Luận văn Nghiên cứu sự kháng thuốc của nhóm vi khuẩn pseudomonas spp. trong môi trờng ao nuôi cá tra (pangasianodon hypophthalmus) ở tỉnh Trà Vinh, Bến Tre và Cần Thơ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN CHÂU HUỲNH THÙY TRÂM NGHIÊN CỨU SỰ KHÁNG THUỐC CỦA NHÓM VI KHUẨN Pseudomonas spp. TRONG MÔI TRƯỜNG AO NUÔI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Ở TỈNH TRÀ VINH, BẾN TRE VÀ CẦN THƠ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN Cần Thơ, 5/2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version i LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm tạ cô Từ Thanh Dung đã hướng dẫn tận tình và tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài cũng như được tiếp xúc thực tế ở ao nuôi thủy sản. Xin gởi lời cảm ơn quí thầy cô khoa thủy sản đã truyền đạt kiến thức quý báu trong quá trình học cũng như trong thời gian thực hiện đề tài. Xin gởi đến cha mẹ, cậu, các chị và các em lời cám ơn chân thành, là nguồn động viên tinh thần trong suốt thời gian qua. Xin gởi đến chị Phạm Thanh Hương lời cám ơn sâu sắc về sự giúp đỡ nhiệt tình và đóng góp nhiều ý kiến quí báu cho tôi hoàn thành đề tài. Xin chân thành cám ơn chị Châu Hồng Thúy và các anh chị làm việc trong phòng thí nghiệm trường Đại học Trà Vinh đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt cho tôi trong quá trình thu và phân tích mẫu ở tỉnh Trà Vinh. Chân thành cám các anh chị cán bộ trong khoa cùng tập thể lớp bệnh học thủy sản 31 đã giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian thực hiện đề tài. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version ii TÓM TẮT Mục tiêu của đề tài là đánh giá sự kháng thuốc của nhóm vi khuẩn Pseudomonas spp. trong môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), để có cách nhìn sâu sắc hơn về thuốc kháng sinh, từ đó đưa ra biện pháp kiểm soát việc sử thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản một cách triệt để hơn. Trước hết, tiến hành phân lập và định danh vi khuẩn Pseudomonas spp. từ trong môi trường ao nuôi cá tra ở một số hộ ở 3 tỉnh Trà Vinh, Bến Tre và Cần Thơ. Sau đó tiến hành làm kháng sinh đồ với 12 loại kháng sinh và chọn ra 4 chủng để xác định MIC với 3 loại thuốc (oxytetracycline hydrochloride, chloramphenicol, streptomycin) bằng phương pháp pha loãng. Kết quả cho thấy đa số các chủng vi khuẩn Pseudomonas spp. kháng với các loại kháng sinh thử nghiệm, trong đó tất cả các chủng vi khuẩn kháng với cefazolin (CEZ/30 µg), ampicillin (AM/10 µg), kháng ít nhất với doxycycline (DO/30µg) (6,7%) (xem Bảng 4.1). Mặc khác, thấy có 13 chủng trong 30 chủng vi khuẩn thí nghiệm kháng với 2 loại kháng sinh trở lên. Giá tri MIC của các chủng vi khuẩn với chloramphenicol nằm trong khoảng từ 32 đến >256 µg/ml , với oxytetracycline là 8-128 µg/ml, với streptomycine là 4 đến >256 µg/ml. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version iii MỤC LỤC MỤC LỤC Phần I : ĐẶT VẤN ĐỀ........................................................................................... 1 1.1 Giới thiệu .......................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu của đề tài ............................................................................................ 2 1.3 Nội dung của đề tài ........................................................................................... 2 Phần II : TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3 2.1 Đặc điểm và bệnh do Pseudomonas spp. trong nuôi thủy sản ........................... 3 2.1 Vi khuẩn Pseudomonas .................................................................................... 3 2.2 Một số nghiên cứu về Pseudomonas spp. trong môi trường .............................. 4 2.3 Thuốc kháng sinh trong nuôi thủy sản .............................................................. 5 2.3.1 Thuốc kháng sinh............................................................................................ 5 2.3.2 Hiện tượng kháng thuốc ở vi khuẩn ............................................................... 6 2.3.3 Sự kháng thuốc của nhóm vi khuẩn Pseudomonas ........................................ 7 Phần III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 10 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................... 10 3.2 Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 10 3.2.1 Dụng cụ ......................................................................................................... 10 3.2.2 Môi trường, hoá chất và vật liệu nghiên cứu ................................................ 10 3.3 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 11 3.3.1 Địa điểm thu mẫu ......................................................................................... 11 3.3.2 Mẫu vi khuẩn ................................................................................................ 11 3.3.3 Phương pháp thu mẫu ................................................................................... 11 3.3.4 Phương pháp đếm mật độ vi khuẩn .............................................................. 11 3.3.5 Phương pháp định danh vi khuẩn ................................................................. 12 3.3.6 Phương pháp lập kháng sinh đồ .................................................................. 12 3.3.7 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) ............................... 13 Phần IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 16 4.1 Phân lập và định danh vi khuẩn ..................................................................... 16 4.2 Kết quả lập kháng sinh đồ ................................................................................ 17 4.2.1 Sự kháng thuốc của 30 chủng Pseudomonas spp. với 6 kháng sinh ............ 17 4.2.2 Sự kháng thuốc của 12 chủng Pseudomonas spp. với 6 kháng sinh ............ 19 4.3 Kết quả làm MIC ................................................................................................ Phần V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ..................................................................... 24 5.1 Kết luận ............................................................................................................. 24 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version iv 5.2 Đề xuất .............................................................................................................. 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 25 PHỤ LỤC ............................................................................................................... 29 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version v DANH MỤC BẢNG HÌNH Hình 2.1 Các con đường trao đổi sự kháng thuốc của vi khuẩn giữa động vật và con người (Prescott et al., 2000)................................................................. 7 Hình 4.1 Vi khuẩn trên môi trường GSP ................................................................ 16 Hình 4.2 Kết quả nhuộm Gram (100X) .................................................................. 16 Hình 4.3 Kết quả test O/F ....................................................................................... 16 Hình 4.4 Sự kháng thuốc của 30 chủng Pseudomonas spp. với kháng sinh .......... 18 Hình 4.5 Kết quả kháng sinh đồ chủng PTV085 ................................................... 18 Hình 4.6 Sự kháng thuốc của 12 chủng Pseudomonas spp. với kháng sinh .......... 19 Bảng 4.1: Sự kháng thuốc của 30 chủng Pseudomonas spp. với kháng sinh......... 17 Bảng 4.2: Kết quả giá trị MIC của 4 chủng Pseudomonas spp. 3 kháng sinh chloramphenicol, oxytetracycline, streptomycin ................................... 21 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 1 Phần 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Việt Nam có ngành nuôi trồng thủy sản phát triển mạnh. Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là một trong những đối tượng nuôi chính của cả nước, không chỉ đáp ứng cho nhu cầu thực phẩm trong nước mà còn là mặt hàng xuất khẩu quan trọng, vì thế diện tích và sản lượng không ngừng gia tăng. Điển hình năm 2007, diện tích mặt nước nuôi cá tra và cá basa là 6.000 ha (tổng diện tích đất 9.000 ha) diện tích nuôi tăng gấp 6 lần so với năm 1997, sản lượng đạt 1 triệu tấn tăng gấp 45 lần so với năm 1997 (22.500 tấn) (Dzung, 2007). Để đáp ứng nhu cầu thị trường, nghề nuôi cá tra phát triển ở mức độ thâm canh ngày càng cao dẫn đến nhiều bệnh thường xuyên xảy ra và việc sử dụng thuốc kháng sinh phổ biến trong nuôi thủy sản đã làm cho hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng tăng. Theo khảo sát của Mai Văn Tài và ctv. (2004) ở 6 mô hình nuôi và sản xuất giống thủy sản thì có đến 138 loại thuốc kháng sinh được sử dụng. Trong môi trường nuôi cá tra (ở vùng nước ngọt) có nhiều nhóm vi khuẩn khác nhau, sự kháng thuốc của các nhóm vi khuẩn này cũng đã được xác định bởi một số nghiên cứu: Sarter et al. (2007) nghiên cứu sự kháng thuốc của vi khuẩn Gram âm (Enterobacteriaceae (49,1%), Pseudomonads (35,2%) và Vibrionaceae (15,7%)) trong ao nuôi cá tra và cá ba sa ở vùng ĐBSCL. Nghiên cứu của Stock and Wiedemann (2001) về sự nhạy cảm tự nhiên đối với 71 loại kháng sinh của 102 chủng Edwardsiella bao gồm E. tarda (42 chủng), E. ictaluri (41 chủng) và E. hoshine (19 chủng). Và tiêu biểu nhất là nghiên cứu của Từ Thanh Dung và ctv. (2008) về hiện trạng kháng thuốc của vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra ở ĐBSCL. Tỉnh Trà Vinh có 29.187 ha đất nuôi trồng thủy sản, trong đó nuôi trồng thủy sản nước lợ, mặn chiếm 96% đất nuôi trồng thủy sản. Năm 2007, tổng sản lượng thủy sản của Trà Vinh đạt 149.000 tấn, trong đó sản lượng do nuôi trồng đạt hơn 84.000 tấn chiếm đến 81% tổng giá trị sản phẩm do ngành thủy sản mang lại (Ðặng Văn Bường, 2008). Sau khi cá tra được nuôi thử nghiệm thành công ở vùng nước lợ thuộc ấp 5, xã Bình Thắng, huyện Bình Đại, tỉnh Bến Tre vào những ngày đầu năm 2008, có khả năng cá tra sẽ mở rộng diện tích nuôi ở vùng nước lợ. Nhưng tính đến thời điểm hiện nay chưa có tác giả nào công bố về sự kháng thuốc của vi khuẩn trong ao nuôi cá tra ở vùng nước lợ. Vì thế đề tài “Nghiên cứu sự kháng thuốc của nhóm vi khuẩn PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 2 Pseudomonas spp. trong môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) tỉnh Trà Vinh, Bến Tre và Cần Thơ” được thực hiện. 1.2 Mục tiêu của đề tài Đánh giá sự kháng thuốc của nhóm vi khuẩn Pseudomonas spp. trong môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), để có cách nhìn sâu sắc hơn về thuốc kháng sinh, từ đó đưa ra biện pháp kiểm soát việc sử thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản một cách triệt để hơn. 1.3 Nội dung của đề tài - Phân lập, định danh vi khuẩn Pseudomonas spp. trong môi trường nuôi cá tra ở tỉnh Trà Vinh, Bến Tre và Cần Thơ. - Xác định sự kháng thuốc của vi khuẩn thuộc nhóm Pseudomonas spp. bằng phương pháp lập kháng sinh đồ theo Kirby Bauer. - Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC- Minimum Inhibitory Concentration) của vi khuẩn Pseudomonas spp. với một số loại kháng sinh. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm và bệnh do Pseudomonas spp. trong nuôi thủy sản Pseudomonas thuộc họ Pseudomonadaceae, là vi khuẩn Gram âm, hình que thẳng hoặc cong mãnh, không có khả năng sinh bào tử, kích thước 0,5-1,0 x 1,5-5,0 µm, thường di động với một hoặc nhiều roi, hiếu khí bắt buộc. Hầu hết Pseudomonas có oxidase dương tính, nhưng thỉnh thoảng có chủng oxidase âm tính xuất hiện. Vi khuẩn tạo sắc tố vàng - xanh, xanh và xanh nhạt. Nhiệt độ thích hợp cho Pseudomonas phát triển là 4-430C, phát triển tốt ở nhiệt độ thấp. Pseudomonas phân bố khắp nơi trong môi trường, trong đất và nước, là tác nhân cơ hội gây bệnh trên người, động vật và thực vật. Vi khuẩn phân lập được từ bên ngoài và trong nội tạng của cá, gây bệnh trên cá chủ yếu là P. fluorescens, P. chlororaphis và P. anguilliseptica, gây nhiễm trùng máu trong điều kiện nhiệt độ cao và quản lý không phù hợp (Inglis and Hendrie, 1993). Pseudomonas spp. là mầm bệnh trên nhiều đối tượng nuôi thủy sản kinh tế quan trọng, gây tỉ lệ tử vong khá cao (Từ Thanh Dung, 2008). Pseudomonas anguilliseptica được thông báo đầu tiên gây bệnh đốm đỏ (red spot disease – RSD hay Sekiten-byo) trên cá chình ở Nhật Bản bởi Wakabayashi & Egusa vào năm 1972. Theo Muroga et al. (1975), cá chình Nhật Bản (Anguilla japonica) nhạy cảm với P. anguilliseptica hơn cá chình châu Âu (Anguilla anguila). Vi khuẩn này có thể phân lập từ gan, tỳ tạng, tim và trong máu cá bệnh, khuẩn lạc nhỏ trên môi trường NA sau 72h ủ ở 25oC. Ngược lại, P. fluorescens phát triển tốt trên môi trường NA ở 22-25oC và tạo sắc tố màu vàng – xanh, tạo sắc tố huỳnh quang dưới đèn cực tím. (được trích dẫn bởi Inglis and Hendrie, 1993). Kobayashi et al. (2004) xác định tác nhân gây bệnh ở cá thu từ các ao nuôi ở Wakayama Prefecture là vi khuẩn Pseudomanas plecoglossicida bằng kỹ thuật ngưng kết trên lam với kháng thể P. plecoglossicida FPC941. Bằng phương pháp mô học đã phát hiện những tổn thương ở tỳ tạng, thận, gan, ruột, tim và mang, xuất hiện những vết hoại tử đi kèm với sự xuất huyết, đông máu và trương phòng ở phần tủy của tỳ tạng, biểu bì mô và trong thận. Ở gan cũng có hiện tượng hoại tử và sự hình thành vùng áp-xe. Tuy nhiên, ruột, tim và mang chỉ bị vi khuẩn P. plecoglossicida tấn công ở mức không đáng kể, không có sự tổn thương hoặc vi khuẩn không xuất hiện ở não. Theo Từ Thanh Dung và ctv. (2005), bệnh đốm đỏ xuất hiện trên tất cả các loài cá nuôi và cá tự nhiên (cá trắm cỏ, cá tra, cá basa, ếch…), có 4 mức độ và trạng thái bệnh của cá: Bệnh ác tính- không biểu hiện triệu chứng đặc PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 4 trưng, từ khi xuất hiện đến khi cả đàn cá bị bệnh khoảng 10-30 ngày, thời gian ủ bệnh phụ thuộc vào nhiệt độ và chất lượng nước; Bệnh cấp tính- có biểu hiện triệu chứng bệnh nhưng không đầy đủ, khoảng 40-50% đàn cá mắc bệnh, số lượng cá chết rất lớn trong vài ngày; Bệnh thứ cấp tính- biểu hiện xuất huyết từng đốm đỏ trên da, hai bên thân nhất là vùng bụng bị xuất huyết, ứ máu đỏ bầm, vảy dựng lên, bụng phình to…, 30-40% đàn cá bệnh thì đàn cá bơi lội uể oải, lờ đờ, chậm chạp, ở cá khỏi bệnh có nhiều vết sẹo và sinh trưởng chậm hơn bình thường 2-3 lần; Bệnh mãn tính- kéo dài trong suốt quá trình nuôi, tỉ lệ chết khoảng 10% đàn cá, cá khi thu hoạch có nhiều vết sẹo hoặc nhiều chỗ loét chưa lành. Phan Thị Vân và ctv. (2002) xác định tỉ lệ nhiễm Pseudomonas fluorescens phân lập được từ cá trắm cỏ bị bệnh đốm đỏ và xuất huyết lần lượt là 23,6-45,2% và 0-7,8%, bệnh đốm đỏ xuất hiện chủ yếu ở cá trên một tháng tuổi, bệnh xảy ra quanh năm, cao điểm là từ tháng 4-5 và tháng 10-11. Bên cạnh những loài thuộc giống Pseudomonas gây bệnh, thì cũng có những loài có ích, cụ thể là P. stutzeri có khả năng khử nitrate cơ bản dựa trên hoàn toàn bộ gen mã hóa cho các enzyme dị hóa nitrate chứa bên trong chúng bao gồm: gen nar (nitrate reductase) , gen nir (nitrite reductase), gen nor (nitrite oxide reductase), gen nos (nitrous oxide reductase)(Lalucat et al., 2006) . Quá trình khử nitrate thành nitơ phân tử nhờ các vi khuẩn khử nitrate trong đó có vi khuẩn P. stutzeri, chúng khử NO3- qua các sản phẩm trung gian đến sản phẩm cuối cùng là N2 không khí (Lương Đức Phẩm, 2007). Khả năng khử nitrate là một đặc tính bền vững của vi khuẩn P. stutzeri, loài vi khuẩn này là một trong những loài vi khuẩn dị dưỡng khử nitrate hiệu quả nhất và được xem là một hệ thống chuẩn của quá trình khử nitrate bằng vi khuẩn (Zumft, 1997). Carlson et al. (1983) đã nghiên cứu về khả năng khử nitrate của vi khuẩn P. stutzeri, P. aeruginosa và Paracoccus denitrificans. Kết quả cho thấy rằng P. stutzeri chỉ tạo ra sản phẩm là khí nitơ trong khi P. aeruginosa tạo ra nhiều khí N2O hơn là N2. Thêm vào đó một bất lợi là vi khuẩn P. aeruginosa làm giảm lượng nitrate (NO3-), nitrite (NO2), nitrous oxide (N2O) chậm và không có khả năng sinh trưởng hiếm khí trong khi đó thì điều hoàn toàn có thể được thực hiện bởi vi khuẩn P. stutzeri. Vì thế P. stutzeri được ứng dụng xử lý đạm trong ao nuôi cá tra (được Đặng Thị Bé trích dẫn, 2008). 2.2 Một số nghiên cứu về Pseudomonas spp. trong môi trường Nghiên cứu của Kennedya et al. (2006) về phức hệ vi sinh vật (VSV) trong trại sản xuất giống tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii), tổng số PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 5 vi khuẩn có trong nước giếng khoan, nước biển và nguồn nước cấp từ 101- 105 cfu/ml, số lượng vi khuẩn chiếm mật số cao hơn trong nước bể ương. Vi khuẩn Vibrio hiện diện trong môi trường nước của bể nuôi khoảng 101 – 103 cfu/ml trong khi mật độ vi khuẩn có ở mẫu ấu trùng 102 – 104 cfu/10 ấu trùng. Phần lớn loại vi khuẩn chiếm ưu thế là gram âm gồm các giống Aeromonas spp., Pseudomonas spp., Vibrio spp., Baccillus spp. và vi khuẩn gram dương không hình thành bào tử. Với kết quả phức hệ VSV trong hệ thống nuôi tôm càng xanh này đang trong điều kiện bình thường. Số lượng và chất lượng hệ vi sinh vật trong hệ thống nuôi đã giúp định hướng được sự biến động của hệ VSV trong trại giống và có thể dự đoán sự bộc phát của bệnh dịch (Dương Thị Mỹ Hận trích dẫn, 2007). Theo kết quả nghiên cứu về số lượng và chất lượng hệ vi sinh vật trong ao đất nuôi cá rô phi lai ở Saudi Arabia, mật số vi khuẩn (colony forming units - cfu) ở trong phạm vi từ 5,6 ± 0,8 × 103 đến 2,4 ± 1,2 × 104 cfu /ml trong nước ao; 9,3 ± 1,1 × 106 đến 1,9 ± 1,5 × 108 cfu /g trong bùn. Phân lập được 15 giống vi khuẩn và 18 loài. Nghiên cứu cho thấy vi khuẩn trong nước ao và bùn đáy sẽ phản ánh được vi khuẩn trên mang và nội tạng cá rô phi, vi khẩn trên mang đa dạng hơn vi khuẩn trong nội tạng. Trong đó, Pseudomonas spp. cũng chiếm ưu thế so với vi khuẩn khác (10,1%) trong mẫu nước, còn trong bùn ít hơn trong nước với Pseudomonas spp. 4,57% và có thêm P. fluorescens 1,37% (Al-Harbi and Uddin, 2003). Akinbowale et al. (2005) đã phân lập được nhiều giống vi khuẩn từ môi trường nuôi thủy sản (cá nước ngọt và lợ, giáp xác): Vibrio spp. chiếm 60%, Aeromonas spp. 21%, Photobacterium spp. 4%, Pseudomonas spp. 4%, Citrobacter spp. 2%, E. tarda 2%, Hafnia alvei 1%, Flavobacterium spp. 2%, Plesiomonas shigelloides 1% và vi khuẩn gram dương (Staphylococcus và Micrococcus spp.) chiếm 4% trong nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn được phân lập từ các nguồn thủy sản ở Úc. Sazakli et al. (2005) phân lập được 160 chủng Pseudomonas từ nhiều nguồn nước khác nhau (nước biển, nước cất, nước đóng chai…) ở Greece, trong đó P. aeruginosa chiếm đa số 61 chủng (38%), tiếp theo là 30 chủng (19%) P. stutzeri, còn lại là P. alcaligenes, P. putida, P. fluorescens, P. mendocina. 2.3 Thuốc kháng sinh trong nuôi thủy sản 2.3.1 Thuốc kháng sinh Kháng sinh là các chất hữu cơ có cấu tạo hóa học phức tạp, có nguồn gốc sinh học (do xạ khuẩn, vi khuẩn và nấm sinh ra), hay do con người tổng PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 6 hợp nên, có tác dụng một cách chuyên biệt trên một giai đoạn chính yếu trong chu trình biến dưỡng của vi khuẩn (tác nhân kháng khuẩn), của nấm (tác nhân kháng nấm), của virus (tác nhân kháng virus) (được trích dẫn bởi Lê Thị Kim Liên và ctv., 2008). Người đầu tiên phát hiện chất kháng sinh là bác sĩ người Anh Alexander Fleming (1881-1955). Năm 1928 ông là người đầu tiên tách được chủng nấm Penicilium notatum sinh chất kháng sinh penicilin, mở ra một kỷ nguyên mới cho việc đẩy lùi nhanh chóng các bệnh nhiễm khuẩn. Năm 1944, Waksman (người Mỹ gốc Nga) phát hiện ra Streptomycine và nhận giải Nobel vào nă