Luận văn Nghiên cứu phát hiện sự gắn chèn Gene E6 và E7 của Human papilomavirus TYPE 16 vào bộ Gene người bằng kỹ thuật Multiplex RT-PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN TRẦN MINH ĐỊNH NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN SỰ GẮN CHÈN GENE E6 VÀ E7 CỦA Human papilomavirus TYPE 16 VÀO BỘ GENE NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX RT-PCR LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN TRẦN MINH ĐỊNH NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN SỰ GẮN CHÈN GENE E6 VÀ E7 CỦA Human papilomavirus TYPE 16 VÀO BỘ GENE NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX RT-PCR Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Võ Thị Phương Khanh BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Người cam đoan Trần Minh Định ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn tất khóa luận này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc tới: Lãnh đạo trường Đại học Tây Nguyên, các phòng ban và khoa chức năng đã tổ chức Đào tạo, quản lý và tạo điều kiện thuận cho tôi hoàn tất khóa học và luận văn. Các Thầy, Cô giáo trong và ngoài trường đã nhiệt tình giảng dạy và cung cấp những kiến thức quý báu trong suốt khóa học. TS. Võ Thị Phương Khanh, người luôn quan tâm, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận. PGS. TS Nguyễn Anh Dũng đã có những trao đổi quý báu và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận. Bộ môn SHTN, Bộ môn Sinh học thực vật và Phòng thí nghiệm CNSH&MT là các đơn vị đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện và hoàn tất khóa luận. Các anh, chị và các bạn học viên lớp Cao học SHTNK3; đã luôn quan tâm, chia sẻ và động viên tôi trong suốt khóa học cũng như suốt thời gian thực hiện khoa luận. Đặc biệt là bạn Hưng (Công ty CP TBR) đã nhiệt tình và có những trao đổi quý báu trong quá trình thực hiện đề tài; phòng Dịch vụ, Công ty Việt Á đã cung cấp chủng vi sinh vật tham khảo. Cô Giang (phòng khám đa khoa Nguyễn Dũng), anh Nguyện (phòng khám đa khoa Hồng Đức), bạn Việt (Bệnh viện đa khoa Thiện Hạnh), Cô Oanh (BS sản khoa, phòng khám số 120 Hồ Tùng Mậu) và các anh chị tại phòng xét nghiệm Bệnh viện đa khoa Thiện Hạnh, phòng khám đa khoa Nguyễn Dũng, phòng khám số 120 Hồ Tùng Mậu, phòng khám số 46 Phan Chu Trinh, phòng khám đa khoa Hồng Đức đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thu thập mẫu dịch phết cổ tử cung. iii Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới những người thân trong gia đình đã luôn quan tâm, động viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện luận văn. Buôn Ma Thuột, ngày tháng năm 2011 Tác giả Trần Minh Định iv MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 1. Tính cấp thiết của đề tài .................................................................................. 1 2. Mục tiêu của đề tài .......................................................................................... 2 3. Ý nghĩa khoa học ............................................................................................. 2 4. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................................. 2 Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 1.1. Định nghĩa ung thư cổ tử cung ...................................................................... 3 1.2. Tác nhân gây ung thư cổ tử cung .................................................................. 4 1.21. Tác nhân ..................................................................................................... 4 1.2.2. Các type của Human papillomavirus ......................................................... 4 1.2.3. Bộ gen của virus HPV type 16 ................................................................... 5 1.2.4. Sự xâm nhiễm về mặt phân tử - hiện tượng chèn gen của virus HPV nguy cơ cao vào bộ gen người ............................................................................. 6 1.2.5. Tình hình nghiên cứu gắn chèn gen E6 và E7 của HPV vào bộ gen người hiện nay ..................................................................................................... 9 1.3. Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới và Việt Nam ..................... 11 1.3.1. Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới ....................................... 11 1.3.2. Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung tại Việt Nam ..................................... 12 1.4. Các phương pháp phổ biến chuẩn đoán ung thư cổ tử cung hiện nay .......... 13 1.4.1. Chẩn đoán lâm sàng ................................................................................. 13 1.4.2. Các phương pháp chẩn đoán dựa trên tế bào cổ tử cung ........................... 14 1.4.3. Các phương pháp chuẩn đoán tác nhân HPV gây ung thư cổ tử cung ....... 15 1.5. Phương pháp RT – PCR trong chuẩn đoán gắn chèn gen gây ung thư cổ tử cung ............................................................................................................. 19 1.6. Các phương pháp điều trị tổn thương tiền ung thư và ung thư cổ tử cung ... 20 1.6.1. Điều trị tổn thương tiền ung thư cổ tử cung ............................................. 20 1.6.2. Điều trị ung thư cổ tử cung ...................................................................... 21 v 1.7. Các loại vaccine phòng HPV hiện nay ........................................................ 21 Phần II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 23 2.1. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 23 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................... 23 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 23 2.2.2. Thời gian nghiên cứu ............................................................................... 23 2.3. Vật liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu ....................................... 23 2.3.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 24 2.3.2. Hoá chất nghiên cứu ................................................................................ 25 2.3.3. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu .................................................................... 27 2.3.3.1. Dụng cụ nghiên cứu .............................................................................. 27 2.3.3.2. Thiết bị nghiên cứu ............................................................................... 27 2.4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 28 2.4.1. Phương pháp thiết kế và kiểm tra mồi ...................................................... 28 2.4.1.1. Thiết kế và kiểm tra mồi ...................................................................... 28 2.4.1.2. Đánh giá khả năng khuếch đại của hệ mồi thiết kế ................................ 30 2.4.1.3. Giải trình tự kiểm tra sản phẩm khuếch đại ........................................... 30 2.4.2. Phương pháp thu và bảo quản mẫu bệnh phẩm ........................................ 31 2.4.3. Phương pháp tách chiết tế bào thu nhận RNA tổng số.............................. 31 2.4.4. Phương pháp kiểm soát nội phản ứng ...................................................... 32 2.4.5. Phương pháp multiplex RT – PCR .......................................................... 33 2.4.5.1. Phản ứng RT ......................................................................................... 33 2.4.5.2. Phản ứng multiplex PCR ....................................................................... 33 2.4.6. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm multiplex RT – PCR.................. 34 2.4.7. Phương pháp xây dựng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR ..................... 35 2.4.7.1. Nghiên cứu nồng độ enzym DNase I xử lý dịch sau tách chiết thu nhận hoàn toàn RNA tổng số ............................................................................. 35 2.4.7.2. Khảo sát nhiệt độ lai của hệ mồi ........................................................... 36 vi 2.4.7.3. Khảo sát nồng độ mồi ........................................................................... 36 2.4.7.4. Khảo sát nồng độ Mg2+ ......................................................................... 39 2.4.7.5. Khảo sát nồng độ dNTP ........................................................................ 39 2.4.7.6. Khảo sát độ nhạy của quy trình ............................................................. 39 2.4.7.7. Khảo sát độ đặc hiệu của quy trình ....................................................... 40 2.4.9. Bước đầu ứng dụng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR trên các mẫu bệnh phẩm thu thập tại Tp. Buôn Ma Thuột ............................................... 40 Phần III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 41 3.1. Nghiên cứu thiết kế và kiểm tra mồi khuếch đại đặc hiệu gen E6 và E7 của HPV type 16 ............................................................................................... 41 3.1.1. Thiết kế và kiểm tra mồi .......................................................................... 41 3.1.2. Đánh giá khả năng khuếch đại của hệ mồi thiết kế ................................... 44 3.1.3. Giải trình tự kiểm tra sản phẩm khuếch đại .............................................. 45 3.2. Xây dựng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR .......................................... 47 3.2.1. Nghiên cứu nồng độ enzym DNase I xử lý dịch mẫu sau tách chiết ........ 47 3.2.2. Khảo sát nhiệt độ lai của hệ mồi .............................................................. 49 3.2.3. Khảo sát nồng độ mồi trong phản ứng PCR ............................................. 50 3.2.4. Khảo sát nồng độ Mg2+ ............................................................................ 54 3.2.5. Khảo sát nồng độ dNTP ........................................................................... 55 3.2.6. Khảo sát độ nhạy của quy trình ................................................................ 56 3.2.7. Khảo sát độ đặc hiệu của quy trình .......................................................... 57 3.2.8. Quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuột multiplex RT-PCR ...................................................... 58 3.3. Bước đầu ứng dụng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR trên các mẫu dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp. Buôn Ma Thuột ................................................ 60 vii Phần IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................... 65 4.1. Kết luận ...................................................................................................... 65 4.2. Kiến nghị .................................................................................................... 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... PHỤ LỤC ............................................................................................................. viii CÁC CHỮ VIẾT TẮT AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome: Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở người. BLAST Basic Local Alignment Search Tool: Công cụ tìm kiếm các trình tự tương đồng. Bp base pairs: Cặp base CIN Cervical Intraepithelial Neoplasia: Tổn thương trong tế bào biểu mô cổ tử cung. Cs Cộng sự CD Chứng dương cDNA complementary DNA: DNA bổ sung dATP Deoxyadenosine triphosphate dCTP Deoxycytidine triphosphate DEPC Diethylpyrocarbonate dGTP Deoxyguanosine triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphotphate dTTP Deoxythymidine triphosphate EDTA ethylenediaminetetraacetic acid EMBL European Molecular Biology Labolatories: Hội các phòng thí nghiệm Sinh học phân tử Châu Âu. HPV Human Papilomavirus IARC International Agenecy For Research on Cancer IDT Intergrated DNA Technology Kb Kilo base mRNA Messenger Ribonucleotide acid NCBI National Center for Biotechnology Information: Trung tâm Quốc gia về thông tin Công nghệ Sinh học. ix PCR Polymerase chain reaction: Phản ứng kéo dài chuỗi. PK Phòng khám PKĐK Phòng khám đa khoa RNA Ribonucleotide acid RT Reverse Transcriptase RT-PCR Reverse Transcriptase - Polymerase chain reaction TAE Tris acetate EDTA Taq Thermus aquaticus TE Tris acid – EDTA Tm melting Temperature: Nhiệt độ biến tính. x DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1: Sự phát triển của các tế bào bất thường trong bệnh ung thư cổ tử cung .................................................................................................................... 3 Hình 1.2: Human papillomavirus type 16 ............................................................ 4 Hình 1.3: Cấu trúc bộ gene của Human papillomavirus type 16 .......................... 5 Hình 1.4: Quá trình xâm nhiễm và gây bệnh của HPV type nguy cơ cao trong tế bào chủ ............................................................................................................ 7 Hình 1.5: Sơ đồ biểu diễn phân bố tỉ lệ ung thư cổ tử cung trên thế giới ............ 10 Hình 1.6: Tế bào cổ tử cung bình thường và nghịch sản .................................... 13 Hình 2.1: Thang DNA 100bp ............................................................................ 26 Hình 2.2: Sơ đồ biểu thị vị trí gắn mồi E6f-E6r trên gene E6 và trên amplicon .. 31 Hình 3.1: Kết quả đánh giá khả năng khuếch đại của hệ mồi thiết kế................. 44 Hình 3.2: Kết quả thực hiện phản ứng multiplex PCR trên 3 mẫu chứng dương chưa xử lý enzym DNase I ..................................................................... 45 Hình 3.3: Kết quả khảo sát nồng độ enzym DNase I xử lý dịch sau tách chiết ........ 47 Hình 3.4: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của hệ mồi ............................................ 47 Hình 3.5: Kết quả khảo sát nồng độ hệ mồi trong phản ứng ............................... 48 Hình 3.6: Kết quả khảo sát nồng độ Mg2+ .......................................................... 52 Hình 3.7: Kết quả khảo sát nồng độ dNTP ......................................................... 53 Hình 3.8: Kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình .............................................. 54 Hình 3.9: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của quy trình ........................................ 55 Hình 3.10: Kết quả kiểm chứng quy trình phát hiện gắn chèn gene E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gene người trên các mẫu dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp. Buôn Ma Thuột ..............................................................................................................61 xi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Tỷ lệ tiến triển của các giai đoạn CIN sang ung thư cổ tử cung ........... 9 Bảng 1.2: Các phương pháp điều trị tổn thương tiền ưng thư cổ tử cung ........... 19 Bảng 2.1: Các chủng vi sinh vật và mẫu bệnh phẩm tham khảo sử sụng trong đề tài ................................................................................................................. 23 Bảng 2.2: Địa điểm và số lượng mẫu thu thập sử dụng trong đề tài ................... 24 Bảng 2.3: Trình tự amplicon tổng hợp làm chứng nội ........................................ 24 Bảng 2.4: Nồng độ của 2 cặp mồi khảo sát trong đề tài ..................................... 36 Bảng 3.1: Kết quả thiết kế mồi .......................................................................... 41 Bảng 3.2: Đặc tính của hệ mồi thiết kế .............................................................. 42 Bảng 3.3: Cấu trúc thứ cấp của hệ mồi thiết kế .................................................. 42 Bảng 3.4: Cấu trúc hetero-dimer (kcal/mole) của hệ mồi thiết kế ...................... 42 Bảng 3.5: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của hệ mồi ............................................ 48 Bảng 3.6: Kết quả khảo sát nồng độ hệ mồi trong phản ứng .............................. 49 Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình ............................................. 54 Bảng 3.8: Sơ đồ quy trình phát hiện gắn chèn gene E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gene người bằng kỹ thuột multiplex RT-PCR ........................................ 56 Bảng 3.9: Kết quả giải trình tự gene E6 và E7 của HPV type 16 gắn chèn vào bộ gene người .......................................................................................................................................... 58 Bảng 3.10: Kết quả kiểm chứng quy trình phát hiện gắn chèn gene E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gene người trên các mẫu dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp. Buôn Ma Thuột ..............................................................................................................62 23 Phần II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu 1. Nghiên cứu thiết kế và kiểm tra mồi khuếch đại đặc hiệu gen E6 và E7 của HPV type 16. 2. Xây dựng quy trình phát hiện sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR - Nghiên cứu nồng độ enzym DNase I xử lý dịch sau tách chiết - Khảo sát nhiệt độ lai của hệ mồi - Khảo sát nồng độ mồi - Khảo sát nồng độ Mg2+ - Khảo sát nồng độ dNTP - Khảo sát độ nhạy của quy trình - Khảo sát độ đặc hiệu của quy trình 3. Bước đầu ứng dụng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR trên các mẫu mẫu dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp. Buôn Ma Thuột. 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu - Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Bộ môn Sinh học thực nghiệm, Khoa KHTN&CN, trường Đại học Tây Nguyên. - Phòng thí nghiệm CNSH&MT, trường Đại học Tây Nguyên. 2.2.2. Thời gian nghiên cứu Đề tài thực hiện từ tháng 09/2010 tới tháng 08/2011. 2.3. Vật liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 24 2.3.1. Vật liệu nghiên cứu + Mẫu chứng dương: 3 mẫu chứng dương (CD1, CD2, CD3) là mẫu bệnh phẩm thu nhận từ bệnh nhân ung thư cổ tử cung đã được xác định do HPV type 16 gây ra, được cung cấp từ Khoa Ung bướu, Bệnh viện Đa khoa Cần Thơ. + 8 chủng vi sinh vật và 1 mẫu bệnh phẩm sử sụng trong đề tài Bảng 2.1: Các chủng vi sinh vật và mẫu bệnh phẩm sử sụng trong đề tài STT Tên vi sinh vật Nguồn gốc Số lượng 1 DNA của người không bị ung thư cổ tử cung Khoa Ung bướu, Bệnh viện đa khoa Cần Thơ 1 2 HPV type 18 Công ty cổ phần công nghệ Việt Á, Tp. Hồ Chí Minh 1 3 HPV type 11 1 4 HPV type 6 1 5 HPV type 33 1 6 HPV type 45 1 7 E.coli 1 8 Chlamydia trachomatis 1 9 Neisseria gonorrhoeae 1 + Mẫu chứng âm: nước cất. + 86 mẫu bệnh phẩm dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp. Buôn Ma Thuột – Đăk Lăk. Bảng 2.2: Địa điểm và số lượng mẫu thu thập sử dụng trong đề tài STT Địa điểm thu mẫu Số mẫu thu thập 1 Bệnh viện đa khoa Thiện Hạnh 64 2 Phòng khám đa khoa Hồng Đức 2 25 3 Phòng khám số 46 Phan Chu Trinh 2 4 Phòng khám đa khoa Nguyễn Dũng 7 5 Phòng khám số 120 Hồ Tùng Mậu 11 Tổng cộng 86 + Chứng nội: là yếu tố kiểm soát nội phản ứng nhằm kiểm chứng phản ứng có diễn ra bình thường hay không. Một đoạn amplicon có kích thước 400bp được tổng hợp tại Công ty IDT (Hoa Kỳ) dùng làm chứng nội, trình tự amplicon đ