Luận văn Nghiên cứu ứng dụng enzyme amylase trong sản xuất rượu nếp trắng

Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang i TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG HUỲNH THỊ MỸ DUYÊN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME α - AMYLASE TRONG SẢN XUẤT RƯỢU NẾP TRẮNG Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Cần Thơ, 2009 Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang ii TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME α - AMYLASE TRONG SẢN XUẤT RƯỢU NẾP TRẮNG Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. Nguyễn Công Hà Huỳnh Thị Mỹ Duyên MSSV: 2051625 Lớp: CNTP K31 Cần Thơ, 2009 Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang iii Luận văn tốt nghiệp kèm theo sau đây, với tựa đề là “NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME α-AMYLASE TRONG SẢN XUẤT RƯỢU NẾP TRẮNG”, do Huỳnh Thị Mỹ Duyên thực hiện và báo cáo, đã được hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp thông qua. Giáo viên hướng dẫn Nguyễn Công Hà Cần Thơ, ngày tháng năm 2009 Chủ tịch hội đồng Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang iv LỜI CAM ĐOAN Luận văn này là công trình nghiên cứu của Thầy hướng dẫn và bản thân. Các thông tin về số liệu, hình ảnh, kết quả đã được trình bày trong luận văn này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây. Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang v LỜI CẢM TẠ Xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến thầy Nguyễn Công Hà, người trực tiếp hướng dẫn đề tài đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Chân thành cảm ơn tất cả quý thầy cô trường Đại Học Cần Thơ, đặc biệt là quý thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm đã giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt những năm học qua. Chân thành cảm ơn tập thể cán bộ phòng thí nghiệm của bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn tất cả các bạn sinh viên Công Nghệ Thực Phẩm khóa 31 đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt khóa học cũng như trong thời gian thực hiện đề tài này. Chân thành cảm ơn! Cần Thơ, ngày tháng năm 2009 Sinh viên thực hiện Huỳnh Thị Mỹ Duyên Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang vi MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................... iv LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................v MỤC LỤC................................................................................................................ vi DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................ viii DANH SÁCH HÌNH............................................................................................... ix TÓM TẮT ..................................................................................................................x CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU ......................................................................................1 1.1 ĐẶT VẦN ĐỀ...................................................................................................1 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU..............................................................................1 CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU................................................................2 2.1 GẠO NẾP..........................................................................................................2 2.1.1 Thành phần amylose và amylopectin.........................................................2 2.1.2 Khả năng hấp thụ và sự trương nở của tinh bột..........................................4 2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhiệt độ hồ hóa tinh bột ...................................5 2.2 ENZYME AMYLASE.....................................................................................5 2.2.1 - amylase ( - 1,4 glucan - 4 - glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1) .............6 2.2.2 β-amylase (α-1,4-glucan maltohydrolase, EC 3.2.1.2)...............................8 2.2.3  - amylase ( - 1,4 glucan- glucohydrolase, EC 3.2.1.3)......................9 2.2.4 Oligo-1,6- glucosidase ..............................................................................10 2.2.5 Pullulanase ................................................................................................11 2.2.6 Transglucosidase.......................................................................................11 2.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME ......................11 2.3.1 Nồng độ cơ chất ........................................................................................11 2.3.2 Nồng độ enzyme ......................................................................................12 2.3.3 Nhiệt độ.....................................................................................................13 2.3.4 pH môi trường...........................................................................................14 2.3.5 Các chất kìm hãm .....................................................................................14 Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang vii 2.3.6 Các chất hoạt hóa ......................................................................................15 2.4 PHƯƠNG TRÌNH ĐỘNG HỌC – PHƯƠNG TRÌNH MICHALIS-MENTEN ...............................................................................................................................16 CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......19 3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM .....................................................................19 3.1.1 Thời gian và địa điểm ...............................................................................19 3.1.2 Nguyên liệu...............................................................................................19 3.1.3 Hóa chất ....................................................................................................19 3.1.4 Dụng cụ.....................................................................................................19 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................19 3.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM ...................................................................................20 3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định nhiệt độ, pH tối ưu của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân nguyên liệu nếp trắng. .......................................................20 3.3.2 Thí nghiệm 2: Xác định hằng số Km của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân nguyên liệu nếp trắng. ..............................................................21 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................22 4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA pH VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN HOẠT TÍNH ENZYME α- AMYLASE THỦY PHÂN NGUYÊN LIỆU NẾP TRẮNG ................................22 4.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC CỦA ENZYME α-AMYLASE THỦY PHÂN NGUYÊN LIỆU NẾP TRẮNG.................................................................26 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................30 5.1 KẾT LUẬN .....................................................................................................30 5.2 ĐỀ NGHỊ.........................................................................................................30 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................31 PHỤ LỤC Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trangviii DANH SÁCH BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 2.2 2.3 4.1 4.2 A.1 B.1 B.2 B.3 Thành phần hóa học của nếp Đặc điểm của α-amylase được trích ly từ các nguồn khác nhau Các đặc tính kỹ thuật của enzyme glucoamylase được trích ly từ các loại nấm mốc khác nhau Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính enzyme α-amylase đối với nguyên liệu nếp trắng Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nếp trắng lên hoạt tính enzyme α-amylase Bảng tra hàm lượng đường Kết quả thí nghiệm xác định hằng số Km của enzyme α- amylase trên tinh bột tinh khiết Kết quả thí nghiệm khảo sát động học enzyme α- amylase trên nếp than Kết quả thí nghiệm khảo sát động học enzyme α- amylase trên gạo 2 7 9 23 26 32 33 33 33 Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang ix DANH SÁCH HÌNH Hình Tên hình Trang 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 2.10 2.11 2.12 4.1 4.2 4.3 4.4 Quá trình hydrat hóa tinh bột trong nước Cơ chế tác động của enzyme α-amylase trên tinh bột Cơ chế tác dụng của γ-amylase lên phân tử tinh bột Tổng quát quá trình thủy phân tinh bột của amylase Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ enzyme Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến thời gian phản ứng Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến thời gian phản ứng Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng enzyme Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian phản ứng enzyme Ảnh hưởng của pH môi trường đến tốc độ phản ứng Ảnh hưởng của pH đến thời gian thủy phân của enzyme Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính enzyme α-amylase đối với nguyên liệu nếp trắng Đồ thị Michaelis – Menten biễu diễn ảnh hưởng tỷ lệ nếp trắng sử dụng đến hoạt tính của enzyme α-amylase Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc 1/V = 1/f([S]) của quá trình thủy phân tinh bột nếp trắng và nếp than xúc tác bởi enzyme α-amylase Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc 1/V = 1/f([S]) của quá trình thủy phân tinh bột tinh khiết xúc tác bởi enzyme α-amylase 4 8 10 11 12 12 12 12 13 13 13 13 24 26 27 28 Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang x TÓM TẮT Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng enzyme α-amylase trong sản xuất rượu nếp trắng” đã được thực hiện với mục tiêu tìm ra pH và nhiệt độ tối thích cho enzyme α-amylase hoạt động trên nếp trắng, xác định hằng số Km của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân nếp trắng và so sánh với các nguyên liệu khác như tinh bột tinh khiết, gạo, nếp than. Với mục tiêu đó, đề tài đã thực hiện các thí nghiệm và thu được kết quả như sau: Trên nguyên liệu nếp trắng, nhiệt độ để enzyme α-amylase hoạt động mạnh nhất là 850C và pH tối thích của enzyme α-amylase có giá trị là 6,5. Trên các nguyên liệu khác nhau như nếp trắng, gạo, nếp than và tinh bột tinh khiết, giá trị pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu của enzyme α-amylase không khác nhau do trong những nguyên liệu này không có thành phần nào làm thay đổi điện tích bề mặt của enzyme hoặc làm biến tính protein trong enzyme. Hằng số Km của enzyme α-amylase là 17,0755% và Vmax là 7,3926% trong 30 phút. Hợp chất màu anthocyanine trong nếp than làm cho ái lực của enzyme α-amylase với nếp trắng lớn hơn với nếp than. Tỷ lệ amylopectin trong nếp trắng nhiều hơn trong gạo làm cho độ nhạy của enzyme α-amylase với nếp trắng nhỏ hơn với gạo. Tinh bột tinh khiết rất nhạy đối với enzyme α-amylase nên Km của enzyme α-amylase trên nếp trắng (17,0755%) lớn hơn rất nhiều so với tinh bột tinh khiết (0,7824%). Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 1 CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1.1 ĐẶT VẦN ĐỀ Ngày nay, khoa học càng hiện đại, xã hội càng phát triển thì nhu cầu cuộc sống của con người càng được nâng cao. Con người đòi hỏi xã hội phục vụ cho nhu cầu của mình phải tiến bộ hơn về mọi mặt cả về vật chất lẫn tinh thần, từ ăn uống, trang phục, nhà ở đến vui chơi, giải trí… nhưng quan trọng nhất vẫn là vần đề ăn uống hằng ngày. Trước kia, khi cuộc sống vật chất còn khó khăn con người chỉ cần ăn no, mặc ấm nhưng ngày nay khi cuộc sống vật chất được cải thiện, con người đòi hỏi ăn ngon, mặc đẹp, bữa ăn phải đầy đủ những chất dinh dưỡng cần thiết. Không những thế, truyền thống dân tộc Việt Nam có nhiều những hội hè, đình đám… Trong những dịp như thế, rượu là một thức uống không thể thiếu. Rượu là một thức uống có cồn nên giúp dễ tiêu hóa để nâng cao sức khỏe hay để chúc mừng trong những dịp lễ Tết, cưới xin… Các loại rượu vang nếu uống với liều lượng vừa phải thì rất có lợi cho sức khỏe. Nghề nấu rượu thủ công đã có từ xa xưa. Ngày nay, nghề nấu rượu đã rất phổ biến có loại chưng cất và có loại không qua chưng cất. Các loại rượu ra đời ngày càng đa dạng hơn và càng được ưa thích hơn như rượu nho, rượu nếp than, rượu gạo, rượu nếp trắng… Rượu nếp trắng là một thức uống có cồn thường được sản xuất bằng phương pháp truyền thống nên thời gian sản xuất ra rượu thường kéo dài. Việc ứng dụng enzyme α-amylase vào quy trình sản xuất rượu nhằm rút ngắn thời gian sản xuất cũng như giảm chi phí sản xuất là rất quan trọng nên đề tài “Nghiên cứu ứng dụng enzyme α-amylase trong sản xuất rượu nếp trắng” cần được thực hiện. 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Mỗi enzyme đều có những điều kiện hoạt động khác nhau như pH, nhiệt độ, nồng độ cơ chất… Khả năng hoạt động của chúng phụ thuộc rất lớn vào những điều kiện này. Do đó, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng enzyme α-amylase trong sản xuất rượu nếp trắng” được thực hiện hướng đến những mục tiêu chính như sau: - Tìm ra nhiệt độ và pH tối thích cho enzyme α-amylase hoạt động tốt nhất trên nguyên liệu nếp trắng. - Xác định hằng số Km của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân nếp trắng nhằm xác định ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (nếp trắng) lên hoạt tính enzyme α-amylase. Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 2 CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 GẠO NẾP Ngũ cốc là loại nguyên liệu chứa hàm lượng tinh bột rất cao phù hợp với ngành công nghiệp sản xuất rượu. Trong đó, nếp trắng là một loại gạo với hàm lượng tinh bột trên 70 % được sử dụng rộng rãi trong sản xuất rượu. Trong phân tử tinh bột bao gồm hai thành phần: amylose và amylopectin. Hai thành phần này khác hẳn về tính chất hóa học cũng như về tính chất vật lý. Ví dụ: amylose tạo màu xanh với iod còn amylopectin cho màu tím đỏ, amylose dễ hòa tan trong nước ấm và tạo nên dung dịch có độ nhớt không cao, còn amylopectin chỉ hòa tan khi đun nóng và tạo nên dung dịch có độ nhớt cao. Tinh bột là hỗn hợp của hai loại glucan là amylose và amylopectin. Hầu hết các loại tinh bột đều chứa từ 20 ÷ 30 % amylose, tinh bột gạo nếp có thành phần gần như 100 % amylopectin (Hoàng Kim Anh, 2007). Bảng 2.1: Thành phần hóa học của nếp trắng Thành phần Hàm lượng (%) Nước 13 Protein 6.2 Lipid 1.6 Glucid 74 Tro 0.28 (Nguồn: BONS.LUH,1991) 2.1.1 Thành phần amylose và amylopectin 2.1.1.1 Amylose Amylose là một polymer mạch thẳng cấu tạo từ D-glucose nhờ các liên kết α-1,4. Quá trình thủy phân amylose có thể thực hiện bằng các enzyme α-amylse, β- amylase, glucoamylase. Tuy nhiên do trong amylose cũng chứa khoảng 0,1% các liên kết phân nhánh α-1,6 nên β-amylase không thể thủy phân amylose một cách hoàn toàn. Trọng lượng phân tử của amylose trong khoảng 105 ÷ 106. Độ hòa tan và tính lưu biến Amylose thu được bằng phương pháp công nghiệp thường là sản phẩm thoái hóa nên không hòa tan. Amylose mới tách ra từ tinh bột (bằng cách tạo phức với n- Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 3 butanol) ở dạng bột xốp khô, có thể hòa tan dễ dàng trong nước nóng đến nồng độ 15%. Amylose cũng có thể dễ dàng hòa tan trong dung dịch kiềm loãng, tại nồng độ kiềm tối ưu. Ngoài ra, một số dung môi khác cũng hòa tan được amylose là chloralhydrate, acid dichloacetic, acid formic, urea… trong đó dung môi tốt nhất là dimethylsulphoxide. Do trọng lượng phân tử lớn và cấu hình mạch thẳng nên độ nhớt của dung dịch amylose thu được cũng cao. Dung dịch amylose rất dễ tạo keo, ngay cả ở nhiệt độ cao. Tốc độ tạo keo là hàm của thời gian, nhiệt độ, pH, nồng độ và phương pháp hòa tan amylose. Trong dung dịch amylose có khuynh hướng liên kết lại với nhau để tạo ra các tinh thể. Khi tốc độ liên hợp là cực tiểu sẽ tạo ra khối không tan của các hạt đã thoái hóa, khi tốc độ liên hợp là cực đại, dung dịch sẽ chuyển thành thể keo (Hoàng Kim Anh, 2007). Phản ứng đặc trưng với Iodine Khi tương tác với iod, amylose sẽ cho phức màu xanh đặc trưng. Iod được coi là thuốc thử đặc hiệu để xác định hàm lượng amylose trong tinh bột bằng phương pháp trắc quang. Tác nhân hoạt động trong trường hợp này là HI hoặc muối của chúng. Trong phức amylose-iodine, các phân tử iodine sẽ chui vào trong vòng ưa béo của xoắn amylose tạo thành một chuỗi các nguyên tử nằm cạnh nhau. Phản ứng xảy ra với amylose khô dễ dàng hơn với amylose ướt. Nước chỉ có vai trò tạo điều kiện hình thành vòng xoắn và tạo độ linh động cho phân tử amylose và iodine. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy, mạch amylose chứa 200 gốc đường glucose có khả năng gắn kết với iodine lớn nhất (khoảng 20% khối lượng) ở nhiệt độ 200C. Phức hợp này hấp thụ sóng mạnh nhất tại bước sóng 620nm cho màu xanh thẫm. Ái lực của amylose với iodine phụ thuộc tuyến tính với chiều dài của mạch polymer. Khi chiều dài mạch của amylose giảm, khả năng gắn của polymer với iodine và bước sóng hấp thụ mạnh nhất cũng giảm (Hoàng Kim Anh, 2007). 2.1.1.2 Amylopectin Amylopectin là một glucan phân nhánh; trong phân tử amylopectin, ngoài liên kết α-1,4, tỷ lệ liên kết phân nhánh α-1,6 chiếm khoảng 4%. Trung bình mỗi nhánh của amylopectin chứa khoảng 15 ÷ 30 gốc glucose. Cấu trúc tinh thể của tinh bột có liên quan chặt chẽ đến thành phần amylopectin và khả năng tạo các chuỗi xoắn kép. Amylopectin có phân tử lượng trong khoảng 107 đến 108. Amylopectin cũng có khả năng gắn kết nhất định với iodine. Ở nhiệt độ 200C, khả năng gắn của amylopectin với iodine chỉ khoảng 0,2% khối lượng và phức hợp với iodine thể hiện hấp thụ mạnh nhất ở bước sóng 550 nm. Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang 4 Quá trình thủy phân amylopectin cũng giống như quá trình thủy phân amylose. β- amylase không thủy phân được các liên kết nhánh α-1,6, phần mạch nhánh còn sót lại này được gọi là các dextrin giới hạn (limit dextrin). Khi đun nóng trong nước, amylopectin tạo thành dung dịch trong, đặc, dính và có độ nhớt cao. Khác với amylose, amylopectin không bị thoái hóa, khả năng tạo gel cũng kém (trừ khi nồng độ rất cao). Tuy nhiên, dung dịch amylopectin bị giảm độ nhớt rất nhanh trong môi trường acid, trong quá trình hấp tiệt trùng và khi chịu một lực cắt lớn (Hoàng Kim Anh, 2007). 2.1.2 Khả năng hấp thụ và sự trương nở của tinh bột 2.1.2.1 Quá trình trương nở Khi hòa tan tinh bột vào nước, đầu tiên các phân tử nước sẽ thâm nhập vào giữa các các phân tử tinh bột có kích thước lớn và tương tác với các nhóm hoạt động của tinh bột, tạo ra lớp vỏ nước và làm cho mắt xích nào đó của phân tử tinh bột bị yếu đi. Kết quả, phân tử tinh bột bị “rão” ra rồi trương lên. Quá trình trương xảy ra không hạn chế sẽ làm bung các phân tử tinh bột và hệ chuyển thành dạng dung dịch. Quá trình trương luôn luôn đến trước quá trình hòa tan và đây là một quá trình phụ thuộc điều kiện nhiệt độ bên ngoài (Hoàng Kim Anh, 2007). 2.1.2.2 Quá trình hấp thụ nước Ở trạng thái tự nhiên, các phân tử tinh bột liên kết với nhau bằng liên kết hydro rất bền. Ở nhiệt độ lạnh, tinh bột vẫn có thể hấp thụ nước một cách thuận nghịch nhưng với một lượng rất nhỏ. - Liên kết với nước kiểu 1: Khi hấp th