Luận văn Nghiên cứu nhân giống các dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56 giữa Eucaliptus urophylla và E exsertar bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ------------------------ ----------------------- ĐẶNG NGỌC HÙNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN LAI UE35 VÀ UE56 GIỮA EUCALYPTUS UROPHYLLA VÀ E. EXSERTA BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ LUẬN VĂN THẠC SỸ LÂM SINH THÁI NGUYÊN – NĂM 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ------------------------ ----------------------- ĐẶNG NGỌC HÙNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN LAI UE35 VÀ UE56 GIỮA EUCALYPTUS UROPHYLLA VÀ E. EXSERTA BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ CHUYÊN NGÀNH: LÂM HỌC MÃ SỐ: 60.62.60 LUẬN VĂN THẠC SỸ LÂM SINH NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS. LÊ ĐÌNH KHẢ THS. ĐOÀN THỊ MAI THÁI NGUYÊN – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Lời nói đầu Danh mục bảng Danh mục biểu đồ Danh mục hình ảnh Danh mục các ký hiệu, các từ viết tắt MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ...................................... 3 1.1. Khái niệm về nhân giống lai trong lâm nghiệp ........................................... 3 1.2. Khái niệm về nuôi cấy mô và nhân giống cây Lâm nghiệp ......................... 3 1.3. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào ................................ 4 1.3.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật ............................................................ 4 1.3.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào................................................. 4 1.4. Các nhân tố ảnh hƣởng tới quá trình nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào ........ 6 1.4.1. Môi trường nuôi cấy ................................................................................... 6 1.4.2. Các chất điều hoà sinh trưởng.................................................................... 8 1.4.3. Môi trường vật lý ........................................................................................ 10 1.4.4. Vật liệu nuôi cấy ......................................................................................... 11 1.4.5. Điều kiện vô trùng ...................................................................................... 11 1.4.6. Buồng nuôi cấy ........................................................................................... 12 1.5. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống ........................................ 12 1.5.1. Giai đoạn chuẩn bị ..................................................................................... 12 1.5.2. Giai đoạn cấy khởi động ............................................................................. 13 1.5.3. Giai đoạn nhân nhanh ................................................................................ 13 1.5.4. Tạo cây hoàn chỉnh (ra rễ) ........................................................................ 14 1.5.5. Đưa cây ra môi trường tự nhiên ................................................................. 14 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1.6. Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) và Bạch đàn liễu (E. exserta) ........... 16 1.6.1. Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla)......................................................... 16 1.6.2. Bạch đàn liễu (Eucalyptus exserta) ............................................................ 17 1.6.3. Bạch đàn lai ................................................................................................ 17 1.6.4. Nhân giống Bạch đàn bằng nuôi cấy mô ................................................... 20 1.7. Một số kết quả nổi bật về nuôi cấy mô cây thân gỗ và Bạch đàn ............... 21 1.7.1. Trên thế giới................................................................................................ 21 1.7.2. Nhân giống cây gỗ bằng phương pháp nuôi cấy mô ở Việt Nam ............... 25 CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................................................... 28 2.1. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 28 2.2. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................... 28 2.2.1. Một số đặc điểm chính của dòng UE35 và dòng UE56 .............................. 28 2.2.2. Cây mẹ lấy vật liệu ...................................................................................... 28 2.2.3. Vật liệu nuôi cấy (mẫu cấy) ........................................................................ 29 2.3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 29 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 30 2.4.1. Chọn loại môi trường phù hợp ................................................................... 31 2.4.2. Ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi ban đầu..................... 31 2.4.3. Ảnh hưởng của vitamin B2 đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu .... 32 2.4.4. Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng đến hệ số nhân chồi (HSNC) và chất lượng chồi (TLCHH) ............................................................................... 32 2.4.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH ................................. 32 2.4.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP+IAA đến HSNC và TLCHH ........................ 33 2.4.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + NAA đến HSNC và TLCHH ..................... 34 2.4.4.4. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + Kinetin đến HSNC và TLCHH ................. 34 2.4.4.5. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + Kinetin + NAA đến HSNC và TLCHH ..... 35 2.4.4.6. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài trung bình của rễ ............................................................................................. 35 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.4.4.7. Ảnh hưởng của nồng độ IBA+ ABT1 đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài trung bình của rễ .............................................................................. 36 2.4.4.8. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao cây con ở vườn ươm ........................................................................................................... 36 2.4.4.9. Điều kiện thí nghiệm ................................................................................. 37 2.4.5. Bố trí thí nghiệm ......................................................................................... 38 2.4.6. Thu thập và xử lý số liệu ............................................................................. 38 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 41 3.1. Khử trùng mẫu cấy ....................................................................................... 41 3.2. Ảnh hƣởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi ban đầu ...................... 43 3.3. Nghiên cứu loại môi trƣờng thích hợp cho nhân nhanh chồi ..................... 44 3.4. Ảnh hƣởng của việc bổ sung vitamine B2 vào môi trƣờng MS* đến HSNC và TLCHH ........................................................................................................... 46 3.5. Ảnh hƣởng của chất điều hoà sinh trƣởng trong môi trƣờng MS* đến HSNC và TLCHH ............................................................................................... 50 3.5.1. Ảnh hưởng của BAP đến HSNC và TLCHH ............................................. 50 3.5.2. Ảnh hưởng phối hợp của BAP + IAA đến HSNC và TLCHH ................... 52 3.5.3. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA trong môi trường MS* đến HSNC và TLCHH .......................................................................................... 55 3.5.4. Ảnh hưởng của sự phối hợp BAP + Kinetin đến HSNC và TLCHH ......... 58 3.5.5. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến HSNC và TLCHH ................................................................................................................. 60 3.5.6. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ IBA trong môi trường 1/2 MS* tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài của rễ ............................................. 63 3.5.7. Ảnh hưởng của tổ hợp IAA + ABT1 đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài của rễ ................................................................................. 66 3.5.8. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao của cây con ở vườn ươm.................................................................................................... 68 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Chƣơng 4: KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ ........................................ 72 4.1. Kết luận ......................................................................................................... 72 4.2. Tồn tại ........................................................................................................... 72 4.3. Kiến nghị ....................................................................................................... 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 75 Tài liệu tiếng việt ................................................................................................ 75 Tài liệu tiếng Anh ................................................................................................ 77 Phụ Lục Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI NÓI ĐẦU Nâng cao chất lượng đào tạo bằng nghiên cứu khoa học là mục tiêu quan trọng trong việc đào tạo cao học của Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Để hoàn thành chương trình đào tạo cao học Lâm nghiệp khoá học 2006-2009, được sự đồng ý của Khoa sau đại học - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp “Nghiên cứu nhân giống các dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56 giữa Eucaliptus urophylla và E. exsertar bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào”. Sau thời gian học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi đã nhận được sự quan tâm và giúp đỡ tận tình về nhiều mặt của Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên, đặc biệt là khoa sau đại học, cùng các thầy cô giáo trực tiếp giảng dạy, cũng như lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp Hà Nội, bộ môn công nghệ tế bào thuộc Viện khoa học sự sống - trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các thầy cô giáo, đặc biệt là GS.TS. Lê Đình Khả, Th.s. Đoàn Thị Mai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến tất cả bạn bè đồng nghiệp và người thân đã giúp đỡ tôi có được bản luận văn này. Nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào là một vấn đề khó trong nghiên cứu ứng dụng sản xuất giống cây lâm nghiệp. Việc nghiên cứu nhân giống một số dòng Bạch đàn lai nói trên trong đề tài nhằm góp phần xây dựng cơ sở hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất cây với số lượng lớn, đồng đều, có chất lượng cao do vậy không thể tránh khỏi những khiếm khuyết, rất mong được sự chỉ bảo bổ sung ý kiến của các nhà khoa học, các bạn đồng nghiệp để công trình nghiên cứu này được hoàn thiện. Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 4 năm 2009 Tác giả Đặng Ngọc Hùng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên bảng Trang 3.1a Bảng tổng hợp kết quả khử trùng mẫu của dòng UE35 (180 mẫu) …... 41 3.1b Bảng tổng hợp kết quả khử trùng mẫu của dòng UE56 (180 mẫu) ….... 42 3.2 Bảng ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi…………….... 43 3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của 5 loại môi trường đến HSNC và TLCHH của dòng UE35 và UE56 (tổng số 180 mẫu/môi trường) …….…. 44 3.4 Ảnh hưởng của việc bổ sung vitamine B2 đến HSNC và TLCHH của UE35 và UE56 (180 mẫu cấy/công thức) …………………………….. 47 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH của Bạch đàn lai dòng UE35 và UE56 (180 mẫu/công thức) …………………….……... 51 3.6 Ảnh hưởng sự phối hợp nồng độ BAP + IAA đến HSNC và TLCHH của dòng UE35 và UE56 (180 mẫu/ công thức) ……………………… 53 3.7 Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC và TLCHH của 2 dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56 (180 mẫu cấy/công thức)…………………………………………………………………… 56 3.8 Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + Kinetin đến HSNC và TLCHH của 2 dòng UE35 và UE56 (180 chồi cấy/công thức) ……… 59 3.9 Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến HSNC và TLCHH (180 chồi cấy/công thức) …………………………. 61 3.10 Ảnh hưởng nồng độ IBA đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình và chiều dài của rễ (180 chồi cây/ công thức) ………………………………….. 64 3.11 Ảnh hưởng của IBA + ABT1 đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình và chiều dài rễ của dòng UE35 và UE56 ………………………………… 66 3.12 Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống của cây con tại vườn ươm sau 1 tháng (90 cây mạ /công thức)……………………….. 69 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ TT Tên biểu đồ Trang 3.1a: Biểu đồ ảnh hưởng của vitamin B2 đến HSNC của dòng UE35 và UE.......... 48 3.1b: Biểu đồ ảnh hưởng của vitamin B2 đến TLCHH của dòng UE35 và UE ....... 48 3.2a: Biểu đồ ảnh hưởng của BAP đến HSNC của dòng UE35 và UE ................... 51 3.2b: Biểu đồ ảnh hưởng của BAP đến TLCHH của dòng UE35 và UE................. 52 3.3a: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + IAA đến HSNC của dòng UE35 và UE ................................................................................................. 54 3.3b: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + IAA đến TLCHH của dòng UE35 và UE ................................................................................................. 54 3.4a: Biểu đồ ảnh hưởng của của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC của dòng UE35 và UE ........................................................................................... 56 3.4b: Biểu đồ ảnh hưởng của của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến TLCHH của dòng UE35 và UE ........................................................................................... 58 3.5a: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + Kinetin đến HSNC của dòng UE35 và UE ................................................................................................. 59 3.5b: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + Kinetin đến TLCHH của dòng UE35 và UE ........................................................................................... 60 3.6a: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến HSNC của dòng UE35 và UE ................................................................................ 62 3.6b: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến TLCHH của dòng UE35 và UE ............................................................................. 62 3.7a: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ IBA tỷ lệ ra rễ của dòng UE35 và UE ......... 65 3.7b: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ IBA tới số rễ trung bình của dòng UE35 và UE .................................................................................................................... 65 3.8a: Biểu đồ ảnh hưởng của tổ hợp IBA + ABT1tới tỷ lệ ra rễ của dòng UE35 và UE .......................................................................................................... 67 3.8b: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ IBA + ABT1 tới số rễ trung bình của dòng UE35 và UE ................................................................................................. 67 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH TT Tên bảng Trang 3.1. Ảnh khử trùng mẫu cấy và mẫu nuôi cấy sau 20 ngày ……………... 43 3.2. Ảnh dòng UE35 cấy trong 5 loại môi trường ………………………. 46 3.3 Ảnh mẫu được cấy sang môi trường có bổ sung vitamin B2 sau 10 ngày nuôi cấy ……………………………………………………….. 47 3.4a. Ảnh chồi nuôi cấy trong môi trường MS* có bổ sung 2,0mg/l B2 … 48 3.4b. Ảnh chồi nuôi cấy trong môi trường MS* có bổ sung 2,0mg/l B2 … 49 3.5. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC và TLCHH ……………………………………………………………... 55 3.6. Ảnh chồi nuôi cấy có bổ sung 2,0 mg/l B2 + 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA …………………………………………………………... 58 3.7. Ảnh chồi nuôi cấy có bổ sung 2,0 mg/l B2 + 2,0 mg/l BAP + 1 mg/l N AA + 0,5 mg/l Kinetin …………………………………………… 62 3.8. Ảnh chồi nuôi cấy có bổ sung ABT1 vào môi trường ra rễ sau 15 ngày nuôi cấy ……………………………………………………….. 68 3.9. Ảnh cây con tại vườn ươm của 2 dòng ……………………………... 71 3.10. Ảnh sơ đồ cho quy trình nuôi cấy mô 2 dòng UE35 v à UE56 …….. 74 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABT1 : Chất kích thích ra rễ của Trung Quốc BAP : 6- Benzyl amino purine B2 : Riboflavil Bộ NN&PTNT : Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Ca (0Cl)2 : Hypoclorit canxi GA3 : Gibberellin acid 3 HgCl2 : Clorua thuỷ ngân HSNC : Hệ số nhân chồi IAA : Indol acetic acid IBA : 3-Indol butyric acid Kinetine : 6- Furfuryl aminopurine - C10H9N05 NAA : Nathyl acetic acid Na0Cl : Hypoclorit natri TTG1 : Thuốc kích thích ra rễ có gốc IBA của Trung tâm giống - Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam TLCHH : Tỷ lệ chồi hữu hiệu 1 MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã không ngừng phát triển và thu được những thành tựu đáng kể. Kỹ thuật này ra đời nhanh chóng có vị trí quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học về sản xuất giống cây trồng. Ưu điểm nổi bật của phương pháp này là có thể nhân nhanh, giữ được đặc điểm di truyền ổn định, có thể sản xuất với số lượng cá thể lớn trong thời gian ngắn. Cây nuôi cấy mô thường được trẻ hoá cao độ và có rễ giống như cây mọc từ hạt. Trong lúc cây hom lại thường không có rễ cọc, rễ cây không thể làm đâm sâu xuống đất như cây mọc từ hạt và thường có hiện tượng bảo lưu cục bộ (topophisis). Vì thế nuôi cấy mô tế bào còn là một biện pháp trẻ hoá giống trong sản xuất lâm nghiệp. Mặc dù nuôi cấy mô đòi hỏi kỹ thuật phức tạp, giá thành cao, song vẫn được nhiều nơi áp dụng, đặc biệt là phối hợp với giâm hom, tạo thành công nghệ mô - hom đang được sử dụng khá phổ biến trong sản xuất lâm nghiệp (Lê Đình Khả, Đoàn Thị Mai, 2002, tr. 166-182). Bạch đàn là cây mọc nhanh, chu kỳ kinh doanh ngắn, có khả năng sinh trưởng trên nhiều dạng lập địa khác nhau, thích hợp cho rừng trồng sản xuất nguyên liệu như: gỗ, ván dăm, gỗ trụ mỏ, gỗ xây dựng, gỗ củi. Bạch đàn được trồng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới. Nhiều giống Bạch đàn được cải thiện cùng với kỹ thuật trồng rừng thâm canh cho năng suất cao. Ở Việt Nam, Bạch đàn chiếm vị trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng rừng. Tuy nhiên năng suất và chất lượng rừng Bạch đàn trồng rừng ở nước ta còn thấp và rất khác nhau. Từ năm 1996 Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng - Viện khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu lai tạo và chọn được một số tổ hợp lai có nhiều triển vọng về khả năng sinh trưởng. Các tổ hợp lai trong loài và khác loài của các loài Bạch đàn urophyla (Eucalyptus urophyla) với Bạch đàn liễu (E. exserta) trong đó Eucaluptus urophyla được dùng làm mẹ, E. exserta được dùng làm bố. Những dòng cây lai được chọn là các dòng vô tính thuộc các tổ hợp lai U29E2 (dòng 35) và U29E4 (dòng 56). Hai dòng cây lai này đều có mẹ là Bạch đàn uro (U29), bố là Bạch 2 đàn liễu (E2), song lại thuộc hai cây khác nhau là E2 và E4 vì vậy có đặc điểm sinh trưởng khác nhau. Các dòng vô tính này thuộc các tổ hợp lai đã được Bộ NN&PTNT công nhận là giống tiến bộ k