Luận văn Nghiên cứu sự phát triển cơ quan lympho của cá tra pangasianodon hypophthalmus từ 1 đến 30 ngày tuổi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN ĐẶNG THANH PHONG NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT TRIỂN CƠ QUAN LYMPHO CỦA CÁ TRA Pangasianodon hypophthalmus TỪ 1 ĐẾN 30 NGÀY TUỔI LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN ĐẶNG THANH PHONG NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT TRIỂN CƠ QUAN LYMPHO CỦA CÁ TRA Pangasianodon hypophthalmus TỪ 1 ĐẾN 30 NGÀY TUỔI LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TỪ THANH DUNG 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version i LỜI CẢM TẠ Tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Từ Thanh Dung đã nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn và đóng góp nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian thực hiện đề tài này. Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô khoa Thủy Sản trường Đại Học Cần Thơ đã tạo môi trường tốt trong học tập, trao dồi đạo đức, truyền đạt kiến thức và nhiều kinh nghiệm thực tế trong suốt quá trình rèn luyện ở nhà trường. Tác giả xin chân thành cảm ơn gia đình Bác 2 Nắm (Hồng Mỹ) – Thị Trấn Hồng Ngự, tỉnh Đồng Tháp đã giúp đỡ tôi chỗ ăn, ở, phương tiện và điều kiện nghiên cứu thuận tiện trong suốt thời gian thu mẫu ở địa phương thuộc thị trấn Hồng Ngự. Xin gởi lời cảm tạ đến anh Huỳnh Chí Thanh khuyến ngư huyện Hồng Ngự, tất cả các bạn lớp Bệnh học thủy sản K.31 và cùng các anh em P2C12, ký túc xá trường Đại Học Cần Thơ đã quan tâm, giúp đỡ và ủng hộ tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version ii TÓM TẮT Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là đối tượng nuôi quan trọng ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL). Tuy nhiên các thông tin khoa học về hệ miễn dịch chưa có tác giả nào công bố để làm cơ sở cho việc phòng bệnh cho cá. Việc nghiên cứu đề tài này nhằm mục tiêu là tìm hiểu sự phát triển cơ quan lympho của cá tra Pangasianodon hypophthalmus từ 1 đến 30 ngày tuổi sau khi nở. Thu mẫu cá từ 1 đến 30 ngày tuổi trực tiếp ở ao ương, mỗi ngày tuổi thu từ 6 – 30 con cá. Bên cạnh đó, cũng theo dõi quá trình hoạt động của cá, các chế độ quản lý và chăm sóc ao, hàng tuần kiểm tra các yếu tố môi trường và nhiệt độ đo mỗi ngày. Nghiên cứu này đã sử dụng phương pháp mô học (Haematoxylin & Eosin) trên cơ quan lympho thận,tuyến ức và tỳ tạng. Kết quả nghiên cứu được tìm thấy thận xuất hiện đầu tiên ở cá 6 ngày tuổi sau khi nở; tuyến ức được quan sát ở cá 9 ngày tuổi và cuối cùng là tỳ tạng được tìm thấy ở cá 21 ngày tuổi. Trong suốt thời gian ương nuôi thì các yếu tố môi trường đều nằm trong khoảng cho phép và thích hợp cá phát triển. Kết quả này góp phần làm cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu hệ thống miễn dịch trên cá tra nhằm tìm ra giải pháp phòng các bệnh truyền nhiễm một cách tích cực và có hiệu quả hơn.. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version iii MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ...................................................................................................... i TÓM TẮT ........................................................................................................... ii MỤC LỤC ......................................................................................................... iii DANH SÁCH HÌNH ......................................................................................... iv Chương I: GIỚI THIỆU .................................................................................. 1 Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2 Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 2 Chương II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ............................................................ 3 2.1 Sơ lược đặc điểm về cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) .................. 3 2.2 Lịch sử tiến hóa của các cơ quan lymphoid ............................................... 3 2.3 Sự tiến hoá và phát triển của tế bào lympho .............................................. 4 2.4 Các cơ quan lymphoid ............................................................................... 5 2.4.1 Tỳ tạng (spleen).................................................................................... 5 2.4.2 Cơ quan thymus (tuyến ức) .................................................................. 6 2.4.3 Thận (kidney) ....................................................................................... 7 2.5 Sự hình thành cơ quan lymphoid ............................................................... 7 2.6 Một số thành tựu về phương pháp mô học ............................................. 10 Chương III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 13 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 13 3.2 Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 13 3.2.1 Dụng cụ .............................................................................................. 13 3.2.2 Hoá chất ............................................................................................. 13 3.3 Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 13 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu ........................................................................ 13 3.3.2 Phương pháp cắt mẫu ......................................................................... 13 3.3.3 Phương pháp cố định mẫu .................................................................. 14 3.3.4 Phương pháp làm tiêu bản mô ........................................................... 14 3.4 Đọc kết quả .............................................................................................. 17 Chương IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 18 4.1 Thông tin chung về hộ nuôi ..................................................................... 18 4.2 Các chỉ tiêu môi trường trong ao ương .................................................... 19 4.3 Sự phát triển của các cơ quan Lympho .................................................... 20 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version iv 4.3.1 Thận .................................................................................................... 20 4.3.2 Tuyến ức (thymus) ............................................................................. 24 4.3.3 Tỳ tạng ............................................................................................... 26 Chương V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................ 28 5.1 Kết luận ................................................................................................. 28 5.2 Đề xuất .................................................................................................. 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 29 PHỤ LỤC I ....................................................................................................... 32 PHỤ LỤC II ...................................................................................................... 33 PHỤ LỤC III .................................................................................................... 34 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version v DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1 Khối paraffin trước khi cắt ............................................................... 16 Hình 3.2 Vị trí của tuyến ức ............................................................................. 18 Hình 4.1 Công tác cải tạo ao và các giai đoạn của cá hương ........................... 19 Hình 4.2 Thận của cá tra qua các giai đoạn ...................................................... 22 Hình 4.3 Cấu trúc của thận qua các giai đoạn của cá ....................................... 23 Hình 4.4 Tuyến ức cá của tra qua các giai đoạn ............................................... 25 Hình 4.5 Cấu trúc tỳ tạng cá 21 ngày tuổi ........................................................ 28 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 1 CHƯƠNG I GIỚI THIỆU Ngành nuôi trồng thuỷ sản (NTTS) Việt Nam (VN) nói chung và Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) nói riêng đã và đang phát triển mạnh mẽ. Trong đó, đối tượng nuôi nước ngọt được nuôi nhiều nhất là cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), không chỉ cung cấp thực phẩm trong nước mà còn là mặt hàng xuất khẩu ra nhiều nước trên thế giới. Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (NN&PTNT), năm 2008 lượng cá tra xuất khẩu của VN đạt 657.000 tấn, đạt kim ngạch 1,48 tỉ USD, chiếm đến 32,1% tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản của cả nước. Cá tra, ba sa là điểm sáng của bức tranh xuất khẩu thủy sản Việt Nam (htt://antg.cand.com.vn). Nhưng trong quá trình mở rộng diện tích nuôi do thiếu sự quy hoạch và không đồng bộ đã kéo theo nhiều vấn đề xảy ra đặc biệt là tình hình dịch bệnh. Ở cá nuôi, nhiều loại bệnh truyền nhiễm xuất hiện và gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi cá tra. Điển hình, bệnh mủ gan do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra đã làm thiệt hại lớn cho người nuôi ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, tỷ lệ cá chết khi bị bệnh này có thể lên đến 90% ( Theo nghiên cứu của Ferguson et al., 2001 và Dung et al., 2004 cho rằng đây là loài vi khuẩn đặc thù gây bệnh chủ yếu trên cá da trơn nuôi công nghiệp, còn theo Mitchell (1997) xác định E. ictaluri là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng máu (Enteric septicaemia of catfish: ESC) ở cá nheo mỹ (Ictalurus punctatus), gây hao hụt trên 60% và hằng năm thiệt hại trên 50 triệu USD. Việc dùng kháng sinh trị bệnh mang lại hiệu quả khi dùng thuốc đúng liều và chẩn đoán đúng tác nhân gây bệnh, nhưng trong thực tế do người nuôi sử dụng bừa bãi, không đúng liều lượng cũng như loại kháng sinh nên gây ra hiện trạng kháng thuốc và tình hình dịch bệnh trở nên trầm trọng hơn (Dung và ctv, 2008). Do đó, việc phòng bệnh như quản lý tốt môi trường nuôi, giống tốt, chế độ dinh dưỡng hợp lý…, và đặc biệt hơn là việc nghiên cứu hệ miễn dịch. Đây cũng là biện pháp phòng bệnh hữu hiệu nhất. Việc nghiên cứu có hiệu quả hay không phụ thuộc vào sự sản xuất các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch và độ tuổi của cá. Ở cá xương, các tế bào lympho (tế bào B, T) tạo ra các kháng thể (IgM, IgH,…) tham gia vào hệ thống đáp ứng miễn dịch được sản xuất ra từ những cơ quan lympho như thymus, tỳ tạng, thận trước (Nadia et al., 2002; Magnadottir et al ., 2005). Theo Merete et al., 1998, cho rằng các cơ quan lympho ở cá phát triển hoàn chỉnh sau khi cá hoàn thành quá trình biến thái. Các cơ quan lymphoid như thận trước, thymus và tỳ tạng phát triển trong suốt PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 2 ở giai đoạn ấu trùng (Padros et al., 1996) và sự hình thành cơ quan lympho của các loài cá nước ngọt sớm hơn so với các loài cá nước mặn (Doggett et al., 1987; Chantanachookhin et al., 1991). Mãi đến năm 2001, Lora et al ., đã nghiên cứu sự hình thành cơ quan lymphoid của cá nheo Mỹ cho thấy các tế bào có chức năng miễn dịch ở cơ quan tạo máu thuộc thận và thymus xuất hiện lúc nở, còn tỳ tạng là 3 ngày sau khi nở. Gần đây, Sonal et al., 2008 nghiên cứu sự hình thành cơ quan lympho ở cá bơn Đại Dương (Hippoglossus hippoglossus L.) cũng cho kết quả là thận xuất hiện ở cá 1 ngày tuổi, nhưng cơ quan thymus là 33 ngày tuổi và tỳ tạng là 49 ngày tuổi. Cho đến nay, vẫn chưa có tác giả nào công bố những nghiên cứu về sự phát triển cơ quan lymphoid ở cá tra. Vì thế, đề tài “Nghiên cứu sự phát triển cơ quan lymphoid ở giai đoạn giống của cá tra Pangasianodon hypophthalmus” được thực hiện nhằm mục tiêu: Tìm hiểu sự phát triển cơ quan lympho của cá tra từ 1 đến 30 ngày tuổi từ đó làm cơ sở khoa học để nghiên cứu sự hình thành hệ miễn dịch góp phần vào việc sử dụng hệ miễn dịch có hiệu quả hơn trong phòng bệnh cho cá. Nội dung nghiên cứu - Theo dõi, thu mẫu và ghi nhận sự phát triển và thay đổi về hình thái của cá tra từ 1 đến 30 ngày tuổi ở Thị Trấn Hồng Ngự, tỉnh Đồng Tháp. - Xác định sự phát triển cơ quan lympho của cá tra bằng phương pháp nhuộm mô học (Haematoxylin & Eosin) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 3 CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược đặc điểm về cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Cá tra phân bố nhiều ở lưu vực sông Mê Kông ở cả 4 nước Lào, Campuchia, Việt Nam và Thái Lan. Ở nước ta những năm trước đây khi chưa có cá sinh sản nhân tạo, cá bột được vớt trên sông Tiền và sông Hậu. Khảo sát chu kỳ di cư của cá tra ở địa phận Campuchia cho thấy cá ngược dòng từ tháng 10 đến tháng 5 và di cư vào hạ lưu tháng 5 đến tháng 9 hàng năm (Phạm Văn Khánh, 2006). Cá tra sống chủ yếu trong nước ngọt, có thể sống được ở vùng nước nhạt lợ (nồng độ muối từ 0,7 đến 1%), có thể chịu đựng được nước phèn có pH >5, dễ chết ở nhiệt độ 150C nhưng chịu nóng tới 390C (Phạm Văn Khánh, 1996). Cá tra khi hết noãn hoàng thích ăn mồi tươi sống, chúng có thể ăn lẫn nhau. Dạ dày to và ngắn là đặc điểm của cá có tập tính ăn tạp nhưng thiêng về động vật. Khi cá lớn, trong điều kiện thiếu thức ăn cá bắt buộc ăn thức ăn khác như mùn bã hữu cơ, thức ăn có nguồn gốc động vật. Cá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh, cá còn nhỏ tăng nhanh về chiều dài. Cá ương trong ao sau 2 tháng đã đạt chiều dài từ 10-12 cm (trọng lượng 14-15 g). Cá khi lớn đạt cỡ 2,5 kg trở lên, mức tăng trọng lượng nhanh hơn so với chiều dài cơ thể. Cá tra trong tự nhiên có thể sống trên 20 năm (trích dẫn từ Trần Thanh Xuân, 1994). 2.2 Lịch sử tiến hóa của cơ quan lymphoid Vài ngàn năm trở về trước đây cơ quan lymphoid đã được các nhà giải phẩu học khám phá. Bước ngoặc khám phá đầu tiên là tỳ tạng tìm thấy trong Edwin Smith Papyrus, từ khoa y ở nước Ai Cập; thymus được mô tả đầu tiên bởi the Italian Jacopo Berengario da Carpi vào thế kỷ 15; và hệ bạch huyết được phát hiện bởi Dane Thomas Bartholin và the Swede Olaus Rudbeck vào thế kỷ 17. Nhưng giải thích chức năng của các cơ quan lymphoid trong hệ thống miễn dịch chỉ mới nghiên cứu gần đây và thymus được công nhận là cơ quan quan trọng trong hệ miễn dịch cho đến nay (trích dẫn từ George Iwama, 1996). Ở lớp chim, tế bào B được sinh ra ở cơ quan lymphoid sơ cấp là túi Fabricius (là nơi tạo ra các tế bào biểu mô của ruột sau); sự hình thành tế bào B cũng có liên quan đến tổ chức lymphoid sơ cấp ở ruột của động vật có vú và đặc biệt là ở nhóm động vật nhai lại (như cừu, thỏ và bò). Ngược lại, những cơ quan thứ cấp (và tam cấp) hoặc những cơ quan lymphoid ngoại biên như hạch lympho, PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 4 cơ bản là không cần thiết trong miễn dịch. Trong khi đó, ở nhóm cá xương nói chung cơ quan lymphoid sơ cấp gồm có tuỷ xương và thymus (tuyến ức), cơ quan lymphoid thứ cấp gồm có tỳ tạng và một tổ chức lymphoid có liên quan đến ruột và hệ thống màng nhầy. Bên cạnh đó thì ở động vật hữu nhũ, cơ quan thymus là nơi tế bào T phát triển, trong khi đó tế bào B được sinh ra ở tuỷ xương. Những cơ quan Lymphoid chẳng hạn như thymus, tỳ tạng và những bạch huyết ở đốt mắt là trung tâm cấu thành hệ thống miễn dịch ở động vật hữu nhũ (George Iwama, 1996). Cơ quan lymphoid nguyên thuỷ (cũng được gọi là cơ quan lymphoid trung tâm), như thymus và tuỷ xương ở hầu hết các động vật hữu nhũ, phụ thuộc vào sự phát triển và sinh sôi của những tế bào lympho sơ cấp. Vì vậy nó giữ 1 chức năng khá quan trọng trong hệ miễn dịch. Cơ quan Lymphoid quan trọng trong điều chỉnh của sự phát triển tế bào lympho và những đáp ứng miễn dịch. Trong suốt quá trình tiến hóa của động vật có xương sống, những cơ quan lymphoid sơ cấp xuất hiện sớm hơn những cơ quan lymphoid thứ cấp (George Iwama, 1996). Từ vài điểm tiến hoá trên cho thấy, những cơ quan lymphoid sơ cấp có tầm quan trọng đặc biệt vì nó có liên quan đến việc tạo ra các thụ thể của kháng nguyên thông qua các tế bào lympho. 2.3 Sự tiến hoá và phát triển của tế bào lympho Ở tất cả các động vật có xương sống, các thụ thể kháng nguyên được sản xuất từ các tế bào lympho. Tất cả các tế bào tạo máu, tế bào lympho bắt nguồn từ chính cơ quan tạo máu của tế bào tuỷ xương. Ở chuột, tế bào B bắt đầu phát triển trong bào thai sống (xuyên suốt sự phát sinh phôi) hoặc ở tuỷ xương (thời kỳ sau khi sinh) và thành thục trong tỳ tạng. Trái lại, tế bào T chỉ phát triển ở thymus. Hầu hết những sinh vật đại diện tổ tiên thuộc động vật có xương sống có thể nhận biết rõ ràng tế bào T và tế bào B ở cá sụn như cá mập và cá đuối. Ở cá, tế bào B phát triển đầu tiên ở gan, sau đó đến thận và cuối cùng là tỳ tạng. Ở cá xương như cá chép và cá ngựa, thận trước là vị trí chiếm lĩnh của tế bào B. Ở động vật lưỡng thê và bò sát, tế bào B phát triển đầu tiên ở gan và tỳ tạng, sau đó thì gián đoạn ở gan nhưng ở tỳ tạng vẫn được duy trì và cuối cùng nó xuất hiện ở tuỷ xương. Ở chim, tế bào B phát triển trong túi của Fabricius (là nơi tạo ra các tế bào biểu mô của ruột sau). Và ở động vật hữu nhũ, tế bào B phát triển chủ yếu ở tuỷ xương. Tuy nhiên, ở 1 vài loài động vật hữu nhũ, như thỏ và bò, tổ chức lymphoid ở ruột là nơi quan trọng để tạo ra các tế bào B nguyên thuỷ. Vì vậy, có thể cho rằng tế bào B có thể được sinh ra ở nhiều vị PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 5 trí khác nhau của động vật xương sống có hàm. Trái ngược lại, tế bào T chỉ phát triển ở một số vị trí nhất định (Trích dẫn từ Thomas et al., 2007). 2.4 Các cơ quan lymphoid 2.4.1 Tỳ tạng (Spleen) Tỳ tạng của cá da trơn là một cơ quan lymphoid thuộc vùng ruột được bao quanh bằng màng treo ruột. Nó có màu đỏ thẩm, hình thoi dài hoặc hình trứng có bề mặt phẳng. Nó được bao bọc bởi 1 lớp biểu bì và lớp mô liên kết. Nhiều tế bào nằm ở dưới mô liên kết. Thành phần chính của tỳ tạng gồm dạng thể bầu dục, phần tủy trắng, phần tủy đỏ và trung tâm đại thực bào. Thận của cá chưa trưởng thành không có phần cơ mở rộng đến nhu mô như ở trường hợp của cá trưởng thành. Mặc dù ở tỳ tạng của cá trưởng thành có phần cơ mở rộng đến nhu mô nhưng không rõ ràng như ở động vật hữu nhủ. Tủy trắng và tủy đỏ của cá bột không tách ra riêng biệt như ở cá trưởng thành. Phần tủy đỏ bao gồm nhiều tế bào máu hình sine với những hồng cầu trưởng thành, một số nguyên hồng cầu, đại thực bào, những tế bào lưới và trung tâm đại thực bào sắc tố (melanin). Những sợi mạng lưới được tìm thấy ở vách dạng đường sine, được sắp xếp ở dạng vòng bao quanh vi thể tỳ tạng. Phần tủy trắng có nhiều tế bào bạch cầu kiềm tính hơn phần tủy đỏ, ngoài ra ở tủy trắng còn có tế bào lympho, ít tế bào hồng cầu, đại thực bào và một số trung tâm đại thực bào. Những tế bào hồng cầu chưa trưởng thành hoặc trưởng thành, đại thực bào, với một số ít tế bào hồng cầu trong tế bào chất đã được tìm thấy ở tỳ tạng, bắt màu đậm với dung dịch Wright và Giemsa. Nhìn chung ở tỳ tạng có nhiều đại thực bào hơn ở tiền thận, đều này cho thấy tỳ tạng là cơ quan chính loại bỏ những tế bào hồng cầu già và tạo ra nhiều tế bào mới (Trích dẫn từ Supranee et al., 1991). Theo Nguyễn Quốc Thịnh, 2002 ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) tỳ tạng có màu đỏ thẩm, dạng dẹp, vị trí của tỳ tạng nằm ở màng treo ruột. Chức năng của tỳ tạng là tiêu hủy những tế bào hồng cầu già, tái hấp thu sắt, Hemoglobin và các thành phần cấu tạo hồng cầu khác để sản xuất hồng cầu mới. Ngoài ra tỳ tạng còn có nhiệm vụ sản xuất ra các loại tế bào limpho giúp cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 6 2.4.2 Cơ quan thymus (tuyến ức) Thymus là 1 đôi cơ quan được tìm thấy giữa lớp biểu bì và vỏ ở rìa trên của nắp mang thuộc hốc