (Pontederiales) Họ Lục bình (Pontederiaceae) Chi Lục bình (Eichhornia) Loài Lục bình [Eichhornia crassipes (Mart.) Solms] Tên khác: Bèo tây, Bèo sen, Bèo Nhật Bản hay Lộc bình. Tên nước ngoài: Water hyacinth (Anh), Jacinthe d’eau (Pháp) [4], [8]. 1.1.2. Đặc điểm thực vật học Cây thảo sống nhiều năm, nổi ở nước hoặc bám trên đất bùn, căn hành dài, mang một chùm rễ dài và rậm ở phía dưới. Kích thước cây thay đổi tùy theo môi trường sống có nhiều hay ít chất màu. Lá mọc thành hoa thị, có cuống phồng lên thành phao nổi, gân lá hình cung, phiến lá hình tròn hay hình tim. Cụm hoa bông hay chùy ở ngọn thân. Hoa không đều, màu xanh nhạt hay tím; đài và tràng cùng màu, dính liền với nhau ở gốc, cánh hoa trên có một đốm vàng; 6 nhị (3 dài, 3 ngắn); bầu trên, 3 ô, chứa nhiều noãn nhưng chỉ có một cái sinh sản. Quả nang [4], [8]. Lục bình thường ra hoa từ khoảng tháng 10 đến tháng 11 hàng năm [8]. 1.1.3. Phân bố Cây gốc ở Brasil, năm 1905 được đem về trồng làm cảnh ở Hà Nội. Về sau lan ra khắp nơi một cách nhanh chóng. Phổ biến ở các ao, hồ, kênh, rạch trong cả nước. Ngoài ra còn phân bố ở nhiều nước nhiệt đới trên thế giới, đặc biệt là các nước vùng 4 Nam Á và Đông Nam Á. Do khả năng tạo nhánh khỏe từ các chồi gốc, cây nhanh chóng phát triển thành những đám hay bè mảng lớn. Cây còn được nuôi trồng hạn chế trên các ao hồ thả cá, làm thức ăn cho lợn, trâu bò và là nguồn phân xanh tốt [4], [8]. Ở Bengal (Ấn Độ) người ta ước tính diện tích mặt nước có Lục bình chiếm giữ đến 30.000 hecta [8]. 1.1.4. Thành phần hóa học Toàn cây Lục bình chứa 92,6% là nước, 2,9% protein, 0,9% đường, 2,2% xơ, 1,4% tro