Luận văn Khảo sát về mặt thực vật học và thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các dịch chiết từ cây trinh nữ (mimosa pudica l.) và quả lựu (punica granatum l.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Mai Thị Trà Giang KHẢO SÁT VỀ MẶT THỰC VẬT HỌC VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM CỦA CÁC DỊCH CHIẾT TỪ CÂY TRINH NỮ (MIMOSA PUDICA L.) VÀ QUẢ LỰU (PUNICA GRANATUM L.) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. TRƯƠNG THỊ ĐẸP PGS.TS. NGUYỄN ĐINH NGA Thành phố Hồ Chí Minh - 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được các tác giả công bố trong bất kì công trình nào. Các trích dẫn về bảng biểu, kết quả nghiên cứu của những tác giả khác; tài liệu tham khảo trong luận văn đều có nguồn gốc rõ ràng và theo đúng quy định. TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2014 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Mai Thị Trà Giang LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Trương Thị Đẹp, PGS.TS. Nguyễn Đinh Nga - người đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này. Tôi xin trân trọng cảm ơn các Giáo sư, Phó giáo sư, Tiến sĩ trong Hội đồng các cấp đã đọc và góp ý cho luận văn của tôi. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Quý thầy cô phòng bộ môn Thực vật, bộ môn Kí sinh trùng của Trường Đại học Y dược TP. Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn này. Qua đây, tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã giúp đỡ, động viên, cổ vũ tinh thần cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này. TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2014 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Mai Thị Trà Giang MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 I. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI ................................................................................................. 1 II. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ....................................................................................... 2 III. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................................... 2 IV. NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU ..................................................................................... 2 V. PHẠM VI NGHIÊN CỨU ......................................................................................... 2 VI. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN VĂN ................................ 3 Chương 1. TỔNG QUAN .............................................................................................. 4 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY TRINH NỮ VÀ CÂY LỰU ............................................. 4 1.1.1. Cây Trinh nữ ...................................................................................................... 4 1.1.1.1. Vị trí phân loại ............................................................................................ 4 1.1.1.2. Đặc điểm hình thái ...................................................................................... 4 1.1.1.3. Phân bố, sinh thái ........................................................................................ 4 1.1.1.4. Bộ phận dùng .............................................................................................. 5 1.1.1.5. Thành phần hóa học .................................................................................... 5 1.1.1.6. Tính vị, tác dụng ......................................................................................... 5 1.1.1.7. Công dụng ................................................................................................... 5 1.1.2. Cây Lựu ............................................................................................................. 6 1.1.2.1. Vị trí phân loại ............................................................................................ 6 1.1.2.2. Đặc điểm hình thái ...................................................................................... 6 1.1.2.3. Phân bố, sinh thái ........................................................................................ 6 1.1.2.4. Bộ phận dùng .............................................................................................. 7 1.1.2.5. Thành phần hóa học .................................................................................... 7 1.1.2.6. Tính vị, tác dụng ......................................................................................... 7 1.1.2.7. Công dụng ................................................................................................... 7 1.2. LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CÂY TRINH NỮ VÀ CÂY LỰU ............................................................................................ 8 1.2.1. Cây Trinh nữ ...................................................................................................... 8 1.2.2. Cây Lựu ............................................................................................................. 9 1.3. CÁC VI KHUẨN VÀ NẤM GÂY BỆNH THƯỜNG GẶP ................................. 10 1.3.1. Staphylococcus aureus ..................................................................................... 10 1.3.2. MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) .................................... 11 1.3.3. Streptococcus faecalis ...................................................................................... 12 1.3.4. Escherichia coli ............................................................................................... 12 1.3.5. Pseudomonas aeruginosa ................................................................................ 12 1.3.6. Candida albicans ............................................................................................. 13 1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU ........................................... 13 1.4.1. Phương pháp chiết lạnh ................................................................................... 13 1.4.2. Phương pháp chiết nóng .................................................................................. 14 1.4.3. Phương pháp chiết lỏng – lỏng ........................................................................ 14 1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT .................. 15 1.5.1. Phương pháp khuếch tán .................................................................................. 15 1.5.1.1. Nguyên tắc ................................................................................................ 15 1.5.1.2. Một số phương pháp thường được sử dụng .............................................. 15 1.5.2. Phương pháp pha loãng ................................................................................... 16 1.5.2.1. Nguyên tắc ................................................................................................ 16 1.5.2.2. Một số phương pháp thường được sử dụng .............................................. 16 1.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm ................................................ 17 1.5.3.1. Mật độ tế bào ............................................................................................. 17 1.5.3.2. Môi trường dùng thử và pH của môi trường ............................................. 17 1.5.3.3. Nhiệt độ và thời gian ủ .............................................................................. 17 1.5.3.4. Điểm dừng đọc kết quả ............................................................................. 18 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 19 2.1. VẬT LIỆU .............................................................................................................. 19 2.1.1. Vật liệu khảo sát về thực vật học ..................................................................... 19 2.1.2. Vi sinh vật thử nghiệm ..................................................................................... 19 2.1.3. Môi trường thử nghiệm .................................................................................... 19 2.1.4. Nguyên liệu ...................................................................................................... 21 2.1.5. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ........................................................................ 21 2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM ................................................................ 22 2.2.1. Phương pháp khảo sát về mặt thực vật học ..................................................... 22 2.2.1.1. Đặc điểm hình thái .................................................................................... 22 2.2.1.2. Đặc điểm giải phẫu.................................................................................... 22 2.2.2. Phương pháp chiết xuất cao dược liệu ............................................................. 23 2.2.2.1. Chiết xuất cao thô ...................................................................................... 23 2.2.2.2. Thăm dò dung môi chiết xuất ................................................................... 23 2.2.3. Phương pháp tinh chế cao toàn phần ............................................................... 24 2.2.3.1. Phương pháp tinh chế cao toàn phần 1 ..................................................... 24 2.2.3.2. Phương pháp tinh chế cao toàn phần 2 ..................................................... 24 2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật của cao dược liệu............. 25 2.2.4.1. Chuẩn bị vi sinh vật thử nghiệm ............................................................... 25 2.2.4.2. Phương pháp khuếch tán ........................................................................... 27 2.2.4.3. Phương pháp pha loãng ............................................................................. 28 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 30 3.1. KHẢO SÁT VỀ MẶT THỰC VẬT HỌC ............................................................. 30 3.1.1. Cây Trinh nữ .................................................................................................... 30 3.1.1.1. Đặc điểm hình thái .................................................................................... 30 3.1.1.2. Đặc điểm giải phẫu.................................................................................... 31 3.1.2. Quả Lựu ........................................................................................................... 39 3.1.2.1. Đặc điểm hình thái .................................................................................... 39 3.1.2.2. Đặc điểm giải phẫu.................................................................................... 39 3.2. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM CỦA CAO DƯỢC LIỆU .................................................................................................................. 43 3.2.1. Tác động kháng vi sinh vật của cây Trinh nữ .................................................. 43 3.2.1.1. Tác động kháng vi sinh vật của các cao chiết thô từ cây Trinh nữ ........... 43 3.2.1.2. Thăm dò dung môi chiết xuất toàn cây Trinh nữ ...................................... 45 3.2.1.3. Tinh chế cao toàn cây Trinh nữ ................................................................. 45 3.2.1.4. Nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển S. aureus (MIC) của cao chiết cây Trinh nữ .................................................................................................................. 46 3.2.2. Tác động kháng vi sinh vật của các cao chiết từ quả Lựu ............................... 48 3.2.2.1. Tác động kháng vi sinh vật của các cao chiết thô từ quả Lựu .................. 48 3.2.2.2. Thăm dò dung môi chiết xuất vỏ quả Lựu ................................................ 50 3.2.2.3. Tinh chế cao chiết vỏ quả Lựu .................................................................. 50 3.2.2.4. Nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật (MIC) của cao chiết vỏ quả Lựu ..... 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 53 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ ...................................... 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 55 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chú giải CH2Cl2 Dichloromethan DMSO Dimethyl sulphoxide EtOAc Ethyl acetate EtOH Ethanol MeOH Methanol MHA Mueller - Hinton Agar MHB Mueller - Hinton Broth SDA Sabouraud Dextro Agar TSA Trypticase Soy Agar TSB Trypticase Soy Broth DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Bảng đánh giá mức độ của đường kính vòng tác động kháng khuẩn, kháng nấm .............................................................................................. 27 Bảng 3.1. Tác động kháng S. aureus của cao chiết thô từ cây Trinh nữ ....................... 43 Bảng 3.2. Tác động kháng S. aureus của cao chiết thô từ cây Trinh nữ với ethanol có độ cồn khác nhau ................................................................................ 45 Bảng 3.3. Tác động kháng S. aureus của các cao chiết từ cây Trinh nữ theo phương pháp tinh chế 1 ........................................................................... 45 Bảng 3.4. Tác động kháng S. aureus của các cao chiết từ cây Trinh nữ theo phương pháp tinh chế 2 .......................................................................... 45 Bảng 3.5. MIC của cao chiết cây Trinh nữ tác động trên S. aureus .............................. 46 Bảng 3.6. Tác động kháng vi sinh vật của cao chiết thô từ quả Lựu ........................... 48 Bảng 3.7. Tác động kháng vi sinh vật của cao chiết thô từ vỏ quả Lựu với ethanol có độ cồn khác nhau ................................................................................ 50 Bảng 3.8. Tác động kháng vi sinh vật của các cao chiết từ vỏ quả Lựu theo phương pháp tinh chế 1 ........................................................................... 50 Bảng 3.9. Tác động kháng vi sinh vật của các cao chiết vỏ quả Lựu theo phương pháp tinh chế 2 ........................................................................................ 50 Bảng 3.10. MIC của cao chiết vỏ quả Lựu trên các vi sinh vật thử nghiệm ................. 51 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1. Sơ đồ quy trình chiết xuất dược liệu .......................................................... 23 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình tinh chế cao toàn phần 1 ................................................... 24 Hình 2.3. Sơ đồ quy trình tinh chế cao toàn phần 2 ................................................... 25 Hình 2.4. Sơ đồ quy trình chuẩn bị vi sinh vật thử nghiệm ........................................ 26 Hình 2.5. Tác động kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán ....................... 28 Hình 2.6. Sơ đồ quy trình xác định tác động kháng vi sinh vật bằng phương pháp pha loãng ................................................................................................... 29 Hình 3.1. Đặc điểm hình thái cây Trinh nữ (Mimosa pudica L.) ............................... 33 Hình 3.2. Đặc điểm hình thái cây Trinh nữ (Mimosa pudica L.) ............................... 34 Hình 3.3. Cấu tạo giải phẫu rễ cây Trinh nữ (Mimosa pudica L.) ............................. 35 Hình 3.4. Cấu tạo giải phẫu thân cây Trinh nữ (Mimosa pudica L.) ......................... 36 Hình 3.5. Cấu tạo giải phẫu lá chét cây Trinh nữ (Mimosa pudica L.) ...................... 37 Hình 3.6. Cấu tạo giải phẫu cuống lá Trinh nữ (Mimosa pudica L.) ......................... 38 Hình 3.7. Đặc điểm hình thái quả và hạt Lựu (Punica granatum L.) ........................ 40 Hình 3.8. Cấu tạo giải phẫu vỏ quả Lựu (Punica granatum L.) ................................. 41 Hình 3.9. Cấu tạo giải phẫu hạt Lựu (Punica granatum L.) ...................................... 42 Hình 3.10. Kết quả tác động kháng S. aureus của cao chiết thô từ cây Trinh nữ và vỏ quả Lựu ........................................................................................ 44 Hình 3.11. Kết quả kháng S. aureus của cao tinh chế từ cây Trinh nữ bằng cách tủa qua MeOH ...................................................................................... 46 Hình 3.12. MIC của cao chiết cây Trinh nữ trên S. aureus ........................................ 47 Hình 3.13. Kết quả tác động kháng S. aureus (A) và MRSA (B) của cao chiết thô từ quả Lựu ....................................................................................... 48 Hình 3.14. Kết quả tác động kháng S. faecalis (A) và E. coli (B) của cao chiết thô từ vỏ quả Lựu và cây Trinh Nữ ....................................................... 49 Hình 3.15. Kết quả tác động kháng C. albicans của cao chiết thô từ vỏ quả Lựu và cây Trinh nữ .................................................................................... 49 Hình 3.16. MIC của cao chiết vỏ quả Lựu trên C. albicans ......................................... 52 Hình 3.17. MIC của cao chiết vỏ quả Lựu trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm ......... 52 1 MỞ ĐẦU I. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI Bước sang thế kỉ 21, thời kì của quá trình công nghiệp hóa, hiện đại hóa, thiên tai, dịch bệnh và tệ nạn xã hội xuất hiện ngày càng nhiều đặt ra cho thế giới loài người những thách thức vô cùng to lớn. Y học cũng không đứng bên ngoài những thách thức đó khi xuất hiện nhiều căn bệnh mới lạ, nguy hiểm gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng cuộc sống con người. Những năm gần đây, sự kháng thuốc ở các vi sinh vật gây bệnh nhiễm đang được các nhà khoa học quan tâm chú ý. Đây là một vấn đề rất đáng lo ngại đặc biệt đối với những vùng khí hậu nóng ẩm thuận lợi cho vi khuẩn gây bệnh phát triển như ở Việt Nam. Tình trạng đề kháng thuốc của các vi sinh vật gây bệnh; sự biến đổi liên tục của các chủng vi khuẩn, vi rút tạo ra nhiều chủng mới nguy hiểm; các bệnh nhiễm nấm, nhiễm khuẩn cơ hội ngày càng gia tăng ở bệnh nhân bị nhiễm HIV – AIDS, bệnh nhân cấy ghép cơ quan, bệnh nhân suy giảm miễn dịch do thuốc, do bệnh Tất cả những vấn đề trên đã đặt ra một yêu cầu bức thiết là phải thúc đẩy tìm kiếm nguồn kháng sinh mới nhằm đáp ứng tốt hơn, hiệu quả hơn cho việc điều trị và dự trữ. Tự nhiên là một kho thuốc tiềm tàng của nhân loại với những quan tâm mới nhắm vào các chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật. So với các kháng sinh tổng hợp, bán tổng hợp thì các chất kháng khuẩn từ thực vật có tiềm năng lớn vì chúng ít bị các vấn đề tác dụng phụ. Cao chiết từ thực vật đã được chứng minh có hoạt tính chống lại vi khuẩn, vi nấm và gần đây tác dụng kháng khuẩn của chúng đã được quan tâm và ứng dụng trong nhiều sản phẩm thuốc và mỹ phẩm. Cây Trinh nữ còn gọi là cây Mắc cỡ có tên khoa học là Mimosa pudica L., thuộc họ Đậu (Fabaceae). Theo y học cổ truyền, lá và rễ có khả năng chống vi khuẩn, trị lậu. Cây Trinh nữ thường dùng trị suy nhược thần kinh, viêm phế quản, viêm gan, viêm kết mạc. Cây dùng ngoài có khả năng trị chấn thương, viêm mủ da,... [4], [10]. Cây Lựu có tên khoa học là Punica granatum L., thuộc họ Lựu (Punicaceae). Các bộ phận của cây Lựu có khả năng chữa nhiều bệnh. Vỏ quả có tác dụng sáp 2 trường chỉ tả, chỉ huyết, khử trùng. Vỏ thân và vỏ rễ có tác dụng khử trùng, trừ sán. Trái chống nhiều siêu khuẩn,... [9]. Tính tới thời điểm hiện tại, trên thế giới cũng đã có một số công bố về sàng lọc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các chất chiết từ cây Trinh nữ và cây Lựu. Tuy nhiên, ở Việt Nam vẫn chưa có các công bố nào liên quan đến hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm