Luận văn Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm mốc có hoạt tính Chitinase cao tại tỉnh Đắk Lắk

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN s NGUYỄN VĂN BỐN PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH CHITINASE CAO TẠI TỈNH ĐẮK LẮK LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN NGUYỄN VĂN BỐN PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH CHITINASE CAO TẠI TỈNH ĐẮK LẮK Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 604230 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Anh Dũng BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Người cam đoan Nguyễn Văn Bốn LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn: Thầy PGS.TS Nguyễn Anh Dũng đã dành nhiều thời gian, tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành luận văn này. Cô TS. Võ Thị Phương Khanh, thầy TS. Ngô Đại Nghiệp đã có nhiều ý kiến quý báu đóng góp, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Quý thầy cô giáo trường Đại học Tây Nguyên, khoa KHTN và CN, Phòng Đào tạo Sau đại học, ban giám hiệu nhà trường đã tận tình giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian khoá học. Các bạn sinh viên: Hạnh, Vui, Cương, Cường, Lữ lớp CN Sinh K07 và Được, Thảo, Hoài, Danh, Lựu, Ana, Oánh, Luận lớp CN Sinh K08 đã tham gia tích cực trong quá trình tôi thực hiện đề tài này. Các thầy cô trong bộ môn Sinh học thực nghiệm đã tạo mọi điều kiện về thời gian, động viên tinh thần cho tôi trong suốt khóa học. Các anh chị em trong lớp Cao học Sinh học thực nghiệm K3 đã đoàn kết giúp đỡ, chia sẻ và động viên tôi trong suốt 3 năm học cao học. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn sâu sắc những người thân trong gia đình: Bố, mẹ, Các anh trai, các chị dâu, các cháu, vợ và con trai, gia đình bố mẹ vợ đã là chỗ dựa vững chắc cho tôi về tình cảm cũng như vật chất cần thiết giúp tôi có nghị lực để công tác, và phấn đấu. Nguyễn Văn Bốn CÁC CHỮ VIẾT TẮT - HTch: Hoạt tính chung chitinase - HTr: Hoạt tính riêng chitinase - [chitin]: Nồng độ chitin - ĐC: Đối chứng - GlcNAc: N-acetyl glucosamine - DNS: Acid 3,5 dinitrosalicylic - UI: đơn vị hoạt độ MỤC LỤC Mở đầu 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu của đề tài 1 3. Ý nghĩa khoa học 2 4. Ý nghĩa thực tiễn 2 Chương 1. Tổng quan tài liệu 1.1. Tổng quan về chitin và chitinase 3 1.1.1. Chitin 3 1.1.1.1. Cấu tạo chitin 3 1.1.1.2. Phân bố và số lượng 3 1.1.1.3. Đặc điểm khác 4 1.1.1.4. Ứng dụng 5 1.2. Chitinase (EC 3.2.1.14) 6 1.2.1. Khái niệm 6 1.2.2. Phân loại chitinase 7 1.2.2.1. Dựa vào cấu trúc phân tử 7 1.2.2.2. Dựa vào trình tự amino acid 7 1.2.2.3. Dựa vào phản ứng phân cắt 9 1.2.3. Các nguồn thu nhận enzyme chitinase 9 1.2.3.1. Chitinase vi khuẩn 9 1.2.3.2. Chitinase nấm 10 1.2.3.3. Chitinase thực vật 10 1.2.3.4. Chitinase động vật 11 1.2.4. Các đặc tính cơ bản của enzyme chitinase 11 1.2.4.1. Khối lượng phân tử 11 1.2.4.2. Điểm đẳng điện - Phổ hấp thu - Hằng số Michaelis 11 1.2.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ 12 1.2.4.4. Ảnh hưởng của pH 12 1.2.4.5. Chất tăng hoạt, chất ức chế 12 1.2.4.6. Sự ổn định 14 1.2.5. Các loại cơ chất của enzyme chitinase 14 1.2.5.1. Chitin 14 1.2.5.2. Các dẫn xuất của chitin 14 1.2.6. Cơ chế tác động của các loại enzyme chitinase 15 1.3. Tổng quan về nấm mốc 15 1.3.1. Khái niệm 15 1.3.2. Hình dạng và kích thước 16 1.3.3. Cấu tạo tế bào sợi nấm 17 1.3.4. Dinh dưỡng và tăng trưởng của nấm mốc 17 1.3.5. Vị trí và vai trò của nấm mốc 18 1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 19 Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.1. Nội dung nghiên cứu 23 2.2. Vật liệu và thiết bị 23 2.3. Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1. Địa điểm thu thập mẫu 23 2.3.2. Các loại môi trường 23 2.3.3. Phương pháp phân lập 24 2.3.4. Phương pháp tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 24 2.3.5. Xác định hoạt độ chitinase theo phương pháp định lượng đường khử với thuốc thử DNS 25 2.3.6. Phương pháp định danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 28 2.3.7. Tối ưu hóa môi trường và điều kiện nuôi cấy các chủng nấm mốc tuyển chọn nhằm thu nhận chitinase có hoạt tính cao 28 2.3.8. Nghiên cứu xác định tác nhân tủa phù hợp 29 2.3.9. Xác định tính chất cơ bản của chitinase 30 2.3.9. Xử lý số liệu 33 Chương 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase tại Đăk Lăk 34 3.2. Tuyển chọn và định danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 37 3.2.1. Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 37 3.2.2. Định danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 40 3.3. Tối ưu hóa môi trường và điều kiện nuôi cấy các chủng nấm mốc tuyển chọn nhằm thu nhận chitinase có hoạt tính cao 42 3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ chitin trong môi trường nuôi cấy 42 3.3.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy 43 3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 45 3.3.4. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy 46 3.3.5. Ảnh hưởng của tốc độ lắc 48 3.3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 49 3.4. Tác nhân tủa phù hợp cho quá tình tách chiết chitinase từ nấm mốc Penicillium janthinellum 50 3.5. Xác định một số tính chất cơ bản của chitinase từ nấm mốc Penicillium janthinell 52 3.5.1. Xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính chitinase 52 3.5.2. Xác định pH tối ưu cho hoạt tính chitinase 53 3.5.3. Xác định nồng độ cơ chất tối ưu cho hoạt tính chitinase 54 3.5.4. Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt tính chitinase 56 3.5.5. Xác định thời gian phản ứng tối ưu 57 3.5. Tinh sạch chitinase 58 Kết luận và kiến nghị 61 Tài liệu tham khảo 62 Phụ lục 67 DANH MỤC BẢNG Bảng 3 .1. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk ..... 34 Bảng 3.2. Hàm lượng đường khử trong dịch nuôi cấy và hoạt tính chitinase của các chủng nấm mốc .................................................................................................... 37 Bảng 3.3. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các nồng độ chitin khác nhau ...................................................................................... 43 Bảng 3.4. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy bổ sung các nguồn nitơ khác nhau ..................................................................................... 44 Bảng 3.5. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau ............................................................................................... 46 Bảng 3.6. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các pH khác nhau ....................................................................................................... 47 Bảng 3.7. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các tốc độ lắc khác nhau ............................................................................................. 48 Bảng 3.8. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy trong các khoảng thời gian khác nhau ............................................................................ 49 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tác nhân tủa đến hiệu suất thu hồi và hoạt tính chitinase của nấm mốc Penicillium janthinellum ....................................................................... 51 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt tính chitinase .............. 55 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hoạt tính chitinase ................. 57 Bảng 3.12. Hàm lượng protein, HTch, HTr trước và sau khi lọc gel ..................... 59 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc của chitin ................................................................................. 3 Hình 2.1. Phản ứng phân cắt chitin bằng chitinase ............................................... 25 Hình 2.2. Phản ứng của đường khử với thuốc thử DNS ....................................... 25 Hình 3.1 . Hoạt tính chitinase của các chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk ............... 39 Hình 3.2 . Ảnh hưởng của nồng độ chitin đến hoạt tính chitinase ......................... 43 Hình 3.3 . Ảnh hưởng của nguồn Nitơ đến hoạt tính chitinase .............................. 44 Hình 3.4 . Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt tính chitinase ..................... 46 Hình 3.5 . Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến hoạt tính chitinase .......... 47 Hình 3.6 . Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến hoạt tính chitinase ................................. 49 Hình 3.7 . Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt tính chitinase ..................... 49 Hình 3.8 . Ảnh hưởng của tác nhân tủa đến hiệu suất thu hồi protein và hoạt tính chitinase của nấm mốc Penicillium janthinellum .................................... 52 Hình 3.9 . Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính chitinase .................... 53 Hình 3.10 . Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính chitinase ........................................ 54 Hình 3.11 . Ảnh hưởng của nồng độ chitin đến hoạt tính chitinase ....................... 55 Hình 3.12 . Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt tính chitinase ............... 56 Hình 3.13 . Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hoạt tính chitinase ................ 57 Hình 3.14 . Kết quả đo mật độ quang dịch protein sau lọc gel Sephadex .............. 59 Hình 3.15 . Ảnh hưởng của phương pháp lọc gel tới hàm lượng protein, HTch, HTr của chitinase .......................................................................................... 60 Hình 3.16 . Kết quả đo mật độ quang dịch protein sau tinh sạch bằng cột chitin .. 60 Hình 3.17 . Hình 3.17. Vòng phân giải chitin ....................................................... 60 DANH MỤC ẢNH Ảnh 3.1 Khuẩn lạc của 34 chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk ......................... 37 Ảnh 3.2 Hình thái của 3 chủng nấm mốc D4, D9, D31 ........................................ 41 MỞ ĐẦU 1 2 1 1. Đặt vấn đề Oligo N – acetyl – Glucosamine (một sản phẩm của quá trình thủy phân chitin) đã được biết đến như một loại thuốc quý, một loại thuốc đa hiệu được sử dụng để chữa trị nhiều bệnh như: bệnh khớp, bệnh viêm phổi, bệnh viêm dạ dày,...Ngoài ra, Oligo N- acetyl – Glucosamine còn có khả năng chống khối u, kháng nấm và kháng vi khuẩn [1]. Chính vì có đặc tính quý như vậy mà việc sản xuất Oligo N – acetyl – Glucosamine đang được quan tâm. Oligo N – acetyl – Glucosamine được thu nhận bằng cách thủy phân chitin dưới sự xúc tác của enzyme chitinase. Trong tự nhiên, chitinase có thể được tách chiết từ nhiều nguồn khác nhau: động vật (tuyến tuỵ, và dịch dạ dày cá; dịch ruột của ốc sên;...), thực vật (mủ cao su, thuốc lá, lúa mì, cà rốt,...), các loài chân khớp (arthropods) [17]...Tuy nhiên, quy trình thu nhận chitinase từ các nguồn này khá phức tạp, không thể tiến hành tự động hoá [25][26], do đó giá thành chế phẩm cao và cũng không thể đáp ứng đủ nhu cầu thực tế . Trong tự nhiên, còn có một nguồn quý giá và vô tận để thu nhận enzyme. Đó chính là vi sinh vật. Trong số các đối tượng vi sinh vật, nấm mốc là một nguồn khá phổ biến để thu nhận nhiều loại enzyme, trong đó có chitinase [25]. Trong nước cũng như trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về chitinase [13]. Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có một nghiên cứu nào về phân lập và sàng lọc các chủng nấm mốc để thu nhận chitinase mang tính hệ thống ở khu vực Tây Nguyên, cụ thể là ở Đắk Lắk được công bố trên các tạp chí trong và ngoài nước. Để góp phần tham gia vào việc nghiên cứu enzyme chitinase từ vi sinh vật tại Tây Nguyên, chúng tôi đề xuất đề tài “Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao tại tỉnh Đắk Lắk”. 2. Mục tiêu của đề tài - Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng phân giải chitin. - Xây dựng quy trình tách chiết chitinase và xác định một số tính chất cơ bản của chitinase tách chiết từ môi trường nuôi cấy nấm mốc. 2 3. Ý nghĩa khoa học Kết quả của đề tài góp phần vào việc nghiên cứu enzyme chitinase từ vi sinh vật cụ thể là từ nấm mốc trên địa bàn tỉnh Đắk Lắk. 4. Ý nghĩa thực tiễn Sản phẩm của đề tài là một số chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao được tuyển chọn. Từ các chủng này, có thể đưa vào sản xuất chitinase thương phẩm dùng cho nhiều mục đích khác nhau hoặc sử dụng trực tiếp các chủng này để khảo sát khả năng đối kháng với một số nấm bệnh hướng tới tạo chế phẩm sinh học có hoạt tính kháng bệnh cho cây trồng. 3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 3 Hình 1.1. Cấu trúc của chitin 1.1. Tổng quan về chitin và chitinase 1.1.1. Chitin [17][23] 1.1.1.1. Cấu tạo chitin Chitin có công thức hóa học (C8H13NO5)n trong đó C chiếm 47,29%, H chiếm 6,45%, N chiếm 6,89% và O chiếm 39,37%. Ở dạng tự nhiên, chitin là một chất rắn màu trắng vô định hình, dai, có sợi, phụ thuộc vào nguồn gốc và phương pháp thu nhận. Về cấu trúc, chitin (còn gọi là poly-[1,4-(N-acetyl-β-D-glucosamine)]) là một polysaccharide bao gồm các gốc N-acetyl-D-glucosamine [GlcNAc], còn gọi là (1->4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucose] gắn với nhau bằng liên kết β-1,4-O-glycoside. Về mặt cấu trúc lập thể, chitin có 3 dạng: α, β, δ. Sự khác nhau này biểu hiện ở sự sắp xếp các chuỗi. Ở α-chitin các chuỗi xuôi và ngược xen kẽ nhau, ở β- chitin thì cùng hướng và ở δ-chitin có 2 chuỗi xuôi xen kẽ với 2 chuỗi ngược. Dạng chiếm nhiều nhất là α-chitin. 1.1.1.2. Phân bố và số lượng Chitin có mặt ở nhiều nhóm sinh vật khác nhau. Ở nấm, chitin là thành phần chính yếu và kết hợp với các hợp chất khác tạo ra thành của khuẩn ty và bào tử nấm sợi như: Chytridiaceae, Blastodiaceae, Ascomycetes, Basidiomycetes. Ở những loài động vật không xương sống như: Crustacea (giáp xác), Onychophora (nhóm có móng), Myriapoda (đa túc) và Arachnida (nhện), chitin đóng vai trò là 4 bộ xương ngoài dưới dạng phức hợp chitin-protein. Tỉ lệ chitin : protein thông thường khoảng 55 : 45 và tỉ lệ này thay đổi trong suốt quá trình phát triển và khác nhau giữa các loài. Ở Insecta (côn trùng), chitin là vỏ bọc cơ thể và màng bao chất dinh dưỡng. Ngoài ra, chitin còn có ở tảo lục và nhuyễn thể (Mollusca), trùng đốt (Annelida), ruột khoang (Coelenterata-Cnidaria). Ở các loài thực vật, chitin và đường amin đóng vai trò không quan trọng trong quá trình trao đổi chất hay về cấu trúc hình thái. Về số lượng, chitin là một trong ba loại polysaccharide phong phú nhất trong thiên nhiên (cellulose, tinh bột và chitin). Chitin đứng ở vị trí thứ hai sau cellulose. Chitin và cellulose tương ứng với nhau về nhiều điểm về cấu tạo và chức năng. Về chức năng, chúng đều là những polysaccharide cấu trúc. Về cấu trúc phân tử, chitin có cấu trúc tương tự cellulose ngoại trừ nhóm -OH ở C2 được thay thế bằng một nhóm acetylamine. Chitin có thể thay thế một phần hay toàn bộ cellulose hoặc glucan trong thành tế bào nấm và vài loại tảo. 1.1.1.3. Đặc điểm khác Chitin không tan trong nước, dung dịch kiềm loãng và thuốc thử Schweitzer. Chitin có thể tan trong một số dung dịch như HCl đậm đặc, HNO3, acid fomic khan và một số muối trung tính. Nếu đun nóng chitin trong dung dịch kiềm mạnh, một phần nhóm N-acetyl bị khử (deacetyl hóa) tạo thành chitosan. Ngược lại, trong dung dịch HCl đậm đặc, quá trình thủy phân chitin xảy ra ở các nối β-1,4- glycoside làm [α]D từ -14 o dần đổi sang +56o, sau đó là sự thay đổi ở các nhóm acetyl. Độ nhớt của chitin trong dung dịch acid nitric là 14,3.10-3 đối với chitin nguyên chất từ vỏ cua, 13,1.10-3 đối với chitin từ nấm. Các giá trị này xấp xỉ như nhau chứng tỏ khối lượng của chúng gần như nhau. Trong việc định tính cũng như so sánh chitin từ những nguồn thực vật, động vật khác nhau, phương pháp nhiễu xạ tia X có lẽ là phương pháp vật lý duy nhất có ý nghĩa và có giá trị. Trong khi đó, các phương pháp định lượng chitin đều có độ chính xác giới hạn, những điều kiện cần thiết cho việc tinh chế chitin có khả năng làm thay đổi polysaccharide này, vì vậy khó đạt được chitin tinh khiết. Ngoài ra, 5 người ta có thể tạo thành chitin từ Uridin-diphosphate-N-acetyl-D-Glucosamine nhờ enzyme chitin synthetase (EC 2.4.1.16) ly trích từ nấm. 1.1.1.4. Ứng dụng Với kỹ thuật chế biến hiện đại, chitin và các dẫn xuất của chúng có một tiềm năng to lớn đặc biệt là trong các lĩnh vực như y sinh học, dinh dưỡng, chế biến thực phẩm, dược phẩm, vi sinh, nông nghiệp và mỹ phẩm. Chitin có thể ứng dụng làm chất phụ gia trong thực phẩm, tạo độ bền dai cho thực phẩm thay thế một số chất không cho phép (như hàn the). Chitin làm chất mang trong cố định enzyme hay cố định tế bào, làm chất mang tạo các giá thể trồng cây cảnh. Còn chitosan, dẫn xuất của chitin, có độ bền dai, đàn hồi, có thể tạo thành các màng mỏng gần như trong suốt, sử dụng các màng chitosan để bảo quản các loại trái cây, làm màng bao thuốc, màng bao thực phẩm (thịt nguội, lạp xưởng) còn làm nguyên liệu để cố định enzyme hay cố định tế bào vi sinh vật. Chitosan được đánh giá cao trong hàng loạt những ứng dụng trong y học như: băng bó và làm lành vết thương, màng thẩm tích, chỉ khâu vết thương tự tiêu huỷ, nhân tố ổn định liposome, diệt vi khuẩn, diệt virus, chống ung thư, chất làm giảm lượng cholesterol trong máu, chất kích thích của hệ thống miễn dịch. Sự phân hủy tự nhiên của chitin rất quan trọng không chỉ trong chu trình tuần hoàn của carbon và nitơ mà còn tạo ra các chất phản ứng hóa học quan trọng. Các đơn phân của chitin và chitosan là N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) và glucosamine, là những tác nhân chữa bệnh viêm khớp xương mãn tính, viêm ruột và viêm dạ dày. Các oligomer có nguồn gốc từ chitin cũng có hoạt tính kháng khối u, kháng nấm, kháng khuẩn, là thành phần tạo nên glycolipid và glycoprotein có vai trò quan trọng trong sinh học và nhiều ứng dụng khác. Hàng ngàn bài báo về chitin và các dẫn xuất của chúng đã được xuất bản cùng với khoảng gần 200 bằng sáng chế đã được lưu hành tại Mỹ. Các công trình nghiên cứu và bằng sáng chế về các chế phẩm này cũng đã xuất hiện ở nhiều nước trên thế giới. Các nhà khoa học từ hàng chục nước trên thế giới trong đó có Mỹ và Nga đã tập trung lại 3 năm một lần để trao đổi các bài báo, nghiên cứu khoa học mới nhất về chitin và các dẫn xuất của chúng. Những điều đó cho thấy chitin và 6 các dẫn xuất của chúng rất được quan tâm trên thế giới vì khả năng ứng dụng rất rộng cùng với những đặc tính đặc biệt của chúng. Hàng năm chitin được sản xuất ra khoảng 5.11 triệu tấn trên toàn thế giới. Nhật và Mỹ là những nước sản xuất chitin lớn nhất. Ở Việt Nam, chitin chủ yếu là phế phụ liệu dạng rắn với số lượng khổng lồ được thải ra hằng ngày từ ngành công nghiệp chế biến và xuất khẩu thủy hải sản. Vỏ của tôm (tôm hùm, tôm thẻ), cua và các loài giáp xác trên biển là nguồn cung cấp chitin tốt nhất. Trong vỏ tôm cua, chitin chiếm từ 20-50% khối lượng khô, khoảng 12% trong tôm nước ngọt, còn lại là các chất vô cơ, chủ yếu là carbonate calci. Nếu tận dụng được nguồn cung cấp chitin này thì vừa giảm thiểu ô nhiễm môi trường, vừa tạo thành các sản phẩm thực sự có giá trị [4]. 1.2. Chitinase (EC 3.2.1.14) [17][23][25][26] 1.2.1. Khái niệm Chitinase là enzyme thủy phân chitin thành các N-acetylglucosamine, chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy phân liên kết β-1,4-glycoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetylglucosamine liên kết với nhau trong chitin. Enzyme này có ở nhiều loài khác nhau như thực vật, động vật không xương sống, côn trùng, chân khớp, nấm, vi khuẩn và virus. Chân khớp và nấm cần chitinase trong sự phân chia tế bào để tăng trưởng. Chitinase được tạo thành trong suốt quá trình sinh trưởng của nấm. Đối với nấm mốc, chitinase tham gia nhi