Luận văn Nghiên cứu đặc trưng protein của virus gây hội chứng đỏ đuôi ở tôm sú (penaeus monodon) và tôm thẻ chân trắng (penaeus vannamei)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** ĐẶNG TRỊNH MINH ANH NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƢNG PROTEIN CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỎ ĐUÔI Ở TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƢNG PROTEIN CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỎ ĐUÔI Ở TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. VĂN THỊ HẠNH ĐẶNG TRỊNH MINH ANH TS. NGUYỄN NGỌC HẢI KHÓA: 2002 – 2006 CN. LÊ PHÚC CHIẾN Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  RESEARCHING SPECIFIC PROTEIN OF RED TAIL VIRUS IN BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) AND PACIFIC WHITE SHRIMP (Penaeus vannamei) GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Ph.D. VAN THI HANH DANG TRINH MINH ANH Ph.D. NGUYEN NGOC HAI TERM: 2002 - 2006 BSc. LE PHUC CHIEN HCMC, 09/2006 iv LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua. TS. Văn Thị Hạnh đã hết lòng hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. TS. Nguyễn Ngọc Hải đã truyền đạt kiến thức và tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập tốt nghiệp. CN. Đỗ Thị Tuyến thuộc phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học - Viện Sinh Học Nhiệt Đới. Anh Lê Phúc Chiến, chị Phạm Thị Hạnh thuộc phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật - Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã nhiệt tình giúp đỡ, và hướng dẫn trong quá trình thực tập. Những gì mà tôi học được trong thời gian thực hiện đề tài tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới là những bài học thực tế mà tôi sẽ không thể nào quên. Các bạn bè thân yêu của lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 28 và các bạn cùng phòng đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ, động viên tôi trong thời gian thực tập. Tp Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 08 năm 2006. Đặng Trịnh Minh Anh v TÓM TẮT ĐẶNG TRỊNH MINH ANH, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2006. “NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƢNG PROTEIN CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỎ ĐUÔI Ở TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei)” Hội đồng hướng dẫn:  TS. Văn Thị Hạnh  TS. Nguyễn Ngọc Hải  CN. Lê Phúc Chiến Khoá luận được thực hiện tại Phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh Học Nhiệt Đới là 1 phần của đề tài “Nghiên cứu hội trứng Taura ở tôm thẻ chân trắng và mối liên quan với tác nhân gây hội chứng đỏ đuôi ở tôm sú và tôm càng xanh”. Nguồn virus ban đầu đã được phòng thí nghiệm phân lập và nhân lên trong tế bào côn trùng Sf9. Nội dung của khoá luận là: Xác định đặc trưng protein của Red - Tail Virus (RTV) bằng kỹ thuật SDS-PAGE và Western Blot. Sau đó kiểm tra khả năng gây nhiễm thực nghiệm trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng của RTV được nhân lên trong tế bào côn trùng Sf9. Bước tiếp theo là tiến hành thăm dò khả năng phân tách các thành phần protein của virus bằng phương pháp sắc ký lọc gel để phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo. Những kết quả thu được: 1. Sử dụng RTV thu từ tôm sú và tôm thẻ chân trắng được nhân lên trong tế bào côn trùng Sf9 gây nhiễm trở lại cho tôm sú và tôm thẻ thành công. 2. Xác định được các protein của RTV thu từ tôm sú và tôm thẻ được nuôi cấy trong tế bào côn trùng Sf9 bằng kỹ thuật điện di gel Sodium dodecyl sulfate – Polyacrylamide (SDS-PAGE) và điện di miễn dịch (Western Blot) vi MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ ..................................................................................................................... iv Tóm tắt .......................................................................................................................... . v Mục lục ......................................................................................................................... .vi Danh mục các chữ viết tắt .......................................................................................... ...ix Danh mục các hình ....................................................................................................... .x Danh mục các bảng....................................................................................................... .xi PHẦN 1. MỞ ĐẦU ..................................................................................................... ..1 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... ..3 2.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới ........................................................................... ..3 2.1.1 Hiện trạng chung ............................................................................................. ..3 2.1.2 Thiệt hại do TSV trên thế giới ........................................................................ ..4 2.2 Tình hình nuôi tôm tại Việt Nam ........................................................................... ..4 2.2.1 Hiện trạng chung ............................................................................................. ..4 2.2.2 Thiệt hại do TSV tại Việt Nam ....................................................................... ..5 2.3 Giới thiệu hội chứng Taura – TS (Taura syndrome) .............................................. ..6 2.3.1 Lịch sử và phân bố hội chứng Taura ............................................................ ..6 2.3.2 Phân loại và tên gọi ...................................................................................... ..7 2.3.2.1 Tên gọi .................................................................................................. ..7 2.3.2.2 Vị trí phân loại ...................................................................................... ..7 2.3.3 Đặc điểm cấu trúc và genom của TSV ........................................................ ..7 2.3.4 Biểu hiện bệnh hội chứng Taura ở tôm ......................................................... ..8 2.3.5 Vật chủ .......................................................................................................... ..9 2.3.6 Sự đa dạng di truyền và sự xuất hiện các chủng TSV mới ........................... 10 2.3.6.1 Sự đa dạng di truyền của TSV ............................................................... 10 2.3.6.2 Sự xuất hiện các chủng TSV mới .......................................................... 10 vii 2.3.7 Khả năng lây truyền của virus Taura ............................................................ 12 2.3.8 Một số đặc tính của virus Taura với các yếu tố lý hóa.................................. 12 2.4 Các phương pháp và kỹ thuật chuẩn đoán virus Taura .......................................... 13 2.4.1 Chuẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng ................................................... 13 2.4.2 Phương pháp mô học ..................................................................................... 14 2.4.3 Phương pháp cảm nhiễm sinh học ................................................................ 14 2.4.4 Phương pháp miễn dịch ................................................................................. 14 2.4.5 Phương pháp chuẩn đoán bằng mẫu dò gen (gene probe) ............................ 14 2.4.6 Phương pháp RT-PCR ............................................................................... 15 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................................. 16 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................................... 16 3.2 Hoá chất, thiết bị, dụng cụ và vật liệu ................................................................... 16 3.2.1 Hóa chất ......................................................................................................... 16 3.2.1.1 Các hoá chất để thực hiện sắc ký lọc gel .................................................. 16 3.2.1.2 Các dung dịch gốc để thực hiện SDS-PAGE .......................................... 16 3.2.1.3 Các dung dịch gốc để nhuộm gel ............................................................ 16 3.2.1.4 Các dung dịch gốc để thực hiện Western Blotting .................................. 16 3.2.1.5 Các dung dịch để thực hiện Dot Blot ...................................................... 17 3.2.2 Thiết bị, dụng cụ .......................................................................................... 17 3.2.3 Vật liệu .......................................................................................................... 18 3.2.3.1 Kháng thể ................................................................................................ 18 3.2.3.1 Mẫu........................................................................................................... 18 3.3 Phương pháp ......................................................................................................... 18 3.3.1 Phương pháp SDS–PAGE ............................................................................. 18 3.3.1 Phương pháp SDS–PAGE ....................................................................................... 18 3.3.1.1 Nguyên tắc............................................................................................... 18 3.3.1.2 Phương pháp tiến hành ........................................................................... 20 3.3.2 Phương pháp Western Blot ........................................................................ 21 viii 3.3.2.1 Nguyên tắc............................................................................................... 21 3.3.2.2 Phương pháp tiến hành ............................................................................ 23 3.3.3 Gây nhiễm thực nghiệm cho tôm sú (Penaeus monodon) và tôm thẻ (Penaeus vannamei) bằng RTV được nhân lên trong tế bào Sf9 ................................................. 26 3.3.4 Phương pháp Dot Blot ................................................................................... 27 3.3.4.1 Nguyên tắc............................................................................................... 27 3.3.4.2 Phương pháp tiến hành .............................................................................. 27 3.3.5 Phương pháp sắc ký ................................................................................... 28 3.3.5.1 Nguyên tắc ............................................................................................. 28 3.3.5.2. Phương pháp tiến hành ............................................................................ 29 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 30 4.1 Kết quả SDS – PAGE ...................................................................................... 30 4.2 Kết quả Western Blot ...................................................................................... 32 4.3 Kết quả thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm ................................................... 34 4.4 Kết quả Dot Blot chỉ thị virus .......................................................................... 37 4.5 Kết quả sắc ký lọc gel ...................................................................................... 40 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 42 5.1 Kết luận ........................................................................................................... 42 5.2 Đề nghị ............................................................................................................ 42 PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................... 43 PHỤ LỤC 1 ................................................................................................................. 47 PHỤ LỤC 2 ................................................................................................................. 48 PHỤ LỤC 3 ................................................................................................................. 50 PHỤ LỤC 4 ................................................................................................................. 52 ix DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 1. APS Ammmonium persulphate 2. bp: Base pair 3. DNA: Deoxyribonucleic acid 4. DAB: 3,3’- Diaminobenzidinetetrahydrochloride 5. LOS: Lymphoid Organ Syndrome 6. IHHNV: Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus 7. MBV: Monodon Baculovirus 8. Kb: Kilo base 9. KDa: Kilo Dalton 10. PAb: Polyclonal Antibody 11. PBS: Phosphate Buffered Saline 12. PCR: Polymerase Chain Reaction 13. PL: Post larvae 14. RNA: Ribonucleic acid 15. RT-PCR: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction 16. RTV: Red - Tail Virus 17. ORF: Open Reading Frame 18. OIE: Office International Des Epizooties (Tổ chức dịch tễ thế giới) 19. SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis 20. Sf9: Sepodoptera frugiperda 21. SPF: Specific Pathogen Free (Sạch bệnh) 22. TCT: Tôm thẻ chân trắng 23. TEMED: N, N, N’, N’ – tetramethylethylenediamine 24. TTBS: Tween tris buffer saline 25. TSV: Taura Syndrome Virus 26. YHV Yellow Head Virus 27. WSSV: White Spot Syndrome Virus x DANH MỤC CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Sự phân bố của TSV trên thế giới ................................................................ ..6 Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc bộ gen của TSV ................................................................... ..8 Hình 2.3: Tôm bị nhiễm TSV ....................................................................................... ..9 Hình 2.4: cây phát sinh loài của 40 phân lập TSV dựa vào trình tự aa của VP2 ......... 10 Hình 2.5: Cây phát sinh loài theo đoạn ORF2 (1011aa) của 6 chủng TSV ................. 11 Hình 3.1: Các bước thực hiện Western Blot................................................................. 21 Hình 3.2: Cách lắp ráp gel và màng nitrocellulose ...................................................... 22 Hình 3.3: Sơ đồ hệ thống chẩn đoán miễn dịch ......................................................... 28 Hình 4.1: Kết quả SDS – PAGE ................................................................................... 30 Hình 4.2: Kết quả Western Blot ................................................................................... 32 Hình 4.3: Tôm thẻ không gây nhiễm và tôm thẻ gây nhiễm ........................................ 34 Hình 4.4: Tôm thẻ chết do gây nhiễm thực nghiệm với RTV ...................................... 35 Hình 4.5: Ảnh chụp hiển vi tôm sú đối chứng nuôi trong phòng thí nghiệm (x40) ..... 36 Hình 4.6: Ảnh chụp hiển vi tôm sú nhiễm thực nghiệm với dịch tế bào nhiễm RTV . 36 Hình 4.7: Ảnh chụp hiển vi phần đuôi tôm sú nhiễm thực nghiệm với dịch tế bào nhiễm RTV ................................................................................................................... 36 Hình 4.8: Tôm sú giống gây nhiễm nhiễm thực nghiệm với RTV ............................. 37 Hình 4.9: Chỉ thị mức độ bệnh theo phương pháp Dot Blot ........................................ 37 Hình 4.10: Kết quả kiểm tra tôm thẻ trước khi gây nhiễm ........................................... 38 Hình 4.11: Kết quả kiểm tra tôm sú giống trước khi gây nhiễm .................................. 38 Hình 4.12: Kết quả kiểm tra tôm thẻ sau khi gây nhiễm .............................................. 38 Hình 4.13: Kết quả kiểm tra tôm sú giống sau khi gây nhiễm ..................................... 39 Hình 4.14: Kết quả dịch tế bào (DTB) Sf9 ................................................................... 40 Hình 4.15: Kết quả DTB nhiễm virus từ tôm sú Long An bị bệnh RTV (RT-PmLA).40 Hình 4.16: Kết quả DTB nhiễm RTV từ tôm thẻ chân trắng bị bệnh RTV (RTV-PvM) . ...................................................................................................................................... 41 xi DANH MỤC CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1: Sản lượng tôm tôm thế giới năm 2002-2003 ............................................... ..3 Bảng 2.2: Sản lượng tôm nuôi ở Việt Nam qua các năm ............................................. ..5 Bảng 2.3: Các phương pháp chuẩn đoán TSV ............................................................ 13 Bảng 3.1: Các mẫu sử dụng .......................................................................................... 18 Bảng 4.1: So sánh trọng lượng các protein của RTV sau khi SDS-PAGE và trọng lượng của các protein đã được công bố ........................................................................ 31 Bảng 4.2: So sánh trọng lượng các protein của RTV sau khi Western Bloting và trọng lượng của các protein đã được công bố ........................................................................ 33 Bảng 4.3: Số tôm thẻ sống sót sau ba tuần gây nhiễm ................................................. 34 Bảng 4.4: Số tôm sú sống sót sau hai tuần gây nhiễm ................................................. 35 1 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU Nuôi tôm đang là thế mạnh của ngành thủy sản nước ta. Từ năm 1995 nghề nuôi tôm nước ta phát triển mạnh mẽ cả về diện tích, hình thức nuôi, năng suất, sản lượng và hiệu quả kinh tế. Cụ thể là năm 2004 diện tích tôm nuôi đạt hơn 460.000ha, tổng sản lượng đạt 350.000 tấn và là nguồn cung cấp nguyên liệu quan trọng cho chế biến xuất khẩu thủy sản. Nghề nuôi tôm đã thực sự trở thành một trong những nghề sản xuất hàng hóa lớn của Việt Nam. Tuy nhiên cùng với sự phát triển của nghề nuôi tôm, dịch bệnh do virus gây ra cũng liên tục lan rộng và gây thiệt hại nặng nề về kinh tế. Trong khi đó, những nghiên cứu về virus tôm còn rất hạn chế. Vì vậy, việc nghiên cứu tác nhân virus gây bệnh nhằm đề xuất giải pháp hạn chế tác nhân này là một yêu cầu cấp bách hiện nay. Bên cạnh đó, việc khai thác tiềm năng và phát triển thêm các chủng loại tôm nuôi khác để đa dạng hóa các sản phẩm tôm thương mại, tận dụng tối đa điều kiện tự nhiên và nhân lực ở các vùng ven biển cũng là vấn đề hiện đang rất được nhà nước quan tâm. Năm 2001 Việt Nam bắt đầu du nhập tôm thẻ chân trắng (P. vannamei) từ Đài Loan và Hawaii vào nuôi thử nghiệm ở một số vùng. Tôm thẻ chân trắng có những ưu thế so với tôm sú như chủ động về nguồn giống, thời gian nuôi ngắn hơn nhưng năng suất tương đương tôm sú, chịu được độ mặn cao và có thể nuôi được trong cả nước mặn, ngọt và lợ… Tuy nhiên việc nhập nuôi loài tôm này gắn liền với việc đưa virus hội chứng Taura (Taura Syndrome Virus – TSV) vào Việt Nam. Để tránh không xảy ra dịch bệnh như đã có đối với các nước từng du nhập tôm thẻ chân trắng (TCT) thì những thông tin đầy đủ về bệnh hội chứng Taura và khả năng lây lan TSV từ tôm này sang các loài tôm bản địa khác, đặc biệt đối với tôm sú, cũng là vấn đề rất được quan tâm. Năm 2000 Phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh Học Nhiệt Đới thu được mẫu tôm sú ở Long An nghi nhiễm TSV, với biểu hiện lâm sàng là đỏ đuôi quạt và đỏ 2 đốt thân cuối. Tôm còn sống nhưng vận động và tiêu thụ thức ăn kém. Các mẫu tương tự sau đó đã thu được ở Cần Giờ - Tp. Hồ Chí Minh. Năm 2003 phòng thí nghiệm cũng thu được mẫu tôm TCT với biểu hiện lâm sàng tương tự. Tất cả các mẫu tôm này đã được kiểm tra bằng phương pháp PCR