Luận văn Lựa chọn các điều kiện lên men xốp tối ưu và nghiên cứu đặc tính xylanase từ vi khuẩn ưa nhiệt

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ NHIÊN LỰA CHỌN CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN XỐP TỐI ƯU VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH XYLANASE TỪ VI KHUẨN ƯA NHIỆT LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ NHIÊN LỰA CHỌN CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN XỐP TỐI ƯU VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH XYLANASE TỪ VI KHUẨN ƯA NHIỆT Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. ĐÀO THỊ LƯƠNG Hà Nội - 2012 2 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo TS. Đào Thị Lương đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cám ơn Nghiên cứu sinh Trịnh Thành Trung và Nghiên cứu sinh Trần Thị Lệ Quyên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua. Xin chân thành cảm ơn TS. Dương Văn Hợp và các cán bộ của Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo và các cán bộ của Bộ môn Vi sinh vật học thuộc Khoa Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội. Xin cảm ơn Phòng Sau Đại học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội đã tạo nhiều điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn các thầy cô, bạn bè đồng nghiệp đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn. Và lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin dành cho gia đình và những người thân yêu của tôi đã luôn ủng hộ, động viên tôi trong suốt thời gian qua. Hà Nội, ngày 3 tháng 4 năm 2012 Tác giả Nguyễn Thị Nhiên 3 MỤC LỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1. Thành phần chất khô trong thực vật . 13 1.2. Các họ thuộc glyoside hy drolase (GHs) có hoạt động trên xylan (Collin & cộng sự, 2005)... 18 1.3. Một số nhóm vi sinh vật được dùng trong lên men xốp (Raimbault, 1998) .. 28 3.1. Hoạt tính xylanase của 26 chủng vi sinh vật nghiên cứu. 55 3.2. Khả năng chịu nhiệt của các chủng vi sinh vật. 56 3.3. Ảnh hưởng của các loại dịch chiết đến hiệu quả thu hồi enzyme xylanase ..................................................................................................... 73 3.4. Kết quả tủa enzyme xylanase của chủng 118 và B2H2 bằng các dung môi hữu cơ ........................................................................................................ 73 4 MỤC LỤC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1. Cấu trúc hóa học của xylan ........ 14 1.2. Cấu trúc xylan trong cây gỗ. ...... 16 1.3. Cấu trúc không gian xylanase của Bacillus subtilis........ 19 1.4. Các enzyme cần thiết phân cắt hoàn toàn xylan..... 20 1.5. Sự thủy phân thành tế bào thực vật bằng enzyme. .... 24 3.1. Vị trí phân loại của chủng B2H2 với các loài có quan hệ họ hàng gần ...... 57 3.2. Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng B2H2.......................... 58 3.3. Vị trí phân loại của chủng XK-118 với các loài có quan hệ họ hàng gần 59 3.4. Hình thái khuẩn lạc và cuống sinh bào tử chủng 118....... 60 3.5. Môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của 2 chủng B2H2 và 118 ..... 61 3.6. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của 2 chủng B2H2 và 118. 62 3.7. pH thích hợp cho sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme chủng B2H2 và 118... 63 3.8. Thời gian thích hợp cho giống khởi động của chủng B2H2 và 118.... 65 3.9. Cơ chất thích hợp cho quá trình tổng hợp xylanase của 2 chủng B2H2 và 118.. 66 3.10. Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng tổng hợp enzyme xylanase của 2 chủng B2H2 và 118 . 67 3.11. Thời gian nuôi cấy thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase của 2 chủng B2H2 và 118 ..... 68 3.12. Tỷ lệ giống cấy thích hợp cho khả năng sinh xylanase của chủng B2H2 và 118 69 3.13. Nguồn nitơ bổ sung thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase của chủng B2H2 và chủng 118 ........................................................................... 70 3.14. Mức độ ảnh hưởng của cao thịt đến khả năng tổng hợp xylanase của chủng B2H2 ............. 71 5 3.15. Mức độ ảnh hưởng của urea đến khả năng tổng hợp xylanase của chủng 118... 72 3.16. Nguồn cacbon bổ sung thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase của 2 chủng B2H2 và chủng 18 ............................................................................. 73 3.17. Lựa chọn hỗn hợp khoáng thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp xylanase của chủng B2H2 và chủng 118 ..................................................... 74 3.18. Sắc ký trao đổi ion DEAE sepharose mẫu enzyme tủa aceton của chủng 118 ...... 76 3.19. Sắc ký trao đổi ion sử dụng dịch enzyme của các phân đoạn có hoạt độ xylanase cao ở bước rửa cột....................................................................... 77 3.20. Điện di đồ trên gel hoạt độ mẫu enzyme thô có ME (1) và không có ME (2); mẫu enzyme tủa aceton có ME (3) và không có ME (4) ..................... 78 3.21. Điện di trên gel hoạt tính mẫu enzyme tủa aceton...................................... 79 3.22. Hoạt độ xylanase chủng 118 thu hồi được khi tủa trong muối ammonisunfat từ 30 đến 90% .................................................................... 80 3.23. Điện di trên gel SDS-PAGE và điện di trên gel hoạt độ mẫu enzyme tủa aceton và mẫu enzyme tủa ammonisunfat từ 30 đến 90% ......................... 80 3.24. Sắc ký trao đổi ion dịch enzyme tủa ammonisunfat 50% ......................... 81 3.25: Kết quả sắc ký trao đổi ion mẫu enzyme tủa ammonisunfat 80% ............ 82 3.26. Điện di SDS-PAGE mẫu enzyme tủa ammonisunfat 80%, E1 và E2 ........ 83 3.27. Dải pH thích hợp cho hoạt động của xylanase từ 118 .............................. 83 3.28. Nhiệt độ phản ứng tối ưu của enzyme xylanase từ chủng 118 .................. 84 3.29. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt động của enzyme xylanase từ 118 .............................................................................................................. 85 3.30. Khả năng chịu nhiệt của các enzyme xylanase từ chủng 118 ở 600C ........ 86 3.31. Khả năng bền nhiệt của hai loại xylanase tinh sạch từ chủng 118 ......... 86 3.32. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ xylanase của chủng B2H2 ........................ 87 3.33. Nhiệt độ thích hợp cho phản ứng enzyme xylanase từ chủng B2H2 .......... 88 3.34. Khả năng chịu nhiệt của enyme xylanase từ chủng B2H2 .. 88 3.35. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ xylanase .............................. 89 6 MỤC LỤC MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 11 1. Lý do lựa chọn đề tài .............................................................................................. 11 2. Nhiệm vụ và mục đích nghiên cứu ......................................................................... 12 3. Những đóng góp mới của đề tài ............................................................................. 12 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 13 1.1. XYLAN ................................................................................................................ 13 1.1.1. Xylan .................................................................................................... 13 1.1.2. Cấu trúc của xylan ............................................................................... 14 1.2.3. Tính chất của xylan .............................................................................. 15 1.2. ENZYME PHÂN GIẢI XYLAN - XYLANASE ............................................ 16 1.2.1. Nguồn gốc xylanase ............................................................................. 16 1.2.2. Phân loại xylanase ............................................................................... 17 1.2.3. Cấu trúc ................................................................................................ 18 1.2.4. Đặc tính của xylanase .......................................................................... 19 1.2.5. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt động của enzyme xylanase .... 21 1.2.5.1. Ảnh hưởng của một số ion kim loại ................................................. 21 1.2.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ .................................................................. 22 1.2.5.3. Ảnh hưởng của pH .......................................................................... 22 1.2.5.4. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa ..................... 23 1.2.6. Ứng dụng của xylanase ........................................................................ 23 1.2.6.1. Ứng dụng của xylanase trong công nghiệp thực phẩm .................... 23 1.2.6.2. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy .................................. 24 1.2.6.3. Ứng dụng của xylanase trong sản xuất nguyên liệu sinh học ........... 24 1.2.6.4. Ứng dụng trong công nghiệp vải sợi ............................................... 25 1.2.6.5. Ứng dụng trong nông nghiệp .......................................................... 25 1.2.6.6. Ứng dụng của xylanase trong xử lý môi trường ............................... 25 1.2.7. Vi sinh vật sinh xylanase ...................................................................... 26 1.3. LÊN MEN XỐP ................................................................................................... 26 1.3.1. Khái niệm lên men xốp......................................................................... 26 1.3.2. Ưu điểm của kỹ thuật lên men xốp ....................................................... 27 1.4. TINH SẠCH ENZYME XYLANASE ................................................................ 30 1.4.1. Tủa enzyme bằng muối ammonisunfat ................................................ 31 1.4.2. Tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ..................................................... 32 7 1.4.3. Sắc ký ................................................................................................... 33 1.4.3.1. Sắc ký lọc gel .................................................................................. 33 1.4.3.2. Sắc ký trao đổi ion .......................................................................... 34 1.4.3.3. Sắc ký ái lực ................................................................................... 35 1.4.3.4. Sắc ký tương tác kỵ nước ................................................................ 36 1.4.3.5. Các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC ............................. 36 1.4.4. Điện di .................................................................................................. 37 1.4.4.1. Điện di trên gel agarose ................................................................. 38 1.4.4.2. Điện di trên gel polyacrylamide ...................................................... 38 CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 40 2.1 CHỦNG VI SINH VẬT, MÔI TRƯỜNG VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ........ 40 2.1.1. Chủng vi sinh vật ................................................................................. 40 2.1.2. Môi trường nghiên cứu ........................................................................ 40 2.1.2.1. Môi trường nhân giống (g/l) ............................................................ 40 2.1.2.2. Môi trường nuôi dịch thể................................................................. 40 2.1.2.3. Môi trường kiểm tra hoạt độ enzyme ............................................... 41 2.1.2.4. Môi trường nuôi xốp ....................................................................... 41 2.1.3. Thiết bị nghiên cứu .............................................................................. 41 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................... 41 2.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính xylanase ........................................... 41 2.2.1.1. Phương pháp định tính (khuếch tán trên thạch) .............................. 41 2.2.1.2. Phương pháp định lượng................................................................. 42 2.2.2. Tuyển chọn chủng ................................................................................ 44 2.2.3. Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng ..................................... 44 2.2.4. Phương pháp phân loại ........................................................................ 44 2.2.4.1. Phương pháp phân loại vi khuẩn dựa vào đọc trình tự ADN ........... 44 2.2.4.2. Quan sát hình thái ........................................................................... 48 2.2.5 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase ở các chủng vi sinh vật nghiên cứu ................................................ 49 2.2.5.1. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase ở các chủng nghiên cứu .......................................................... 49 2.2.5.2. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase ở các chủng nghiên cứu................................................................. 49 2.2.6. Thu hồi enzyme .................................................................................... 51 8 2.2.6.1.Chiết enzyme .................................................................................... 51 2.2.6.2. Thu hồi enzyme bằng các dung môi hữu cơ ..................................... 51 2.2.7. Tinh sạch xylanase của chủng 118 ...................................................... 52 2.2.7.1. Tủa enzyme trong dung môi hữu cơ ................................................ 52 2.2.7.2. Tủa enzyme trong muối ammonisunfat ........................................... 52 2.2.7.3. Sắc ký trao đổi ion .......................................................................... 52 2.2.8. Điện di .................................................................................................. 53 2.2.8.1. Điện di trên gel SDS-PAGE ............................................................ 53 2.2.8.2. Điện di trên gel hoạt tính ................................................................ 53 2.2.9. Nghiên cứu đặc tính enzyme ................................................................ 54 2.2.9.1. pH thích hợp cho hoạt động của enzyme ........................................ 54 2.2.9.2.Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme .................................. 54 2.2.9.3. Khả năng bền nhiệt của enzyme ...................................................... 54 2.2.9.4. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ enzyme ..................... 54 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 54 3.1. KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN ................................................................................. 54 3.1.1. Lựa chọn các chủng có hoạt độ xylanase cao ...................................... 54 3.1.2. Lựa chọn các chủng vi sinh vật bền nhiệt có hoạt tính xylanase cao .. 55 3.2. PHÂN LOẠI .................................................................................................... 56 3.2.1. Chủng B2H2 .......................................................................................... 56 3.2.1.1. Phân tích trình tự ADNr 16S .......................................................... 56 3.2.1.2. Đặc điểm hình thái .......................................................................... 57 3.2.2. Chủng 118 ............................................................................................ 58 3.2.1.2. Phân tích trình tự ADNr 16S .......................................................... 58 3.2.1.3. Đặc điểm hình thái ......................................................................... 59 3.3. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ........................................................... 60 3.3.1. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống .................................................. 60 3.3.1.1. Môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng ....................................... 60 3.3.1.2. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng ............................................ 62 3.3.1.3. pH thích hợp cho sự sinh trưởng..................................................... 63 3.3.1.4. Thời gian thích hợp cho giống khởi động........................................ 64 3.3.2. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp ...................................................... 65 3.3.2.1. Lựa chọn cơ chất ............................................................................ 65 3.3.2.2. Lựa chọn độ ẩm thích hợp ............................................................... 65 9 3.3.2.4. Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp .................................................. 68 3.3.2.5. Lựa chọn nguồn nitơ bổ sung .......................................................... 68 3.3.2.6. Lựa chọn nguồn cacbon bổ sung ..................................................... 71 3.3.2.7. Lựa chọn loại khoáng thích hợp ...................................................... 72 3.4. THU HỒI ENZYME ........................................................................................... 72 3.4.1. Điều kiện thích hợp cho chiết enzyme .................................................. 72 3.4.2. Thu hồi enzyme bằng các dung môi hữu cơ ......................................... 73 3.5. TINH SẠCH ENZYME ...................................................................................... 74 3.5.1. Tinh sạch enzyme xylanase chủng 118 theo phương pháp sắc ký trao đổi ion .......................................................................................................... 74 3.5.2. Tinh sạch xylanase của chủng 118 bằng phương pháp tủa trong muối ammonisunfat bão hòa kết hợp với sắc ký trao đổi ion sepharose DEAE. .... 77 3.6.1. Đặc tính enzyme xylanase từ chủng 118 .............................................. 81 3.6.1.1. pH thích hợp ................................................................................... 81 3.6.1.2. Nhiệt độ thích hợp ........................................................................... 82 3.6.1.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại ...................................................... 83 3.6.1.4. Khả năng chịu nhiệt của enzyme ..................................................... 84 3.6.2. Đặc tính xylanase từ B2H2 ................................................................... 86 3.6.2.1. pH thích hợp ................................................................................... 86 3.5.2.2. Nhiệt độ .......................................................................................... 87 3.5.2.3. Bền nhiệt ......................................................................................... 88 3.5.2.4. Ảnh hưởng của ion kim loại ............................................................ 88 KẾT LUẬN .......................................................................................................... 90 KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 92 TIẾNG VIỆT ............................................................................................................... 92 TIẾNG ANH ............................................................................................................... 92 PHỤ LỤC ............................................................................................................. 96 10 BẢNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN HPLC : High Performance Liquid Chromatography (sắc ký lỏng hiệu năng cao) AD