Luận văn Nhân dõng gen prion (prp) từ giống bõ hanwoo (bos taurus coreanae) của Hàn Quốc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** ĐẶNG QUỐC BẢO NHÂN DÕNG GEN PRION (PrP) TỪ GIỐNG BÕ HANWOO (Bos Taurus Coreanae) CỦA HÀN QUỐC LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** NHÂN DÕNG GEN PRION (PrP) TỪ GIỐNG BÕ HANWOO (Bos Taurus Coreanae) CỦA HÀN QUỐC LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện GS.TS. Kwon Moosik ĐẶNG QUỐC BẢO (Pr PGS.TS Nguyễn Ngọc Tuân KHÓA: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  GENE CLONING PRION (PrP) FROM KOREAN BOVINE: HANWOO (Bos taurus Coreanae) GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Ph.D Kwon Moosik DANG QUOC BAO Dr. Nguyen Ngoc Tuan TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 iii LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học. Các Thầy Cô Phòng Quan Hệ Quốc Tế Các Thầy Khoa Công Nghệ Di Truyền, Đại Học Sungkyunkwan, Hàn Quốc Đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu và giúp đỡ em trong thời gian em học tập tại trƣờng. Đặc biệt xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến: TS. Kwon Moosik- Trƣởng bộ môn Công Nghệ Di Truyền, Đại Học Sungkyunkwan đã tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong nghiên cứu và thực hiện đề tài. TS. Nguyễn Ngọc Tuân- Trƣởng phòng Sau Đại Học, Đại Học Nông Lâm đã giúp đỡ rất nhiều và hƣớng dẫn tận tình trong quá trình viết khoá luận. TS. Trần Thị Dung- Trƣởng bộ môn Công Nghệ Sinh Học trƣờng Đại Học Nông Lâm đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này. Ths. Kim Yong Hwan và các anh chị trong phòng thí nghiệm Công Nghệ Di Truyền, Đại Học Sungkyunkwan đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo em trong suốt thời gian em thực hiện khóa luận. Xin cảm ơn các bạn trong và ngoài lớp đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm khóa luận tốt nghiệp. Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, những ngƣời đã sinh thành, nuôi dƣỡng, dạy dỗ con và luôn bên con trong mọi thời điểm. Thủ Đức, ngày 10 tháng 08 năm 2006 iv TÓM TẮT ĐẶNG QUỐC BẢO, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2006. ―NHÂN DÒNG GEN PRION (PrP) TỪ BÒ HANWOO (BOS TAURUS COREANAE) CỦA HÀN QUỐC‖ Giáo viên hƣớng dẫn GS. TS. KWON MOOSIK PGS. TS. NGUYỄN NGỌC TUÂN BSE là một bệnh truyễn nhiễm do prion, là một trong những bệnh đƣợc quan tâm trong giới nghiên cứu. Hiện nay các nhà khoa học đang tiến hành nghiên cứu để có thể tạo ra một bộ kit chẩn đoán sớm bệnh BSE, các nghiên cứu này đều tập trung nghiên cứu cấu trúc protein PrPsc, dạng protein gây bệnh của prion. Bƣớc đầu trong nghiên cứu của chúng tôi về protein PrPsc, đã tiến hành nhân dòng và giải trình tự gen prion. Tách chiết DNA từ máu của bò Hanwoo và PCR để khuếch đại gen prion. Gen prion đƣợc khuếch đại có kích thƣớc 651 bp, sau đó đƣợc kết buộc vào véc tơ pGEM- T easy và chuyển vào vi khuẩn E. coli DH5α. Khuẩn lạc chứa véc tơ tái tổ hợp có màu trắng trên môi trƣờng LB chuyên biệt (Amp+, Xgal, IPTG). Plasmid thu đƣợc sau quá trình tinh sạch đƣợc giải mã trình tự. Kết quả giải trình tự thành công đã cho thấy sự giống nhau gần nhƣ hoàn toàn trong trình tự gen prion của bò Hanwoo và bò châu Âu. Việc thành công trong quá trình nhân dòng sẽ là bƣớc đầu quan trọng cho mục tiêu cuối cùng trong nghiên cứu của chúng tôi là tạo kit chẩn đoán bệnh BSE. v ABSTRACT Prion — short for proteinaceous infectious particle — is a unique type of infectious agent, as it is made only of protein. Prion was termed in 1982 by Prusiner, who was prized Nobel for his research on prion. Bovine spongiform encephalopathy (BSE) is one of the most notable prion diseases. BSE is not only potential risk on bovine but also on human. Until now Korea is free from BSE (Tae-Yung Kim et. al,2005), but the BSE is high risk damage society. The study on BSE is absolutelly remarkable. As the first step of our prion study, we were attempted cloning full gene of prion encoding bovine prion protein from Korean bovine. PrP gene was amplified from genome DNA (gDNA) of Korean bovine by PCR following 2 primers forward and reverses primer. The recombinant PrP of full sequence cDNA is 651bp long encoding 217 amino acids. Amplified gene was then transmitted in to pGEM-T easy vector. Subsequently, recombination vector was transformed into compentent cell E. coli DH5α. Recombinant plasmid of PrP was then further analyzed through sequencing. vi MỤC LỤC Lời cảm tạ ................................................................................................................... iii Tóm tắt ........................................................................................................................ iv Mục lục ....................................................................................................................... vi Danh sách các chữ viết tắt .......................................................................................... viii Danh sách các bảng .................................................................................................... xi Danh sách các bảng hình ảnh ..................................................................................... x CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1 1.2. Mục tiêu ............................................................................................................... 1 1.3. Yêu cầu ................................................................................................................ 1 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 2 2.1. Prion ..................................................................................................................... 2 2.2. Bệnh não dạng xốp ở bò và các bệnh khác có nguyên nhân do pion .................. 3 2.2.1. Bệnh não dạng xốp ở bò ................................................................................... 3 2.2.2 Các bệnh khác có nguyên nhân do prion ........................................................... 4 2.3. Sự nhân dòng ....................................................................................................... 5 2.3.1. Kỹ thuật PCR .................................................................................................... 5 2.3.2. Kỹ thuật điện di ................................................................................................ 6 2.3.3. Véc tơ plasmid .................................................................................................. 6 2.3.4. Sự kết buộc ....................................................................................................... 7 2.3.5. Biến nạp ở vi khuẩn E. coli .............................................................................. 7 2.3.6. Chọn lọc vi khuẩn đã đƣợc biến nạp ................................................................ 8 2.3.7. Giải trình tự ...................................................................................................... 9 2.3.7.1. Phƣơng pháp Sanger và Coulson ................................................................... 9 2.3.7.2. Phƣơng pháp Maxam – Gilbert ..................................................................... 9 2.3.7.3. Giải trình tự bằng hệ thống tự động .............................................................. 9 CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 10 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ................................................................ 10 3.2. Vật liệu ................................................................................................................ 10 vii 3.3. Dụng cụ và hoá chất ............................................................................................ 10 3.3.1. Dụng cụ............................................................................................................. 10 3.3.2. Hóa chất ............................................................................................................ 10 3.3.3. Các dung dịch ................................................................................................... 11 3.4. Mồi PCR ............................................................................................................. 11 3.5. Khuếch đại gen prion từ bộ gen của bò Hàn Quốc bằng kỹ thuật PCR .............. 11 3.6. Kỹ thuật điện di trên thạch agarose phân tách gen prion ................................... 12 3.6.1. Kiểm tra sản phẩm PCR ................................................................................... 12 3.6.2. Thạch tinh sạch DNA ....................................................................................... 12 3.7. Tách chiết và tinh sạch DNA ............................................................................... 12 3.8. Sự kết buộc .......................................................................................................... 13 3.9. Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E. coli ................................................................ 13 3.10. Chuẩn bị plasmid .............................................................................................. 14 3.11. Giải trình tự ....................................................................................................... 14 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 15 4.1. Kết quả ................................................................................................................. 15 4.1.1. Khuếch đại gen prion bằng kỹ thuật PCR ........................................................ 15 4.1.2. Tinh sạch đoạn PCR từ sản phẩm PCR ............................................................ 16 4.1.3. Gắn đoạn DNA vào véc tơ pGEM-T easy ........................................................ 17 4.1.4. Biến nạp vào vi khuẩn E. coli ........................................................................... 17 4.1.5. Giải trình tự sản phẩm ...................................................................................... 18 4.2. Thảo luận ............................................................................................................. 18 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 20 5.1. Kết luận................................................................................................................ 20 5.2. Đề nghị ................................................................................................................ 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 21 PHỤ LỤC ................................................................................................................... 23 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Amp ampicillin BSE Bovine spongiform encephalopathy (Bệnh viêm não dạng xốp ở bò) bp base pair (cặp base) cDNA complementary deoxyribonucleic acid CJD Creutzfeldt-Jakob disease dNTP deoxynucleoside triphosphate DNA deoxyribonucleic acid E. coli Escherichia coli EDTA ethylen diamine tetraacetic acid EtBr ethidium bromide g gram gDNA genome DNA (bộ gen) Kb kilobase LB Luria-Bertani-medium (môi trƣờng Luria-Bertani) M molar MBM meat and bone meal (bột xƣơng thịt) ml millilitre μl microlitre mM millimolar mRNA messenger ribonucleic acid NCBI National Center for Biotechnology Information Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia OIE The International Office for Epizootic Diseases Văn phòng quốc tế về bệnh dịch PrP prion protein PrPc cellular prion protein PrPSc scrapie-associated prion protein Rpm round per minute (vòng/phút) ix TE Tris-HCl EDTA Tris Tris hydroxymethyl aminomethane TSE Transmissible Spongiform Encephalopathies UV ultraviolet V Volt vCJD variant Creutzfeldt-Jakob disease x DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng A.1: Các bệnh do prion ............................................................................... 23 DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH HÌNH TRANG Hình 4.1: Gradient PCR ........................................................................................ 15 Hình 4.2: PCR gen prion ....................................................................................... 16 Hình 4.3: Thạch elution (tinh sạch) ...................................................................... 16 Hình 4.4: Sản phẩm sau qúa trình tinh sạch ......................................................... 17 Hình 4.5: Véc tơ pGEMT easy và gen PrP đƣợc cắt bởi EcoR I .......................... 18 Hình B.1: Cấu trúc protein PrP và vị trí đoạn mồi trên gen prion ........................ 24 Hình B.2: Mồi thiết kế cho dòng hoá .................................................................... 24 Hình B.3: Bản đồ của véc tơ pGEMT easy ......................................................... 25 Hình B.4: So sánh trình tự gen prion của bò Hanwoo và dòng bò khác ............... 26 1 CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trong thời gian gần đây prion trở thành một thuật ngữ rất đƣợc lƣu ý trong giới khoa học. Prion là một tác nhân gây bệnh mới đƣợc chú ý từ khi gây nên bệnh bò điên vào thập niên 1980 tại Anh Quốc. Sau khi trở thành đại dịch trên bò, ngƣời ta còn tìm thấy đƣợc mối liên hệ giữa các tác nhân gây nên bệnh bò điên và bệnh vCDJ ở ngƣời. Trong suốt vài thập kỷ qua, bệnh bò điên đã gây thiệt hại đáng kể cho nền chăn nuôi các nƣớc kể cả các nƣớc có phát hiện đại dịch và các nƣớc nhập khẩu thịt. Các nghiên cứu về prion trong thời gian gần đây rất đƣợc chú ý, trong đó các nhà nghiên cứu chú trọng hơn vào việc tìm hiểu cơ chế gây bệnh của prion. Ngoài ra ngƣời ta còn tìm cách nghiên cứu trên protein của chúng để có thể tìm ra phƣơng thức nhằm xác định bệnh sớm nhất để tránh sự lây lan trên diện rộng có thể xảy ra. Cùng với các nghiên cứu về prion đã và đang đƣợc triển khai trên thế giới, tại phòng thí nghiệm công nghệ di truyền thuộc khoa công nghệ di truyền đại học Sungkyunkwan, Hàn Quốc, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu gen prion của bò Hanwoo (Hàn Quốc). Trong phạm vi đề tài này, nhƣ là bƣớc đầu trong nghiên cứu của chúng tôi về prion, đề tài tiến hành nhân dòng và giải mã trình tự của đoạn gen prion (mã hoá protein prion) nhằm chuẩn bị nguyên liệu cho các nghiên cứu sâu hơn về sau. 1.2. Mục tiêu Tiến hành nhân dòng và giải trình tự gen prion giải mã protein prion ở giống bò Hanwoo (Hàn Quốc). 1.3. Yêu cầu Thiết kế mồi phát hiện gen prion và thực hiện phản ứng PCR Chuyển gen prion vào véc tơ pGEM-T easy, biến nạp véc tơ tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli. Nhân dòng vi khuẩn, thu nhận vector tái tổ hợp và giải trình tự gen 2 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Prion Prion - đƣợc viết tắt từ thuật ngữ proteinaceous infectious particle (hạt lây nhiễm có bản chất protein) là một tác nhân gây bệnh truyền nhiễm đặc biệt, đƣợc cấu thành từ protein. Bệnh do prion còn đƣợc gọi là các bệnh não dạng xốp truyền nhiễm (Transmissible Spongiform Encephalopathies: TSE) là các bệnh gây thái hóa thần kinh ảnh hƣởng trên cả ngƣời và động vật. Một số bệnh đƣợc liệt kê ở Bảng A.1(Prusiner, 1998). Prion đã đƣợc nghiên cứu cách đây gần một thế kỷ. Vào năm 1930, các nhà khoa học đã nhận thấy tỷ lệ mắc bệnh CJD (Creutzfeldt- Jakob) rất cao ở một số gia đình. Năm 1954 trong khi nghiên cứu bệnh run ngứa trên cừu ở Ireland, Bjorn Sigurdsson đã đƣa ra khái niệm nhiễm vi rút chậm. Sở dĩ nó đƣợc gọi là vi rút chậm vì sau khi lây nhiễm cho vật chủ, các triệu chứng bệnh không biểu hiện nhƣ: không sốt, không có dấu hiệu ung thƣ bạch cầu, không có đáp ứng miễn dịch dịch thể. Ngoài ra khả năng chịu nhiệt và các tác nhân hoá học khác cho thấy rằng prion có bản chất khác bản chất của vi rút. Vào năm 1982, căn cứ vào các nghiên cứu trƣớc đó, Prusiner đã cho rằng có sự tham gia của một loại đại phân tử trong quá trình lây nhiễm và nó có bản chất protein. Trong cùng nghiên cứu đƣợc đăng trên tạp chí Science vào năm 1982, Prusiner đã đặt tên tác nhân này là prion để phân biệt với các tác nhân lây nhiễm từ vi rút và thể vi rút (Prusiner, 1982). Khảo sát trên mRNA của gen prion cho thấy không có sự khác biệt trong trình tự base của dạng bình thƣờng và các mô bị bệnh run ngứa. Điều này cho thấy cấu trúc gen không phải là yếu tố quyết định tính lây nhiễm của prion (Chesebro và ctv, 1985). Gen prion mã hoá protein prion (PrP). Ở động vật có vú, protein prion bình thƣờng (PrPc) là một loại protein màng của tế bào thần kinh và tế bào đệm của não bộ và tuỷ sống, ngoài ra chúng còn xuất hiện trên một vài loại mô ngoại vi và bạch cầu. PrPc vẫn còn một số đặc tính cần đƣợc nghiên cứu thêm (Kang và ctv, 2004). PrPc có thể chuyển sang dạng PrPsc gây bệnh. PrPc đóng vai trò chính trong cách sinh bệnh và truyền lây bệnh, nhƣng dạng đột biến PrPsc lại là thành phần chính của các hạt prion bất thƣờng (Prusiner, 1991). Mặc dù PrPc và PrPsc có cùng trình tự acid amin, chúng 3 có cấu trúc bậc hai khác nhau. Chìa khoá chính để hiểu rõ cơ chế sinh bệnh của prion là ta phải hiểu rõ sự thay đổi cấu trúc bậc hai từ dạng bình thƣờng PrPc (glycoprotein bề mặt tế bào) sang dạng đồng phân gây bệnh PrPsc (Hình B.1.A). Khi khảo sát protein trên các đối tƣợng bị bệnh, ngoại trừ PrPsc đến thời điểm hiện tại, không có một tác nhân đặc hiệu nào khác đƣợc cho là nguyên nhân gây nên các bệnh viêm não dạng xốp. Nên các nhà khoa học khẳng định PrPc là nguyên nhân gây nên bệnh viêm não dạng xốp (Diedrich và ctv, 1993). PrPc có cấu trúc xoắn anpha (khoảng 40%) và một phần nhỏ dạng bê ta, trong khi đó PrPsc gây bệnh lại có ít cấu trúc xoắn alpha (30%) nhiều cấu trúc dạng phiến (khoảng 45%)(Pan và ctv, 1993; Pergami và ctv 1996). Sự khác biệt trong cấu trúc bậc hai làm tăng tính mẫn cảm với proteinase K (PK), và sự khác biệt trong tính hoà tan (Corsaro và ctv, 2002). 2.2. Bệnh não dạng xốp ở bò (BSE) và các bệnh khác có nguyên nhân do prion 2.2.1. Bệnh não dạng xốp ở bò Bệnh não dạng xốp ở bò là một trong những bệnh đáng chú ý nhất trong các loại bệnh do prion gây ra. Sở dĩ bệnh đƣợc gọi là bệnh não dạng xốp vì khi xét nghiệm mô học ngƣời ta thấy có các không bào trong chất xám của não trông giống nhƣ san hô. Bệnh đƣợc gọi là bệnh truyền nhiễm vì chúng có khả năng lây lan trong loài và giữa các loài với nhau (trích Nguyễn Ngọc Tuân, 2002). Sau khi lây nhiễm cho bò, thời gian ủ bệnh trung bình khoảng 5 năm. Đó cũng là lý do bệnh chỉ đƣợc phát hiện sau khi đã trở thành một đại dịch. Ví dụ nhƣ trong trƣờng hợp của Anh, BSE đã lây nhiễm 160.000 đại gia súc và bò sữa trong suốt thập niên 1980 cho đến khi chúng đƣợc quan tâm (Anderson và ctv, 1996). Một vài nghiên cứu đã cho thấy rằng BSE trở thành một đại dịch lớn và lây lan mạnh, nguyên nhân là do các nhà chăn nuôi sử dụng trực tiếp bột thịt xƣơng (MBM) vào khẩu phần ăn của bò sữa (Nathanson và ctv, 1997; Wilesmith và ctv, 1991). Bột thịt xƣơng đƣợc chế biến từ phủ tạng của cừu, bò, heo và gà, phó sản của lò mổ gia súc đƣợc xem nhƣ thức ăn bổ sung giàu đạm. Trong quá trình chế biến MBM đƣợc xử lý ở nhiệt độ thấp, kết quả là các tác nhân gây bệnh không đƣợc phá huỷ hoà