Luận văn Nghiên cứu quy trình tạo hạt và các điều kiện tối ưu nhằm tăng cường khả năng kháng khuẩn của Nano Chitosan

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của tôi. Các kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Mọi sự giúp đỡ và các thông tin trích dẫn đã được nêu rõ nguồn gốc. Người thực hiện Töôûng Ngoïc Thuïc Uyeân BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN
 TƯỞNG NGỌC THỤC UYÊN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TẠO HẠT VÀ CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU NHẰM TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA NANO CHITOSAN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC BUÔN MA THUỘT, NĂM 2010 ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt luận văn này, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: -PGS.TS Nguyễn Anh Dũng, người hướng dẫn khoa học trực tiếp, đã tận tình hướng dẫn phương pháp nghiên cứu và đóng góp nhiều ý kiến quý báu, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. -Lãnh đạo Trường Đại học Tây Nguyên, tập thể các Thầy Cô giáo Phòng Sau đại học, Khoa Khoa học tự nhiên -Công nghệ, Khoa Nông Lâm nghiệp. - Các Thầy Cô giáo đã tận tâm giảng dạy, truyền thụ những kiến thức quý báu trong quá trình học tập. - Ban Giám hiệu Trường THPT chuyên Nguyễn Du. - Các bạn bè, đồng nghiệp và người thân đã giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Trân trọng cảm ơn. Người thực hiện Tưởng Ngọc Thục Uyên iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN .. i LỜI CẢM ƠN .. ii MỤC LỤC .................................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ................................................... v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ ......................................................................................... viii DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................................. x PHẦN 1: MỞ ĐẦU ................................................................................... 1 1.1.Tính cấp thiết ..................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu đề tài ................................................................................... 2 1.3.Ý nghĩa khoa học ................................................................................ 3 1.4.Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................ 3 1.5.Giới hạn đề tài .................................................................................... 3 PHẦN 2: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU........................................................................4 2.1. Tổng quan về chitosan . 4 2.2. Tổng quan về nano chitosan ............................................................ 6 2.2.1. Các phương pháp tạo vật liệu nano chitosan ................................. 6 2.3. Ứng dụng của chitin, chitosan và các dẫn suất trong y học .......... 14 2.3.1.Hoạt tính kháng ung thư...................................................................16 2.3.2.Giảm cholesterol trong máu (hypocholesterolemic activity) .......... 17 2.3.3.Đặc tính chống oxi hóa ................................................................... 17 2.3.4.Màng phủ làm lành vết thương (would healing) ........................... 18 2.3.5.Sử dụng trong cấy ghép răng ......................................................... 19 2.3.6. Ứng dụng trong ly giải chậm thuốc .............................................. 19 2.3.7. Hoạt tính kháng khuẩn .. 21 iv 2.3.8. Hoạt tính chống đông máu của dẫn xuất sulfated chitosan ......... 27 2.3.9.Ứng dụng làm tá chất cho vaccin ................................................... 28 2.4. Tổng quan về Escherichia coli và Staphylococcus aureus .............. 31 2.4.1 Vi khuẩn Escherichia coli .............................................................. 31 2.4.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus .................................................. 36 PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 40 3.1. Nội dung nghiên cứu ....................................................................... 40 3.1.1. Nghiên cứu qui trình tạo hạt nano chitosan ................................. 40 3.1.2. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan .......................................................................................... 40 3.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................ 40 3.2.1. Hóa chất ........................................................................................ 40 3.2.2. Địa điểm nghiên cứu ..................................................................... 41 3.2.3. Thời gian thực hiện ....................................................................... 41 3.2.4. Phương pháp nghiên cứu qui trình tạo hạt nano chitosan ........... 41 3.2.5. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của hạt nano Chitosan ....................................................................................................................43 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 50 4.1. Nghiên cứu qui trình tạo hạt nano chitosan ................................... 50 4.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử đến kích thước hạt, điện tích và tính ổn định hạt nano chitosan .................................... 50 4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ CS:TPP (w/w) đến kích thước và điện thế hạt nano chitosan ...................................................................... 56 4.2. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan .62 4..2.1.Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến khả năng kháng khuẩn .................................................................................. 62 4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano chitosan đến khả v năng kháng khuẩn .................................................................................. 64 4.2.3.Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan đến khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan.............................................. 69 4.2.4.Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ CS: TPP ( 4:1; 5:1; 6:1) đến khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan ............................................. 73 4.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan .................................................................. 76 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................ 79 5.1. Kết luận ............................................................................................ 79 5.2 Kiến nghị ............................................................................................ 79 vi DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU , CÁC CHỮ VIẾT TẮT Số thứ tự Chữ ciết tắt Nghĩa của các chữ viết tắt 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 HPLC MIC DNA pDNA DEMC TPP PMAA CS CMC CNP TEM SEM kDa E.coli S.aureus LMWC Sắc kí lỏng cao áp Nồng độ ức chế tối thiểu Deoxyribo nucleic acid Plasmide deoxyribo nucleic acid Diethylmethylchitosan Tri polyphosphate Polymethacrylic axit Chitosan Cacboxymethyl cellulose Chitosan nanoparticles Kính hiển vi điện tử truyền quang Kính hiển vi điện tử quyét Kilo Dalton Escherichia coli Staphylococcus aureus Khối lượng phân tử thấp vii DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1. Ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến kích thước, điện thế và khả năng hấp phụ BSA 8 2.2. Tính chất vật lý của chitosan oligomer/CMC nanoparticles hấp phụ với pDNA 11 2.3. Các tính chất cơ bản của chitosan liên quan đến ứng dụng trong sinh y học 15 2.4. Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của chitosan và DEMC 24 2.5. Chỉ số MIC của một số dẫn suất chitosan trên một số vi khuẩn 25 2.6. Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của kháng sinh Doxycycline và Chitosan nanoparticles 27 4.1. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử của chitosan đến tính chất hạt nano chitosan 50 4.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ Chitosan: TPP đến tính chất hạt nano chitosan (Chitosan 30kDa) 56 4.3. Ảnh hưởng của nồng độ đến khả năng kháng khuẩn của chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus 62 4.4. Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan (CS:TPP = 6:1) và chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 65 4.5. Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan (CS:TPP = 6:1) và chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 67 4.6. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử đến khả năng viii kháng khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 70 4.7. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử đến khả năng kháng khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 72 4.8. Ảnh hưởng của tỉ lệ CS:TPP đến khả năng kháng khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 74 4.9. Ảnh hưởng của tỉ lệ CS:TPP đến khả năng kháng khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 75 4.10. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 76 4.11. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 77 ix DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ STT Tên đồ thị Trang 4.1. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với trọng lượng phân tử 20 kDa 53 4.2. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với trọng lượng phân tử 30 kDa 54 4.3. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với trọng lượng phân tử 300 kDa 55 4.4. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ CS:TPP là 3:1 57 4.5. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ CS:TPP là 4:1 58 4.6. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ CS:TPP là 5:1 59 4.7. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ CS:TPP là 6:1 60 4.8. Phân bố kích thước hạt nano chitosan với tỷ lệ CS:TPP là 7:1 61 4.9. Khả năng kháng khuẩn của chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus 63 4.10. Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan và chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 66 4.11. Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan và chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 67 4.12. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử đến khả năng kháng khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 70 4.13. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử đến khả năng kháng x khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 73 4.14. Ảnh hưởng của tỉ lệ CS : TPP đến khả năng kháng khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 74 4.15. Ảnh hưởng của tỉ lệ CS : TPP đến khả năng kháng khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 75 4.16. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 77 4.17. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 78 xi DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình ảnh Trang 2.1. Sơ đồ phương pháp tạo hạt nanochitosan 7 2.2. Cơ chế tạo hạt chitosan nanoparticles với axit methacrylic 9 2.3. TEM của hạt nanoparticles CS-PMAA 10 2.4. Sơ đồ tạo giọt bằng phương pháp kết tủa 12 2.5. Sơ đồ tạo giọt bằng phương pháp sấy phun 13 2.6. Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp mixel ngược pha 14 2.7. Ảnh hưởng của chitosan và chitosan oligomer (COS) đến tế bào E.coli (Eaton,2008) 22 2.8. Cơ chế xâm nhập qua màng của chitosan mang vaccin có kích thước nm khác nhau 29 2.9. Ảnh hưởng của các loại adjuvant lên đáp ứng miễn dịch của chuột với vaccin cúm H5N1 30 2.10. Ảnh hưởng của chitosan và các tá chất khác đến đáp ứng miễn dịch của chuột với vaccin H5N1 và hiệu giá kháng thể (HIU) 31 4.1. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với trọng lượng phân tử là 20 kDa 53 4.2. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với trọng lượng phân tử là 30 kDa 54 4.3. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với trọng lượng phân tử là 300 kDa 55 4.4. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS: TPP là 3:1 57 4.5. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS: TPP là 4:1 58 xii 4.6. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS: TPP là 5:1 59 4.7. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS: TPP làà 6:1 60 4.8. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS: TPP là 7:1 61 xiii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN
 TƯỞNG NGỌC THỤC UYÊN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TẠO HẠT VÀ CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU NHẰM TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA NANO CHITOSAN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC BUÔN MA THUỘT, NĂM 2010 xiv 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1.Tính cấp thiết Khoa học và công nghệ nano là một lĩnh vực mới trong những năm gần đây nhưng đã và đang phát triển nhanh chóng vì sự hiệu quả và những ứng dụng rộng rãi của nó trong nhiều ngành như sinh y học, điện tử, vật lí, hóa học. Vật liệu nano với kích thước nanomet siêu nhỏ đã thể hiện nhiều tính chất mới lạ do hiệu ứng kích thước. Hiện nay nhiều nước trên thế giới đang xem công nghệ nano là mục tiêu mũi nhọn để đầu tư phát triển. Việt Nam là nước đang phát triển, vệ sinh an toàn thực phẩm ở mức rất thấp và chịu sự chi phối của nhiều yếu tố như: môi trường ô nhiễm dẫn đến ô nhiễm vào nông sản và vật nuôi, quy trình sản xuất và chế biến thực phẩm còn nhỏ lẻ, không đáp ứng điều kiện vệ sinh an toàn thực phẩm, hủ tục lạc hậu trong ăn uống hoặc vì lợi nhuận mà sử dụng phụ gia, bảo quản ngoài danh mục bộ y tế, kiểm soát thực phẩm qua biên giới và trên thị trường chưa chặt chẽ...đang gióng lên hồi chuông báo động hơn bao giờ hết. Các thuốc kích thích ở vật nuôi, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, melanin trong sữa và nước mắm, 3-MCPD trong nước tương, urea, chlor, cloramphenicol, dipterex trong thủy hải sản... , đặc biệt thức ăn và nước uống nhiễm khuẩn đã gây ra nhiều vụ ngộ độc tập thể, nguy hại cho sức khỏe của con người. Khái niệm thực phẩm sạch ở Việt Nam vẫn là xa xỉ đối với người dân, nhất là dân nghèo. Để chống lại sự nhiễm khuẩn, hiện nay việc sử dụng chất kháng sinh là giải pháp phổ biến để đẩy lùi các bệnh dịch do vi khuẩn gây ra. Tuy nhiên việc sử dụng thuốc kháng sinh cũng có những mặt trái là: do chất kháng sinh tính chọn lọc thấp nên dễ dẫn đến hiện tượng các vi khuẩn có lợi cũng bị tiêu diệt, gây ra trạng thái mất cân bằng khu hệ vi sinh vật, đặc biệt việc sử dụng rộng rãi các loại thuốc kháng sinh dễ dẫn đến nguy cơ kháng thuốc của vi 2 khuẩn và xa hơn nữa là gia tăng tính nguy hiểm của các triệu chứng lâm sàng tạo bởi các loài vi khuẩn. Chính vì vậy, yêu cầu cấp thiết đặc ra hiện nay là phải tìm một chất có khả năng ức chế sinh trưởng của vi khuẩn mà không gây ra hiện tượng nhờn thuốc, không phá vỡ trạng thái cân bằng khu hệ vi sinh vật, không tác dụng phụ, không độc hại, không gây ô nhiễm môi trường. Chitosan là một polisaccharide tự nhiên, là dẫn xuất từ quá trình khử acetyl của chitin. Chitin là thành phần cấu trúc chính vỏ tôm, cua, là một polimer sinh học có nhiều trong tự nhiên, đặc biệt ở Việt Nam có bờ biển dài, nhiều sông suối. Chitosan không độc, có khả năng tự phân hủy sinh học cao, là chất ăn được. Chitosan mang điện tích dương, có ái lực cao với các axit mang điện tích âm, tương tác với các thành phần polianion của vách tế bào vi sinh vật, kết hợp DNA, gắn kết gây đông tụ, kết tủa tế bào vi khuẩn. Do đó, chitosan có tính kháng khuẩn, kháng nấm rộng, làm con người trẻ lâu, hoạt hóa tế bào cơ thể, gia tăng khả năng miễn dịch, giải độc , bảo vệ gan trong cơ thể. Đặc biệt hạt nano chitosan có kích thước nano, có nhiều ưu điểm như diện tích tiếp xúc và điện tích dương lớn hơn chitosan, do đó có tiềm năng tăng cường hoạt tính sinh học, trong đó có hoạt tính kháng khuẩn. Vì vậy, việc nghiên cứu tạo hạt nano nhằm tăng cường tính kháng khuẩn của chitosan ứng dụng trong bảo quản thực phẩm là vấn đề cấp thiết hiện nay. Ở Việt Nam, Nguyễn Anh Dũng đã sử dụng chế phẩm chitosan để ức chế sinh trưởng của vi khuẩn Escherichia coli, nghiên cứu tạo hạt nano chitosan làm tá chất miễn dịch cho vaccin cúm A H5N1 và xây dựng mô hình thử nghiệm trên động vật. Xuất phát từ đó tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu qui trình tạo hạt và các điều kiện tối ưu nhằm tăng cường khả năng kháng khuẩn của nano chitosan” 1.2. Mục tiêu đề tài 1.2.1. Xây dựng quy trình tạo hạt nano chitosan bằng tripolyphosphate (TPP). 3 1.2.2. Xác định các điều kiện tối ưu để nâng cao hiệu quả kháng khuẩn của hạt nano chitosan. 1.3.Ý nghĩa khoa học Tạo hạt nano chitosan nhằm tăng cường hoạt tính kháng khuẩn là hoàn toàn mới tại Việt Nam. 1.4.Ý nghĩa thực tiễn Thành công của đề tài sẽ đẩy nhanh việc sử dụng vật liệu nano chitosan trong bảo quản, phòng chống nhiễm khuẩn ở thực phẩm ở Việt Nam. Đây là vật liệu an toàn cho sức khỏe con người và phổ biến, giá thành hạ phù hợp với điều kiện kinh tế của nhân dân. 1.5.Giới hạn đề tài Do thời gian có hạn, thiết bị, hóa chất hạn chế nên tôi chỉ tiến hành nghiên cứu quy trình tạo hạt nano chitosan, bước đầu thử nghiệm trên hai loại vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus. 4 PHẦN 2. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.1. Tổng quan về chitosan Chitin là thành phần cấu trúc nên vỏ côn trùng, tôm, cua, vách tế bào nấm. Chitin có cấu tạo tương tự như cellulose, nhưng có khác biệt là đơn vị cấu tạo nên chitin là N-acetyl-D-glucosamine, các đơn vị này nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glycoside. Công thức cấu tạo của chitin và chitosan Tính chất, hoạt tính sinh học của chitin, chitosan phụ thuộc rất nhiều vào khối lượng phân tử (Mw) và mức độ deacetyl hóa (DD: degree of deacetylation). Mức độ deacetyl hóa dùng để chỉ % số nhóm acetyl trong phân tử chitin, chitosan bị khử. Mức độ deacetyl hóa tỷ lệ thuận với mật độ của nhóm NH3 + trong phân tử do đó ảnh hưởng đến tính chất đa điện phân và độ tan của chitin, chitosan. Chitin có mức độ deacetyl hóa trung bình nằm trong khoảng 10-15%. Có sản phẩm chitin deacetyl hóa một phần (partially deacetyl chitin) có mức độ deacetyl hóa từ 30-40%. Trong khi đó chitosan phải có mức độ deacetyl hóa > 50%, với mức độ deacetyl hóa này chitosan mới dễ tan trong 5 một số acid hữu cơ loãng như acetic, lactic. Mức độ deacetyl hóa được xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau như: IR spectrophotometry, sắc ký lọc gel, UV spectrophotometry, 1H NMR, 13C- NMR, phương pháp chuẩn độ và HPLC theo Kumar (2000) [21]. Khối lượng phân tử của chitin, chitosan có thể xác định bằng HPLC. Tuy nhiên phương pháp đơn giản nhất, nhanh là đo độ nhớt, dựa vào các hằng số α và K trong phương trình Mark – Houwink: [η] = K.Mα = 1.81 x 10-3 M0.93. Trong đó: η là độ nhớt biểu kiến của chitin (intrisic viscosity) ; M: là khối lượng phân tử. Khối lượng phân tử trung bình của chitin biến động từ 1.0 – 2.5 x106, khối lượng phân tử của chitin sẽ giảm xuống khi mức độ deacetyl hóa tăng lên. Chitosan có ứng dụng rất rộng rãi trong các ngành công, nông nghiệp, y dược, thực phẩm nhờ vào những đặc tính sau (Rinaudo, 2006) - Tính chất đa điện ly mang điện tích dương (cationic polyelectrolyte) cho phép gắn kết với các thành phần sinh học mang điện tích âm. - Có thể tái sinh theo các con đường sinh học trên trái đất. - Có khả năng phân hủy sinh học bằng enzyme trong cơ thể. - Có khả năng tương hợp sinh học với các cơ quan, mô và tế bào động thực vật. - Có khả năng kích thích quá trình làm lành vết thương và đông máu. - Có khả năng tương tác chuyên biệt với các receptor trên màng - Giảm chlolesterol do liên kết có chọn lọc với các acid béo 6 - Không gây độc do các sản phẩm sau thủy phân đều là các chất chuyển hoá tự nhiên. - Không gây đáp ứng miễn dịch trong mô và cơ quan độn