Luận văn Nghiên cứu ứng dụng nguồn đạm thủy phân từ trùn quế (Perionyx excavatus ) để nuôi cấy vi sinh vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ đÀO TẠO TRƯỜNG đẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC -VIỆN NC&PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC ee LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP đẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG đẠM THỦY PHÂN TỪ TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus) đỂ NUÔI CẤY VI SINH VẬT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN Ths. PHAN THỊ BÍCH TRÂM CN. NGUYỄN THỊ XUÂN DUNG Nguyễn Thị Xuân Thanh Viện NC và PT Công Nghệ Sinh Học Lớp Công Nghệ Sinh Học Trường đại Học Cần Thơ Khóa 31 Cần Thơ, Năm 2009 MỤC LỤC DANH SÁCH BẢNG VÀ HÌNH ẢNH TÓM LƯỢC ......................................................................................................1 PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................2 PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU...................................................................3 I. TRÙN QUẾ ...............................................................................................3 1. Vị trí phân loại ...........................................................................................3 2. Đặc tính sinh học .......................................................................................3 3. Đặc tính sinh lý ..........................................................................................4 4. Công dụng của trùn quế..............................................................................5 II. VI SINH VẬT............................................................................................5 1. Dinh dưỡng của vi sinh vật.........................................................................5 a. Nguồn carbon và năng lượng .....................................................................7 b. Nguồn Nitrogen .........................................................................................7 c. Nguồn khoáng ............................................................................................8 d. Các yếu tố sinh trưởng ...............................................................................8 2. Các yếu tố lý, hóa học ảnh hưởng lên vi sinh vật ........................................10 a. Ảnh hưởng của nhiệt độ .............................................................................10 b. Ảnh hưởng của oxi .....................................................................................10 c. Ảnh hưởng của ẩm độ ................................................................................11 d. Ảnh hưởng của ánh sáng ............................................................................11 e. Ảnh hưởng của pH .....................................................................................11 f. Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu...............................................................12 3. Các giai đoạn phát triển của vi sinh vật ......................................................13 a. Giai đoạn chậm ..........................................................................................13 b. Giai đoạn log..............................................................................................13 c. Giai đoạn quân bình ...................................................................................13 d. Giai đoạn chết ............................................................................................14 4. Cách đo sự tăng trưởng của vi sinh vật .......................................................14 a. Đếm trực tiếp .............................................................................................14 b. Phương pháp gián tiếp................................................................................14 III. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC NHÓM ENZYME PROTEASE .................................................................................15 1. Trong nước ................................................................................................15 2. Ngoài nước ................................................................................................16 PHẦN III : PHƯƠNG TIỆN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................18 I. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ..................................................................18 1. Nguyên liệu................................................................................................18 2. Thiết bị và dụng cụ.....................................................................................18 3. Hóa chất ....................................................................................................18 II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................19 1. Chuẩn bị mẫu và xác định thành phần đạm nguyên liệu .............................19 a. Chuẩn bị mẫu .............................................................................................19 b. Xác định thành phần đạm nguyên liệu ........................................................19 2. Sử dụng sản phẩm thủy phân của trùn quế để nuôi vi sinh vật ....................20 a. Thí nghiệm 1: xác định lượng đạm amin trùn quế thay thế pepton thích hợp cho môi trường nuôi cấy vi khuẩn E. coli DH 5a ..........................................20 b. Thí nghiệm 2: theo dõi sự phát trển của vi khuẩn E. Coli DH 5a theo thời gian...............................................................................................................20 c. Thí nghiệm 3: xác định lượng đạm amin thay thế pepton thích hợp môi trường YEB nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae ...........................................21 d. Thí nghiệm 4: Theo dõi sự phát triển của Saccharomyces cerevisiae theo thời gian...............................................................................................................22 PHẦN IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................23 1. Thành phần đạm nguyên liệu ........................................................................23 2. Sử dụng sản phẩm thủy phân của trùn quế để nuôi vi sinh vật .......................23 a. Kết quả xác định lượng đạm amin trùn quế thay thế pepton thích hợp cho môi trường nuôi cấy vi khuẩn E. coli DH 5a .......................................................23 b. Kết quả theo dõi sự phát triển của vi khuẩn E. coli DH 5a theo thời gian .....24 c. Kết quả xác định lượng đạm amin từ trùn quế thay thế pepton thích hợp cho môi trường YEB nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae .....................27 d. Kết quả theo dõi sự phát triển của nấm men Saccharomyces cerevisiae theo thời gian .......................................................................................................28 3. Hiệu quả kinh tế giữa bột đạm từ trùn quế và bột pepton Hà Lan ..................31 PHẦN V : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...............................................................33 I. Kết luận ........................................................................................................33 II. Đề nghị .........................................................................................................33 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH SÁCH BẢNG VÀ HÌNH ẢNH Danh sách bảng Bảng 1: Nguồn và vai trò của các nguyên tố chính trong tế bào vi khuẩn.................6 Bảng 2: Nguồn carbon và nguồn năng lượng cần thiết ở một số nhóm vi sinh vật....7 Bảng 3: Một số vitamin và vai trò của chúng trong hoạt động tế bào .......................9 Bảng 4: Kết quả đo protein và đạm amin của dịch đạm thủy phân và pepton ...........23 Bảng 5: Kết quả đo độ đục các nghiệm thức thay thế pepton khác nhau nuôi cấy E. coli DH 5a ..............................................................................................................24 Bảng 6: Kết quả đo độ đục các nghiệm thức thay thế pepton khác nhau nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae .......................................................................................28 Bảng 7: Giá thành 1 lít môi trường LB.....................................................................31 Bảng 8: Giá thành 1 lít môi trường YEB ..................................................................32 Danh sách hình ảnh Hình 1. Trùn quế .....................................................................................................3 Hình 2. Môi trường lỏng trước và sau khi nuôi vi khuẩn E. coli DH 5a 16 giờ ........24 Hình 3. Sự tăng trưởng của vi khuẩn E. coli DH 5a trên hai môi trường đạm pepton và đạm trùn quế thủy phân theo thời gian ................................................................25 Hình 4. Khuẩn lạc vi khuẩn E. coli DH 5X sau 16 giờ .............................................26 Hình 5. Khuẩn lạc vi khuẩn E. coli DH 5a sau 24 giờ .............................................26 Hình 6. Khuẩn lạc vi khuẩn E. coli DH 5a sau 36 giờ .............................................27 Hình 7. Môi trường trước và sau khi nuôi Saccharomyces cerevisiae 24 giờ..........28 Hình 8. Sự tăng trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trên 2 môi trường đạm pepton và đạm thủy phân trùn quế theo thời gian .............................................29 Hình 9. Khuẩn lạc Saccharomyces cerevisiae sau 24giờ ..........................................30 Hình 10. Khuẩn lạc Saccharomyces cerevisia sau 36 giờ .........................................30 TÓM LƯỢC Đề tài được thực hiện nhằm mở ra một hướng ứng dụng mới của sản phẩm tự thủy phân từ trùn quế. Sản phẩm được thử nghiệm thay thế nguồn đạm pepton ở các mức độ 0, 25, 50, 75 và 100% trên hai môi trường LB nuôi cấy vi khuẩn Escherichia coli DH 5 và môi trường YEB nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae. Kết quả cho thấy, với cùng một lượng đạm amin bổ sung vào môi trường nuôi cấy, nghiệm thức thay thế hoàn toàn đạm trùn quế 100% đạt kết quả cao nhất trên cả hai chủng vi sinh vật. Đồ thị tăng trưởng theo thời gian trên hai môi trường đạm thủy phân từ trùn quế 100% và đạm pepton Hà Lan 100% tương tự nhau. Ở giai đoạn log, cả hai môi trường LB và YEB dịch đạm trùn quế thủy phân được thay thế 100% sự tăng sinh khối từ bằng đến cao hơn so với nuôi cấy trên môi trường chứa đạm pepton và đạt đến OD600nm cao nhất sau 18 giờ tăng trưởng. Trên môi trường thạch, với thành phần đầy đủ chất dinh dưỡng trong dịch đạm thủy phân trùn quế cũng đã cho kích thước khuẩn lạc lớn hơn khi nuôi cấy trên môi trường chứa đạm pepton. Giá thành 1 lít môi trường nuôi cấy chứa đạm trùn quế thủy phân giảm một nửa so với dùng đạm pepton Hà Lan. Vì thế việc sử dụng nguồn đạm thủy phân từ trùn quế để thay thế bột pepton mang lại hiệu quả kinh tế đồng thời nâng cao giá trị thương phẩm của loài trùn đất đang được nuôi công nghiệp hiện nay. PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay vi sinh vật đóng một vai trò quan trọng trong đời sống hàng ngày, từ các ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, nông nghiệp chế tạo phân bón sinh học đến sản xuất các enzyme thông dụng, vacxin phòng bệnh, kháng sinh và các dược phẩm quan trọng. Đặc biệt trong bảo vệ môi trường người ta đã sử dụng vi sinh vật làm sạch môi trường, xử lý các chất thải độc hại. Trong đó nhu cầu về dinh dưỡng cho chúng như các nguồn carbon, nitơ, khoáng chất…là rất cao. Đặc biệt chúng chỉ sử dụng các nguồn thức ăn đơn giản như glucose, đường đôi, acid amin và pepton mạch ngắn để giúp cho sự phát triển và tăng sinh khối tế bào, trong số đó nguồn đạm pepton có giá thành khá cao từ 1.000.000-3.000.000 đồng/1kg. Hiện nay, trùn quế đã được nuôi rất phổ biến ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long và các vùng lân cận Thành phố Hồ Chí Minh. (chiếm - việc tận dụng hệ , 2006). Do vậy, tôm sú (Phạm Thị Quỳnh Trâm, 2008). Nhằm làm phong phú hơn cho sản phẩm tự phân giải từ trùn quế, dịch đạm từ trùn quế do có khá đầy đủ các acid amin cần thiết nên việc sử dụng chúng làm nguồn đạm thay thế pepton trong môi trường nuôi cấy một số chủng vi sinh vật thông dụng là điều có thể. Với lý do đó chúng tôi đã thực hiện đề tài “ Nghiên cứu ứng dụng nguồn đạm thủy phân từ trùn quế (Perionyx excavatus ) để nuôi cấy vi sinh vật” Mục tiêu của đề tài: So sánh hiệu quả sử dụng giữa nguồn đạm thủy phân từ trùn quế với peptone thương mại hiện đang sử dụng trong nuôi cấy các chủng vi khuẩn và nấm men phổ biến. PHẦN II: LƯỢC KHÁO TÀI LIỆU I. Trùn quế 1. Vị trí phân loại Trùn quế thuộc: Ngành: Giun đốt (Annelida). Ngành phụ: Có đai sinh dục (Clillata). Lớp: Giun ít tơ (Oligochaeta). Họ: Megascolecidae. Tên khoa học: Perionyx excavatus 2. Đặc tính sinh học Trùn quế có kích thước tương đối nhỏ, độ dài vào khoảng 10 –15 cm, thân hơi dẹt, bề ngang của con trưởng thành có thể đạt 0,1 – 0,2 cm, có màu từ đỏ đến màu mận chín (tùy theo tuổi), màu nhạt dần về phía bụng, hai đầu hơi nhọn. Cơ thể trùn có hình thon dài nối với nhau bởi nhiều đốt, trên mỗi đốt có một vành tơ. Khi di chuyển, các đốt co duỗi kết hợp các lông tơ phía bên dưới các đốt bám vào cơ chất, đẩy cơ thể di chuyển một cách dễ dàng. Hình 1: Trùn quế Trùn quế hô hấp qua da, chúng có khả năng hấp thu Oxy và thải CO2 trong môi trường nước, điều này giúp cho chúng có khả năng sống trong nước nhiều lần, thậm chí trong nhiều tháng. Hệ thống bài tiết bao gồm một cặp thận ở mỗi đốt, các cơ quan này bảo đảm cho việc bài tiết các chất thải chứa đạm dưới dạng ammoniac và urea. Trùn quế nuốt thức ăn bằng môi ở lỗ miệng, lượng thức ăn mỗi ngày được nhiều nhà khoa học ghi nhận là tương đương với trọng lượng cơ thể của nó. Sau khi qua hệ thống tiêu hóa với nhiều vi sinh vật cộng sinh, phân được thải ra ngoài rất giàu dinh dưỡng (hệ số chuyển hóa ở đây vào khoảng 0,7), những vi sinh vật cộng sinh có ích trong hệ thống tiêu hóa này theo phân ra khỏi cơ thể trùn nhưng vẫn còn hoạt động ở “màng dinh dưỡng” trong một thời gian dài. Đây là một trong những nguyên nhân làm cho phân trùn có hàm lượng dinh dưỡng cao và có hiệu quả cải tạo đất tốt hơn dạng phân hữu cơ phân hủy bình thường 3. Đặc tính sinh lý Trùn quế rất nhạy cảm, chúng phản ứng mạnh với ánh sáng, nhiệt độ và biên độ nhiệt cao, độ mặn và điều kiện khô hạn. Nhiệt độ thích hợp nhất với Trùn quế nằm trong khoảng từ 20 – 30oC, ở nhiệt độ khoảng 30oC và độ ẩm thích hợp, chúng sinh trưởng và sinh sản rất nhanh. Ở nhiệt độ quá thấp, chúng sẽ ngừng hoạt động và có thể chết, hoặc khi nhiệt độ của luống nuôi lên quá cao cũng bỏ đi hoặc chết. Chúng có thể chết khi điều kiện khô và nhiều ánh sáng nhưng chúng lại có thể tồn tại trong môi trường nước có thổi Oxy. Trùn quế rất thích sống trong môi trường ẩm ướt và có độ pH ổn định, thích hợp nhất vào khỏang 7,0 – 7,5, nhưng chúng có khả năng chịu đựng được phổ pH khá rộng, từ 4 – 9, nếu pH quá thấp, chúng sẽ bỏ đi. Trùn quế thích nghi với phổ thức ăn khá rộng, chúng ăn bất kỳ chất thải hữu cơ nào có thể phân hủy trong tự nhiên (rác đang phân hủy, phân gia súc, gia cầm…). Tuy nhiên, những thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng cao sẽ hấp dẫn chúng hơn, giúp cho chúng sinh trưởng và sinh sản tốt hơn. Trong tự nhiên, Trùn quế thích sống nơi ẩm thấp, gần cống rãnh, hoặc nơi có nhiều chất hữu cơ dễ phân hủy và thối rữa như trong các đống phân động vật, các đống rác hoai mục. Chúng rất ít hiện diện trên các đồng ruộng canh tác dù nơi đây có nhiều chất thải hữu cơ, có lẽ vì tỷ lệ C/N của những chất thải này thường cao, không hấp dẫn và không đảm bảo điều kiện ẩm độ thường xuyên. (Nguồn: 4. Công dụng của trùn quế Trùn quế dễ nuôi, chóng lớn và có tốc độ sinh sản nhanh. Hiện nay nuôi trùn quế đã trở thành ngành chăn nuôi công nghiệp phục vụ cho trồng trọt, chăn nuôi, dược phẩm, mỹ phẩm… Trùn quế có hàm lượng đạm cao nên được xem là nguồn dinh dưỡng bổ sung quý giá cho gia súc, gia cầm và thuỷ hải sản. Trùn quế còn là nhà máy xử lý chất thải nông nghiệp và công nghiệp góp phần bảo vệ môi trường sinh thái. Quá trình xử lý chất thải đó đã tạo ra một loại phân hữu cơ vi sinh giàu đạm thích hợp cho nhiều loại cây trồng, đặc biệt là cây cảnh và sản xuất rau sạch. Ngày nay người ta còn sử dụng phân trùn để xử lý ao tôm, cá. Trong y học cổ truyền Việt Nam, trùn vẫn được dùng trong một số bài thuốc chữa sốt rét, sốt nóng, suy nhược cơ thể, cao huyết áp, tai biến mạch máu não… Trùn quế còn chứa enzyme có thể thuỷ phân đặc hiệu sỏi fibrin với hoạt tính xúc tác rất cao, có triển vọng khai thác để làm thuốc điều trị những căn bệnh đột quỵ, tim mạch. Một số nơi còn sử dụng trùn quế làm thực phẩm, mỹ phẩm và thuốc tây. (Nguồn: www.trunque.net) II. Vi sinh vật 1. Dinh dưỡng của vi sinh vật Để tăng trưởng, mỗi vi sinh vật phải tìm trong môi trường các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tổng hợp các cấu tử tế bào cũng như nguồn năng lượng để hoạt động. Các nguyên tố cần thiết chính gồm C, H, O, N, S, P, K, Mg, Fe, Ca, Mn và các nguyên tố vi lượng như Zn, Cu, Co, Mo. Các nguyên tố này có trong nước, các ion vô cơ, những phân tử nhỏ hay các đại phân tử. Nguồn và vai trò của các nguyên tố chính trong tế bào vi khuẩn được trình bày trong bảng 1. Bảng 1: Nguồn và vai trò của các nguyên tố chính trong tế bào vi khuẩn. Nguyên tố % (theo trọng lượng khô) Nguồn Vai trò Carbon 50 CO2 hay các hợp chất hữu cơ Thành phần chính trong vật liệu tế bào Oxygen 20 H2O, CO2, O2, các hợp chất hữu cơ Thành phần chính trong vật liệu tế bào, nước trong tế bào và là chất nhận điện tử trong phản ứng hô hấp hiếu khí Nitrogen 14 NH3, NO3-, N2, hợp chất hữu cơ Thành phần của acid amin, acid nhân, nucleotide và coenzyme Hydrogen 8 H2O, H2, hợp chất hữu cơ Thành phần chính của các hợp chất hữu cơ và nứơc trong tế bào Phospho 3 Phosphate vô cơ Thành phần cấu tạo acid nhân, nucleotid, phospholipid, acid teichoic Sulfur 1 SO2, H2S, SO, hợp chất sulfur hữu cơ Thành phần của Cystein, methionin, glutathion, nhiều coenzyme Potassium 1 Muối potassium Cation vô cơ của tế bào và cofactor của một số enzyme Magnesium 0,5 Muối maggnesium Cation vô cơ của tế bào và cofactor của một số enzyme khác Calcium 0,5 Muối calcium Cation vô cơ của tế bào và cofactor của một số enzyme và cấu tử của nội bào tử Sắt 0,2 Muối sắt Cấu tử của cytochrom và protein có sắt và là cofactor cho một số phản ứng có enzyme xúc tác. (Nguồn: Nguyễn Hữu Hiệp, 2007) a. Nguồn carbon và năng lượng Vi sinh vật cần nguồn carbon thích hợp để tạo nên các cấu tử của tế bào cũng như cung cấp năng lượng cho tế bào. Tuỳ theo nguồn carbon sử dụng mà người ta chia vi sinh vật thành các nhóm như vi sinh vật quang tự dưỡng, quang dị dưỡng, hoá tự dưỡng, hoá dị dưỡng. Nguồn carbon cung cấp năng lượng và tổng hợp chất hữu cơ tế bào được trình bày trong bảng 2: Bảng 2: Nguồn carbon và nguồn năng lượng cần thiết ở một số nhóm vi sinh vật Loại vi sinh vật Nguồn carbon cung cấp năng lượng tế bào Nguồn carbon để tổng hợp các cấu tử tế bào Vi sinh vật quang tự dưỡng Ánh sáng CO2 Vi sinh vật quang dị dưỡng Ánh sáng Hợp chất hữu cơ Vi sinh vật hoá tự dưỡng Hợp chất vô cơ, H2, NH3, NO2-, Fe2+, H2S CO2 Vi sinh vật hoá dị dưỡng Hợp chất hữu cơ Hợp chất hữu cơ Vi sinh vật hoá dị dưỡng Hợp chất vô cơ, H2, NH3, NO2-, Fe2+, H2S Hợp chất hữu cơ (Nguồn: Nguyễn Hữu Hiệp, 2007) Nguồn carbon hữu cơ cần thiết cho các vi sinh vật hoá dị dưỡng rất đa dạng từ các loại đường đơn như glucose, fructose, sucrose, tinh bột, glycogen, cellulose, và acid nucleic đến các hợp chất hữu cơ phức tạp như dầu mỏ, nhựa dẻo (plastic), naphthalen, lipid và protein. Tùy theo loài vi sinh vật mà nguồn carbon thích hợp thay đổi. Ví dụ, các loài vi khuẩn Pseudomonas có thể sử dụng đến 90 nguồn carbon khác nhau, mỗi loài có thể sử dụng một số nguồn carbon khác nhau. Cũng có loài vi khuẩn rất chuyên biệt như vi khuẩn Bacillus fastidiousus chỉ có thể sử dụng urea làm nguồn carbon và nguồn năng lượng. b. Nguồn nitrogen Tùy theo loài vi sinh vật mà nguồn đạm hữu cơ và vô cơ cần thiết cho tế bào sẽ khác nhau. Nguồn đạm mà vi sinh vật thường dùng nhất là protein, acid amin, . NH3, NH4+ và NO3- N2  trong không khí là nguồn dinh dưỡng nitơ của nhóm vi sinh vật cố định nitơ.Vi sinh vật cần có đủ đạm để tổng hợp các acid amin, protein, acid nhân, lipid, carbohydrate và các coenzyme cho cơ thể. c. Nguồn khoáng Sulfur: thường được cung cấp