Luận văn Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của Malachite Green và nhiệt độ lên một số chỉ tiêu sinh lý và men Cholinesterase của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)

i TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN THỊ BÍCH NHƢ NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG KẾT HỢP CỦA MALACHITE GREEN VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÝ VÀ MEN CHOLINESTERASE CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2010 i TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN THỊ BÍCH NHƢ NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG KẾT HỢP CỦA MALACHITE GREEN VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÝ VÀ MEN CHOLINESTERASE CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN PGs.Ts. NGUYỄN THANH PHƢƠNG 2010 i LỜI CẢM TẠ Tôi xin trân trọng gởi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Thanh Phƣơng đã tận tình hƣớng dẫn, động viên và cung cấp nhiều kiến thức quý báo đồng thời tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này. Xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô Đỗ Thị Thanh Hƣơng về những lời khuyên quí báu và sự hƣớng dẫn nhiệt tình trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. Chân thành cảm ơn chị Nguyễn Hƣơng Thùy và bạn Nguyễn Thị Kim Hà, Nguyễn Văn Toàn cán bộ bộ môn Dinh dƣỡng và Chế biến Thủy sản đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện thí nghiệm. Xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến các em sinh viên lớp liên thông Nuôi trồng Thủy sản Khóa 33 và Nuôi trồng Thủy sản Liên thông Khóa 35 đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Chân thành cảm ơn dự án “Nghiên cứu đƣợc thực hiện dƣới sự tài trợ kinh phí của dự án - PhysCAM” (Nghiên cứu Đào tạo về sinh lý động vật Thủy sản ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, 2007-2010 do DANIDA, Đan Mạch tài trợ) đã hỗ trợ kinh phí và phƣơng tiện cho tôi thực hiện đề tài này. Cám ơn các bạn lớp Cao học Nuôi Tồng Thủy sản K15 đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt khóa học. Cuối cùng xin đƣợc bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và những ngƣời than đã chia sẻ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trƣờng. Xin chân thành cảm ơn. ii TÓM TẮT Nghiên cứu về ảnh hƣởng kết hợp của nhiệt độ và MG thông qua xác định khả năng chịu nhiệt của cá tra và sự thay đổi của các chỉ tiêu huyết huyết học và men ChE trong điều kiện nhiệt độ khác nhau. Từ đó tiến hành thí nghiệm tìm hiểu sự ảnh hƣởng kết hợp của nhiệt độ và MG lên sự thay đổi một số chỉ tiêu huyết học và men ChE của cá tra (P.hypophthalmus). Thí nghiệm xác định ngƣỡng chịu đựng nhiệt độ và sự thay đổi của các chỉ tiêu sinh lý và hoạt tính của men ChE trong quá trình tăng và giảm nhiệt. Kết quả cho thấy trong điều kiện bình thƣờng thì hoạt tính men ChE trong não cao hơn trong huyết tƣơng và ChE chịu ảnh hƣởng bởi nhiệt độ theo xu hƣớng nhiệt độ tăng hoạt tính tăng và nhiệt độ càng giảm khả năng ức chế hoạt tính ChE càng mạnh. Các chỉ tiêu huyết học trong điều kiện bình thƣờng thì có xu hƣớng thấp hơn so với điều kiện nhiệt độ cao nhƣng một số chỉ tiêu (hemoglobin, MCV, MCH, MCHC) lại cao hơn so với điều kiện giảm nhiệt. Đồng thời cũng xác định ngƣỡng nhiệt độ trên của cá tra là 42 o C và ngƣỡng dƣới là 12 o C. Trong nghiên cứu này khoảng nhiệt độ (220C, 280C và 340C) đƣợc chọn là khoảng nhiệt độ thích hợp và nhiệt độ bƣớc đầu có sự ảnh hƣởng đến các chỉ tiêu huyết học và hoạt tính của enzyme ChE trong não và máu của cá tra. Thí nghiệm ảnh hƣởng kết hợp của nhiệt độ (220C, 280C và 340C) và MG (0,15ppm và 02ppm) lên một số chỉ tiêu huyết học và hoạt tính của enzyme ChE lên cá tra có trọng lƣợng từ 15-20gam. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu với 6 nghiệm thức và 3 lần lặp lại. Mật độ cá thí nghiệm 30 con/bể, thể tích nƣớc là 200 lít, có bố trí sục khí trong suốt thời gian thí nghiệm.Thời gian thí nghiệm kéo dài trong 14 ngày với 5 lần thu mẫu và mỗi lần thu 4 con/bể. Kết quả thí nghiệm cho thấy sự biến đổi của các chỉ tiêu huyết học trong điều kiện tiếp xúc với MG ở các khoảng nhiệt độ 22 o C, 28 o C và 34 o C biến động theo nhiều xu hƣớng khác nhau. Số lƣợng hồng cầu, tỉ lệ huyết sắc tố, MCH, MCV giảm khi tiếp xúc với MG ở các khoảng nhiệt độ khác nhau nhƣng số lƣợng bạch cầu và hemoglobin giảm sau 6 giờ và 72 giờ tiếp xúc và lại tăng vào các khoảng thời gian gần kết thúc thí nghiệm. Nhiệt độ làm ảnh hƣởng đến độc tính của MG, khi nhiệt độ tăng kết hợp với nồng độ MG cao thì khả năng ức chế ChE trong não càng mạnh. Riêng về hoạt tính của ChE trong máu có những biểu hiện theo nhiều xu hƣớng khác nhau theo nhiệt độ và nồng độ của MG và khả năng ức chế ChE trong máu cần có thời gian tiếp xúc dài hơn so với não. iii Abstract Study effect of MG and temperatune to some physiological parameters and the active of enzyme ChE of tra fish through determine the threshold of tolerated temperature, the changes of the physiological indicators and the active of enzyme ChE upon temperature of Tra fish (Pansianodon hypophthalmus) at the fry stage. From which determine the changes of some physiological indicators, enzyme ChE of Tra fish (Pangasianodon hypophthalmus) in different temperature ranges with different concentrations of MG. Determine the threshold of tolerated temperature, the changes of the physiological parameters and the active of enzyme ChE upon temperature of Tra fish (Pansianodon hypophthalmus) fingerlings (15-20g). Results showed that in normal conditions, the enzyme activity in brain higher in plasma and ChE influenced by temperature. When the temperature increase, the processing enzyme activity increased and temperature decrease the ability to inhibit the enzyme ChE increases. In this study, the effects of temperature (220C, 280C and 340C) on selected the blood parameters and the inhibition of cholinesterase (ChE) activity in bain and blood of Tra fish (P. hypophthalmus). Study the effects of MG (0,15ppm and 0,2ppm) and temperature (22 0 C, 28 0 C and 34 0 C) on hematology and and enzyme Cholinesterase on Tra fish (P.hypophthalmus) fingerlings (15-20g) were randomly designed in the laboratory of College of Aquacultute and Fisheries, Can Tho Universit. Fish were stocked at density of 30 individuals per 200 liters tank.The experiment was three replications in continuously aerated composite tank system and implemented for 14 days. Sampling was performed at 5 distinct points of time. Each time collect randomly four fish/tank, the last time harvest all fish left. The results showed that the quantity of erythrocyte, hematorite value, MCH and MCV decreased after exposed to MG at concentrations and different temperatures, but the quantity of white blood cells and hemoglobin decreased after 6 hours and 72 hours of exposure and increased in the period near the end of the experiment. Temperature affects the toxicity of MG, as the temperature increases associated with higher concentrations of MG, the ability to inhibition ChE in brain stronger. ChE activity in the blood manifesting in many different trends with temperature and the concentration of MG and institutional ability to inhibit blood exposure time should be longer than the brain. iv LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam kết luận văn này đƣợc hoàn thành trên kết quả nghiên cứu thực tế của tôi trong khuôn khổ dự án “Nghiên cứu đƣợc thực hiện dƣới sự tài trợ kinh phí của dự án - PhysCAM” (Nghiên cứu Đào tạo về sinh lý động vật Thủy sản ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, 2007-2010 do DANIDA, Đan Mạch tài trợ). Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào liên quan trong cùng lĩnh vực. Dự án có quyền sử dụng kết quả của luận văn này để phục vụ cho dự án. Trần Thị Bích Nhƣ v MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ...................................................................................................................i TÓM TẮT ...................................................................................................................... ii Abstract .......................................................................................................................... iii LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... iv MỤC LỤC ....................................................................................................................... v DANH SÁCH HÌNH....................................................................................................vii DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................ viii DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................ viii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.......................................................................................ix Phần 1: .............................................................................................................................1 ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................1 1.1 Giới thiệu...................................................................................................................1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ...............................................................................................2 1.3 Nội dung của đề tài ..................................................................................................2 1.4 Thời gian thực hiện ..................................................................................................2 Phần 2: .............................................................................................................................3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................................................3 2.1 Giới thiệu về Malachite green (MG) .....................................................................3 2.1.1 Sơ lƣợc về MG ......................................................................................................3 2.1.2 Đặc điểm hóa học .................................................................................................3 2.2. Một số nghiên cứu về ảnh hƣởng của MG lên một số đối tƣợng thủy sản ......5 2.3.1 Ảnh hƣởng của MG đến các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa ................................8 2.3 Một số nghiên cứu về men ChE .......................................................................... 11 Phần 3: .......................................................................................................................... 14 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................. 14 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ...................................................................... 14 3.2 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................... 14 3.3 Bố trí thí nghiệm ................................................................................................... 14 3.3.1 Xác định ngƣỡng chịu đựng nhiệt độ và sự thay đổi của các chỉ tiêu sinh lý và hoạt tính của men ChE theo nhiệt độ của cá tra (P. hypophthalmus) ............. 14 3.3.2 Xác định ảnh hƣởng của MG và nhiệt độ lên các chỉ tiêu huyết học và men ChE. .................................................................................................................. 15 3.4 Phƣơng pháp phân tích ........................................................................................ 17 3.4.1 Phƣơng pháp phân tích mẫu ............................................................................. 17 3.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu .................................................................................. 21 Chƣơng 4 ...................................................................................................................... 22 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................... 22 4.1 Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên chỉ tiêu huyết học và men ChE lên cá tra ......... 22 4.1.1 Nhiệt độ ảnh hƣởng đến hoạt động của cá...................................................... 22 4.1.2.1 Các chỉ tiêu huyết học .................................................................................... 22 4.1.2.2 Hoạt tính của enzyme ChE ............................................................................ 24 4.1.3.1 Các chỉ tiêu huyết học .................................................................................... 26 4.1.3.2 Hoạt tính của enzyme ChE ........................................................................... 27 4.2 Ảnh hƣởng của nhiệt độ và MG lên một số chỉ tiêu huyết học và men ChE 30 vi 4.2.1Các yếu tố môi trƣờng bể thí nghiệm ............................................................... 30 4.2.2 Biểu hiện lâm sàng của cá khi tiếp xúc với MG ........................................... 30 4.2.3 Ảnh hƣởng của MG và nhiệt độ lên các chỉ tiêu huyết học ......................... 32 4.2.3.1 Ảnh hƣởng của MG và nhiệt độ lên số lƣợng hồng cầu ............................ 32 4.2.3.2 Ảnh hƣởng của MG và nhiệt độ lên tổng bạch cầu .................................... 34 4.2.3.3 Tỷ lệ huyết sắc tố (hematocrite) ................................................................... 35 4.2.3.4 Khối lƣợng trung bình của huyết sắc tố trong hồng cầu (MCH) ............. 37 4.2.3.5 Nồng độ của huyết sắc tố trong hồng cầu – MCHC (%) ........................... 38 2.3.6 Thể tích hồng cầu – MCV (µm3) ..................................................................... 39 4.2.3.7 Số lƣợng của huyết sắc tố (Hemoglobin) .................................................... 40 4.2.4 Ảnh hƣởng của nhiệt độ và MG lên hoạt tính của men ChE ....................... 42 4.2.4.1 Hoạt tính men ChE não .................................................................................. 42 4.2.4.2 Hoạt tính men ChE trong máu ...................................................................... 44 Phần 5 ............................................................................................................................ 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT....................................................................................... 46 5.1 Kết luận .................................................................................................................. 46 5.2 Đề xuất .................................................................................................................. 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 47 Phụ lục A ...................................................................................................................... 51 Phụ lục B....................................................................................................................... 55 Phụ lục C....................................................................................................................... 61 vii DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Công thức cấu tạo của MG (Oxolate) .......................................................3 Hình 2.2: Ba dạng của MG ..........................................................................................4 Hình 2.3: Sự biến đổi của MG.....................................................................................5 Hình 2.4: Sự thay đổi của một số chỉ tiêu máu ở cá (Heteropneustes fossilis) .....8 Hình 3.1: Buồng đếm Neubauer............................................................................... 18 Hình 3.2 Cách làm kính phết ................................................................................... 19 Hình 4.1: Ảnh hƣởng của nhiệt độ tăng lên hoạt tính ChE ở não và máu ......... 25 Hình 4.2: Hoạt tính của men ChE trong não và máu cá tra khi giảm nhiệt độ .. 28 Hình 4.3: Biến động số lƣợng hồng cầu ảnh hƣởng bởi nhiệt độ và MG ........... 33 Hình 4.5: Ảnh hƣởng của của nhiệt độ và MG lên ChE trong não ...................... 44 Hình 4.6: Ảnh hƣởng của của nhiệt độ và MG lên ChE trong máu .................... 45 viii DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Các giá trị LC0 , LC50 and LC100 (mg/l) của malachite greens ..........6 Bảng 2.2: Giá trị LC50 của một số loài cá khác nhau khi tiếp xúc với MG. .........7 Bảng 4.1: Số cá chết khi tiến hành tăng và giảm nhiệt ........................................ 22 Bảng 4.2: Biến động các chỉ tiêu huyết học khi tiến hành tăng nhiệt ................... 24 Bảng 4.3: Hoạt tính của men ChE khi tiến hành tăng nhiệt ................................... 25 Bảng 4.4: Biến động các chỉ tiêu huyết học khi tiến hành giảm nhiệt .................. 27 Bảng 4.5:Hoạt tính của men ChE khi tiến hành giảm nhiệt ................................... 28 Bảng 4.6: Biến động các yếu tố môi trƣờng trong quá trình thí nghiệm .............. 31 Bảng 4.7:Ảnh hƣởng của nhiệt độ và MG lên số lƣợng hồng cầu ........................ 33 Bảng 4.8:Ảnh hƣởng của nhiệt độ và MG lên số lƣợng bạch cầu cầu ............... 336 Bảng 4.9:Ảnh hƣởng của nhiệt độ và MG lên tỉ lệ huyết cầu ................................ 36 Bảng 4.10:Ảnh hƣởng của nhiệt độ và MG lên MCH ............................................ 37 Bảng 4.11:Ảnh hƣởng của nhiệt độ và MG lên MCHC ......................................... 39 Bảng 4.12:Ảnh hƣởng của nhiệt độ và MG lên MCV ............................................ 40 Bảng 4.13:Ảnh hƣởng của nhiệt độ và MG lên hemoglobin ................................. 41 Bảng 4.14: Ảnh hƣởng của nhiệt độ và MG lên hoạt tính của enzyme ChE ..............................................................43Error! Bookmark not defined. Bảng 4.15: Ảnh hƣởng của nhiệt độ và MG lên hoạt tính của enzyme ChE .... 455 ix DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT MG Malachite green LMG Leucomalachite Green ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu long VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm NTTS Nuôi trồng thủy sản KST Ký sinh trùng CPSH Chế phẩm sinh học AFB1 Aflatoxin B1 ChE Cholinesterase BuChE Butyl cholineseterase AChE Acetylcholineseterase NT Nghiệm thức MCV Thể tích hồng cầu MCH Khối lƣợng hồng cầu MCHC Nồng độ của huyết sắc tố trong hồng cầu DTNB Dithiobisnitrobenzoate 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Trong những năm gần đây, nuôi trồng thủy sản đang phát triển mạnh trên nhiều khía cạnh khác nhau nhƣ gia tăng diện tích, phát triển nhiều mô hình nuôi, tăng mức độ thâm canh với nhiều đối tƣợng nuôi khác nhau. Trong các đối tƣợng nuôi thì cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là một trong những đối tƣợng đang đƣợc chú ý phát triển ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) hiện nay. Tuy nhiên, do tập trung quá vào mức độ thâm canh và nâng cao năng suất nên đã làm gia tăng sự sử dụng thuốc và hóa chất để kiểm soát môi trƣờng, phòng và trị bệnh ngày càng trở nên phổ biến. Thế nhƣng, việc sản xuất, kinh doanh, sử dụng và quản lý thuốc, hóa chất và các chế phẩm sinh học dùng trong nuôi trồng thủy sản còn có nhiều hạn chế do sự hiểu biết của ngƣời nuôi, ngƣời cung cấp dịch vụ cũng nhƣ sự hỗ trợ của cơ quan khuyến ngƣ và nhà quản lý khác còn có giới hạn. Vấn đề tồn lƣu kháng sinh trong các sản phẩm thủy sản ngày càng trở nên phổ biến và là nguy cơ ảnh hƣởng đến vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP). Hƣớng tới vấn đề VSATTP trong các sản phẩm thuỷ sản, Bộ Thủy sản đã ra quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ban hành ngày 24 tháng 2 năm 2005 quy định danh mục 17 loại hóa chất kháng sinh cấm sử dụng và danh mục 34 loại hạn chế sử dụng trong sản xuất kinh doanh thủy sản, trong đó có Malachite green (MG). MG đã đƣợc sử dụng rộng rãi từ lâu và đƣợc dùng rất phổ biến với tác dụng là xử lý nƣớc, sát nấm (loại Saprolegnia ssp) cũng nhƣ để sát ký sinh trùng nhóm nguyên sinh vật (Protozoa) và bệnh nấm ký sinh trên trứng cá, cá và cá