Luận văn Phân lập một số dòng vi khuẩn cố định đạm azospirillum trên lúa

d BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC o&o LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM Azospirillum TRÊN LÚA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS. TS. NGUYỄN HỮU HIỆP LÊ HOÀNG THĂNG VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT LỚP CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA 30 Năm 2008 LỜI CẢM TẠ -------------eaae------------- Sau bốn năm học tập, rèn luyện tại Trường Đại Học Cần Thơ và được thực hiện đề tài tốt nghiệp, với sự hướng dẫn và động viên tận tình của quý Thầy, Cô và sự giúp đỡ của bạn bè, đến nay tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp đại học ngành Công Nghệ Sinh Học, dù phải gặp rất nhiều khó khăn trở ngại. Tôi xin trân trọng cảm ơn: - Thầy PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp, Trưởng Bộ môn Vi Sinh Vật, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp. - Thầy Thạc Sĩ Trần Nhân Dũng - Viện Nghiên Cứu và PhátTtriển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Cần Thơ đã chỉ dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ dụng cụ thí nghiệm cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp. - Cử nhân Phạm Thị Khánh Vân, Cử nhân Nguyễn Thị Phương Tâm, Trung tâcmán bHộọncghliêiện ucứĐu, HBộCmầônnVTi hsinơh @vật, TViàệni lNiệghuiêhn ọCcứutậvàpPhváàt TnrigểnhCiêônng cứu Nghệ Sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp. - Quý Thầy Cô Bộ Môn Sinh - Khoa Khoa Học, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học,Trường Đại Học Cần Thơ. - Xin ghi ơn Cha mẹ và gia đình những người đã sinh thành, nuôi dưỡng, giúp đỡ, động viên, chia sẽ những khó khăn cũng như tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi học tập và thực hiện đề tài này. - Bạn Nguyễn Như Phương và Bùi Việt Sang lớp Công Nghệ Sinh Học Khóa 30, đã luôn động viên và giúp đỡ tôi những lúc khó khăn trong quá trình thực hiện đề tài. LÊ HOÀNG THĂNG MỤC LỤC TÓM LƯỢC........................................................................................... Trang 1 ABSTRACT ........................................................................................... Trang 1 PHẦN I. ĐẶT VẤN ĐỀ ......................................................................... Trang 2 PHẦN II – LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU I. Giới thiệu về cây lúa 1. Oryza satival L. .............................................................. Trang 4 2. Oryza rufipogon Griff..................................................... Trang 4 3. Đặc điểm sinh trưởng của lúa. ........................................ Trang 4 4. Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam. .......................... Trang 4 II. Tầm quan trọng của đạm đối với lúa ......................................... Trang 5 III. Sự cố định đạm sinh học ......................................................... Trang 6 IV. Vai trò của Azospirillum trong nông nghiệp 1. Sơ lược về vi khuẩn Azospirillum ................................... Trang 7 2. Các nghiên cứu về sự cố định đạm sinh học của Azospirillum . ........................................................................................... Trang 9 V. Một số kỹ thuật trong sinh học phân tử. 1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction). .................Trang 10 2. Điện di agarose gel. .......................................................Trang 11 PHẦN III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP I. Địa điểm và thời gian. 1. Địa điểm. .......................................................................Trang 12 2. Thời gian. ......................................................................Trang 12 II. Vật liệu thí nghiệm. .................................................................Trang 12 III. Phương tiện 1.Phương tiện để phân lập vi khuẩn. ..................................Trang 12 2.Phương tiện trích DNA, thực hiện phản ứng PCR, điện di ..........................................................................................Trang 13 IV. Hóa chất. 1. Hóa chất để phân lập vi khuẩn. ......................................Trang 13 2. Hóa chất nhuộm Gram. ..................................................Trang 14 3. Hóa chất trích DNA .......................................................Trang 14 4. Hóa chất thực hiện phản ứng PCR. ................................Trang 15 5. Hóa chất điện di.............................................................Trang 15 V. Phương pháp. 1. Phân lập vi khuẩn Azospirillum......................................Trang 15 2. Quan sát khả năng chuyển động của vi khuẩn. ...............Trang 17 3. Nhuộm Gram.................................................................Trang 17 4. Đo kích thước tế bào vi khuẩn .......................................Trang 18 5. Trích nhanh DNA từ vi khuẩn Azospirillum...................Trang 19 6. Kiểm tra các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction). .......Trang 19 PHẦN IV – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN I. Kết quả phân lập vi khuẩn Azospirillum 1. Nguồn gốc cây chủ, thời gian tăng trưởng và đặc điểm môi Trung tâm Học liệu tĐrưHờngCnầuôni cTấyhơcác@dònTgàvii lkiệhuuẩnhAọzcosptậiriplluvmàđãngphhâniêlnập cứu được. ........................................................................... Trang 21 2. Màu sắc khuẩn lạc, màu môi trường, hình dạng và kích thước của các dòng vi khuẩn đã phân lập được. .....................Trang 25 3. Một số đặc điểm của các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập. ..................................................................Trang 28 II. Kết quả kiểm tra các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction). ................................Trang 30 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I. Kết luận ....................................................................................Trang 32 II. Đề nghị....................................................................................Trang 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................Trang 33 DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã phân lập trên lúa trồng và lúa hoang ..........................................Trang 23 Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã phân lập trên lúa trồng và lúa hoang (tt) ....................................Trang 24 Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã phân lập trên lúa trồng và lúa hoang (tt) ....................................Trang 25 Bảng 2. Màu môi trường, màu sắc và đường kính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập......................................................................Trang 26 Bảng 2. Màu môi trường, màu sắc và đường kính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập (tt) ................................................................Trang 27 Bảng 3: Kết quả nhuộm Gram và đo hình dạng tế bào ............................Trang 28 Bảng 3: Kết quả nhuộm Gram và đo hình dạng tế bào (tt).......................Trang 29 Bảng 3: Kết quả nhuộm Gram và đo hình dạng tế bào (tt).......................Trang 30 DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Lúa hoang ( Oryza rufipogon Griff.) ..........................................Trang 12 Hình 2: Qui trình phân lập Azospirillum trên lúa ....................................Trang 17 Hình 3: Sự phát triển của vi khuẩn Azospirillum tạo dòng pellicle cách mặt môi trường NFb bán đặc 2-5mm và làm thay đổi màu môi trường ....Trang 21 Hình 4: Sự phát triển của vi khuẩn Azospirillum môi trường đĩa petri NFb đặc làm thay đổi màu môi trường.....................................................Trang 22 Hình 5: Ảnh chụp dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần cho thấy vi khuẩn Azospirillum bắt màu hồng khi nhuộm Gram ..............Trang 28 Hình 6 : Kết quả điện di các dòng vi khuẩn Azospirillum với cặp mồi chuyên biệt Azospirillum lipoferum. ......................................................Trang 31 TÓM LƯỢC 44 dòng vi khuẩn Azospirillum được phân lập từ lúa hoang, lúa mùa và lúa cao sản tại một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Các dòng vi khuẩn Azospirillum phân lập được có một số đặc tính giống như mô tả của các tác giả khác trước đây. Chúng có chung các đặc điểm: vi khuẩn Gram âm, chuyển động được, hình que ngắn hay que dài, que ngắn dính nhau thành cặp, khuẩn lạc màu trắng trong, xanh...Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt thiết kế dựa trên gen nifH, chúng tôi nhận diện được 2 dòng vi khuẩn thuộc loài Azospirillum lipoferum là AR8 và AR41. Từ khóa: Azospirillum lipoferum, lúa hoang, PCR, nifH. ABSTRACT Forty four strains of Azospirillum were isolated from the root system of Trung tâwmildHricọec, wliinệteur cĐroHp anCdầhinghTphroơduc@tivitTy àrici eliiện usomheọpcrotvậinpesvoàf thnegMheikêonng cứu Delta. These strains have some characteristics which are the same to the descriptions of previous research. All of them are negative Gram, motile, short rods or long rods, short rods in pair, white or blue colony... Using PCR technique with specific primers of nifH gen, 2 strains AR8 and AR41 strains were identified Azospirillum lipoferum. Key words: Azospirillum lipoferum, wild rice, PCR, nifH. PHẦN I - ĐẶT VẤN ĐỀ Cây lúa (Oryza sativa L.) thuộc họ Hòa Bản, là cây lương thực quan trọng cho khoảng 3 tỷ người trên thế giới, đặc biệt ở các nước đang phát triển như Việt Nam. Năm 2007, sản lượng lúa thế giới đạt khoảng 645 triệu tấn (International Rice Research Institute (IRRI), 2007). Trong tình hình dân số thế giới đông (hơn 6,6 tỷ người) ngày càng tăng như hiện nay, nhu cầu về lương thực là rất quan trọng. Theo dự đoán của các chuyên gia về dân số học, nếu dân số thế giới tiếp tục gia tăng trong vòng 20 năm tới, thì sản lượng lúa gạo phải tăng 80% mới đáp ứng cho nhu cầu sống còn của cư dân mới. Trong điều kiện eo hẹp đó, người ta phải suy nghĩ đến một chiến lược để tăng sản lượng lúa gạo. Một trong những chiến lược quan trọng là ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất nông nghiệp và qua đó, hi vọng sẽ đem lại cho thế giới một nguồn thực phẩm an toàn và có giá trị kinh tế cao. Ở Việt Nam, Đồng Bằng Sông Cửu Long được xem là vựa lúa lớn nhất của cả nước, cung cấp hơn 52% sản lượng lúa cả nước ( Trung tâtmhuyHet/ọdocngl-ibệaung-ĐsoHng-Ccuầu-nlonTgh_4ơ71@.htmTl).àĐiểlicệuung hcấọpcđủtậlưpơnvgàthựncgthhìiêtănng cứu năng suất cây trồng là điều quan trọng vì diện tích đất canh tác không thể mở rộng thêm được mà ngày càng bị thu hẹp. Muốn đạt năng suất cao chúng ta phải kiểm soát tốt các điều kiện ngoại cảnh như: nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ, nước, phòng trừ sâu bệnh,…Trong đó việc bón phân được xem là nhân tố quan trọng vì nó quyết định năng suất cây trồng và mùa vụ. Đạm được xem là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng đối với cây trồng. Việc cung cấp đạm cho cây trồng từ phân bón là vô cùng quan trọng nhằm đáp ứng nhu cầu sinh trưởng, phát triển của cây và phần nào bù đắp lại lượng đạm mà cây trồng đã lấy đi từ đất qua các vụ mùa. Để đạt được năng suất cao, nông dân phải dùng rất nhiều phân bón hóa học đặc biệt là đạm vì nó là nguồn dinh dưỡng chính giúp cây phát triển. Điều này đã nảy sinh nhiều mối lo ngại. Hầu hết phân bón hóa học được sản xuất theo qui trình Haber - Borsch, cần rất nhiều khí tự nhiên, than hay xăng, tất cả các nguồn năng lượng này đều thuộc dạng tài nguyên không phục hồi được. Điều này sẽ dẫn đến cạn kiệt nguồn tài nguyên thiên nhiên. Hơn nữa việc sản xuất phân bón sẽ sinh ra khí CO2 là một trong những nguyên nhân gây ra hiệu ứng nhà kính (Shenoy và ctv, 2001). Khi bón phân đạm vào đất, cây trồng chỉ hấp thu khoảng 40 - 50% lượng phân bón, lượng còn lại bị nước mưa, nước tưới rửa trôi, hoặc bị chuyển hóa và bốc hơi ở dạng NH3, NOx, N2 (Nguyễn Huy Phiêu, 2000). Bên cạnh đó, sự lạm dụng quá nhiều phân bón hóa học để gia tăng năng suất đã làm cho đất đai ngày càng bạc màu, độ phì nhiêu kém dần, tình trạng ô nhiễm nguồn nước mặt gây nên hiện tượng nước nở hoa, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe và môi trường sống của con người cũng như các sinh vật khác trong tự nhiên (Shenoy và ctv, 2001; Huỳnh Thu Hòa, 2006). Vì vậy, việc gia tăng bón phân đạm hóa học chỉ là giải pháp tạm thời, không thể áp dụng lâu dài bởi chúng phát sinh nhiều mối lo ngại. Việc nghiên cứu và sử dụng phân sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật, đã được nhiều nước trên thế giới quan tâm trong đó có Việt Nam, nhằm tạo ra một sản phẩm sạch, giảm bớt chi phí đầu tư sản xuất trong nông nghiệp và bảo vệ môi trường hướng tới xây dựng một nền nông nghiệp bền vững. Trung tâm HQọuacnlhiệiềuu nĐghHiênCcầứun, dTòhngơvi@khuTẩnàiAzlioệspuirihlluọmc ctóậpkhảvànănnggchố iêđịnnh cứu đạm giúp tăng suất cây trồng đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu. Dòng Azospirillum với nhiều đặc điểm thuận lợi như: có khả năng cố định đạm tự do trong không khí, tổng hợp được các chất kích thích sinh trưởng làm hệ thống rễ phát triển vững chắc, hấp thu nước và chất dinh dưỡng tốt (Okon, 1985). Việc nghiên cứu và ứng dụng các dòng Azospirillum làm phân bón trong nông nghiệp là rất cần thiết, đặc biệt trên lúa nhằm thay thế một lượng đạm hóa học đáng kể cho cây, bảo vệ môi trường và góp phần bảo vệ sức khoẻ cộng đồng. Đồng thời, gia tăng sản lượng lúa, tăng thu nhập cho người nông dân. ¶ Mục tiêu đề tài: Phân lập một số dòng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum trên cây lúa. PHẦN II - LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU I. Giới thiệu về cây lúa 1. Oryza sativa L. Cỏ nhất niên, cao 0,5 - 1,7m. Lá có phiến dài, bìa hơi “cắt”, bẹ dài, có mép cao trắng, tai cong, có lông. Chùm tụ tán, dĩnh nhỏ, hoa 1, tiểu nhụy 6, chỉ dài. Dĩnh quả (hạt gạo lức) dính chặt vào trấu (hạt lúa), 2n = 24 (Phạm Hoàng Hộ, 2000). 2. Oryza rufipogon Griff. (Lúa hoang hay lúa ma). Nê thực vật đa niên nổi, có thân nằm rồi đứng, dài 1,5 - 4m, thân to 4 - 6 mm, lóng dài 10cm. Lá có phiến dài vào 20cm, rộng vào 1cm, mép các lá dưới cao hơn 1,5 - 3cm, có rìa lông. Chùm tụ tán đứng cao 10 - 15cm, gié hoa, nâu nâu, dài 7 - 9,5mm, rộng 1,8 - 1,9mm, có lông gai dài đến 11cm, dĩnh mỏng, cao 3mm (Phạm Hoàng Hộ, 2000). Cây lúa hoang (Oryza rufipogon) mọc hoang ở các nơi đầm lầy, hoặc dọc theo các kênh mương ở Đồng Tháp Mười, và các vùng nước sâu trung bình ở Trung tâcmác tHỉnhọCcầnliệThuơ,ĐVHĩnhCLoầnng, TTihềnơGi@ang.TNàăni glisệuuất lhúaọrcất tthậấpp, vkhàoảnngg0h,2iêđnến cứu 0,4 tấn/ ha. Ngày nay, khi các cánh đồng đã phủ kín lúa cao sản thì cây lúa hoang gần như bị tiêu diệt hết, vì vậy để bảo tồn nguồn gen quí này người ta đã đưa giống lúa hoang sang viện lúa Quốc Tế IRRI để lưu trữ ( viettribune. com /vt/ index.php?id=629). 3. Đặc điểm sinh trưởng của lúa. Thời gian sinh trưởng tính từ lúc nảy mầm cho đến lúc chín khoảng 90 đến 180 ngày, tùy theo giống, điều kiện ngoại cảnh và thời vụ gieo cấy. Về mặt nông học có thể chia thành 3 thời kỳ: sinh trưởng dinh dưỡng từ lúc nảy mầm; sinh trưởng sinh sản từ làm đòng đến trổ bông và thời kỳ chín từ trổ bông đến thu hoạch. Nắm được qui luật sinh trưởng, phát triển của cây lúa, chúng ta có thể chủ động áp dụng các biện pháp kỹ thuật theo hướng có lợi nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển nhằm tạo năng suất cao. 4. Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam. Đối với Việt Nam cây lúa có vai trò quan trọng trong việc giải quyết nhu cầu lương thực cho nhân dân. Gắn liền với quá trình phát triển của lịch sử, cây lúa được coi là người bạn gần gũi nhất đối với đồng ruộng và người nông dân. Với tập quán canh tác và tiêu dùng lúa gạo, hàng năm lúa gạo đáp ứng trên 80% nhu cầu lương thực của cả nước. Người ta thống kê được, sản lượng lúa vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long đã tăng từ 9,5 triệu tấn (năm 1990) lên 19,2 triệu tấn (năm 2007) ( và http: //www. sgtt.com.vn/detail3.aspx?newsid=32713&fld=HTMG/2008/0410/32713). Vụ lúa đông xuân năm 2008, tổng sản lượng toàn vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long đạt 9,4 triệu tấn, tăng 300 ngàn tấn so với năm 2007. Tính chung cả nước thì vụ đông xuân năm 2008 này sản lượng lúa đạt 17,2 triệu tấn, tăng khoảng 200 ngàn tấn so với vụ trước ( /2008/4/27 /236353.tno). Các số liệu trên cho thấy cần đánh giá lại một cách nghiêm túc vai trò của lúa gạo cả nước nói chung và Đồng Bằng Sông Cửu Long nói riêng để đảm bảo vững chắc an ninh lương thực quốc gia và ổn định lượng gạo xuất khẩu. II. Tầm quan trọng của đạm đối với lúa. Trung tâm Học ĐliạệmulàĐmHột cChấầt ncóTvahi ơtrò @quanTtàrọingliệtrounghđọờci sốtậngpthvựàc vnậtgvhà iđêộnng cứu vật. Đạm là cơ cấu của protein, nhất là của protein nhân, chiếm khoảng 2 - 4% trọng lượng của chất khô, nó còn là cơ cấu của diệp lục tố, pyrimidine và purine, thành phần cấu trúc của một số vitamin nhóm B (B1, B2, B6,…) và các hợp chất khác (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Đạm là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng hàng đầu đối với sự sống tế bào, là yếu tố giới hạn năng suất cây trồng (Shenoy và ctv, 2001). Bón phân đạm thúc đẩy quá trình tăng trưởng của cây trồng, giúp cây ra nhiều nhánh, phân cành, ra nhiều lá, lá có kích thước to giúp cây quang hợp mạnh. Do đó, khi bón phân đạm sẽ giúp gia tăng năng suất và chất lượng sản phẩm (Vũ Hữu Yêm, 1995). Theo Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn (2004) cây thiếu đạm thường sinh trưởng kém, diệp lục tố khó thành lập nên lá thường bị vàng úa, cây còi cọc, lùn, năng suất kém; số lá, số chồi, số nhánh ít, kích thước lá nhỏ. Thừa đạm lá có màu xanh đậm, kích thước lá tăng, nhất là về mặt diện tích lá; cây thường có hệ thống rễ kém phát triển; lá mỏng, kém hấp thu năng lượng ánh sáng mặt trời, dễ bị côn trùng phá hoại, đồng thời dễ đổ ngã dẫn đến năng suất giảm. Đối với cây lúa, đạm là yếu tố rất quan trọng quyết định năng suất, mùa vụ. Mất khoảng 1kg đạm để sản xuất 15 - 20kg lúa (Shenoy và ctv, 2001). Trong cây lúa, đạm tập trung nhiều ở phiến lá hơn là các cơ quan khác và cũng là nguồn protein chủ yếu cho sự hình thành hạt, chính vì vậy đạm mang lại hiệu quả cao trong thực tế sản xuất rõ hơn các yếu tố khoáng khác. Theo Nguyễn Huy Phiêu (2000), bình quân từ một ha đất lúa có thể huy động được 30 - 50kg đạm, nhưng một vụ lúa một ha đất mất đi tới 150kg đạm. Nếu không bón đủ để bù đắp lượng dinh dưỡng lấy đi do nông phẩm cũng như thất thoát do rửa trôi thì không thể duy trì độ phì nhiêu và nâng cao năng suất cây trồng được. Người ta dự đoán, nhu cầu phân đạm ở Việt Nam sẽ tăng từ 1.271.000 tấn (năm 2000) lên 1.627.000 tấn (năm 2010) ( org/vietnam/fertilizer.html). III. Sự cố định đạm sinh học. Trung tâm Học KlihệíuquĐyểHn làCnầgunồnTdhựơtrữ@đạmTàNi2 lriệấtulớhn,ọtrcontgậkphovảàng nkhgôhngiêknhí cứu bên trên mỗi km2 đất đai có khoảng 8 triệu tấn nitơ. Tuy nhiên, loại nitơ này cây + trồng không thể hấp thu được trực tiếp mà phải được vi sinh vật biến đổi thành NO3− hoặc khử thành NH4 . Một số loài vi sinh vật có thể khử N2 thành NH3 và được gọi là sự cố định đạm sinh học (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Sự cố định đạm sinh học có thể đạt được 175 triệu tấn mỗi năm ( microbiologyprocedure.com/nitrogen-fixation/biological-nitrogen-fixation.htm). Trong tự nhiên sự cố định đạm sinh học đã đóng góp một lượng lớn (khoảng 30 kg đạm/ha/vụ) cho cây trồng hấp thu khi mà phân đạm hóa học chỉ được cây trồng sử dụng 30 - 40% (Boddy and Dobereiner, 1984). Sự cố định đạm sinh học phụ thuộc vào hoạt động của enzyme nitrogenase được xúc tác bởi năng lượng. Để thực hiện phản ứng này cần cung cấp 17 ATP và enzyme nitrogenase để phá vỡ liên kết ba của phân tử nitơ. Nitrogenase là một phức hợp enzyme, chúng cấu tạo bởi 2 thành phần là protein sắt và protein sắt - molybden. Nitrogenase không chỉ xúc tác việc khử N2 thành NH3 mà còn có thể xúc tác việc khử C2H2, , HCN,…thành các sản phẩm tương ứng như: C2H4, CH3NH2… (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 1997). Theo Evans và Barber (1977) thì quá trình cố định đạm xảy ra như sau: Nitrogenase N2 + H2 + 6e NH3 NH3 được tạo thành sẽ kết hợp với acid hữu cơ tạo thàn