Luận văn Phân tích biến đổi của gen cxcl12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------  ------- PHẠM THỊ BÍCH PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN CXCL12 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------------------- Phạm Thị Bích PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN CXCL12 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Trịnh Hồng Thái Hà Nội – 2012 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Trịnh Hồng Thái, người thầy đã rất quan tâm, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này. Trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các anh chị và các bạn sinh viên làm việc tại Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, trường Đại học Khoa học tự nhiên. Tôi xin chân thành cảm ơn. Để thực hiện tốt luận văn này, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của cán bộ nhân viên thuộc khoa Trữ máu của Viện huyết học và Truyền máu Trung Ương; khoa Tế bào và Giải phẫu bệnh thuộc Bệnh viện K- Tam Hiệp, Hà Nội. Tôi xin chân thành cảm ơn. Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên và luôn bên tôi trong suốt thời gian qua. Hà Nội, tháng 03 năm 2012 Học Viên Phạm Thị Bích MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3 1.1. TÌM HIỂU VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG .............................................. 3 1.1.1. Khái quát về ung thư .......................................................................... 3 1.1.2. Ung thư đại trực tràng là gì ................................................................ 4 1.1.3. Các tác nhân gây ung thư đại trực tràng.............................................. 4 1.1.4. Các hệ thống phân giai đoạn ung thư đại trực tràng ............................ 6 1.2. CHỈ THỊ SINH HỌC TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ...................... 8 1.2.1. Chỉ thị sinh học là gì ....................................................................... 8 1.2.2. Một số biến đổi về gen liên quan đến ung thư đại trực tràng ............... 9 1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH UNG THƯ12 1.4.CHEMOKINE CXCL12 VÀ VAI TRÒ TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 16 1.4.1. Chemokine .................................................................................................. 16 1.4.2. Chemokine CXCL12 và thụ thể của nó CXCR4 .......................................... 19 1.5. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH VÀ METHYL HÓA GEN CXCL12 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ................................................... 21 Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP............................................... 23 2.1. NGUYÊN LIỆU ............................................................................................. 23 2.1.2. Hóa chất ........................................................................................... 23 2.1.3. Thiết bị............................................................................................. 24 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 24 2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô ......................................................... 24 2.2.2. Tách chiết ADN tổng số từ máu ....................................................... 25 2.2.3. Khuếch đại gen CXCL12 bằng phương pháp PCR ........................... 27 2.2.4. Phân tích RFLP ................................................................................ 28 2.2.5. Khuếch đại vùng promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP ..... 29 2.2.6. Điện di kiểm tra sản phẩm ................................................................ 32 2.2.7. Kỹ thuật nhuộm bạc ......................................................................... 33 2.2.8. Dự đoán vùng promoter và xác định phân bố đảo CpG xung quanh vị trí khởi đầu phiên mã của gen CXCL12 ...................................................... 34 2.2.9. Phân tích số liệu bằng phương pháp thống kê ................................... 34 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 35 3.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH PCR - RFLP ............................................................ 35 3.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu ............................................... 35 3.1.2. Kết quả khuếch đại đoạn gen CXCL12 bằng PCR ........................... 36 3.1.3. Kết quả phân tích RFLP ................................................................... 37 3.1.4. Phân tích số liệu bằng phương pháp thống kê ................................... 41 3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TÌNH TRẠNG METHYL HÓA GEN CXCL12....... 47 3.2.1. Kết quả tách chiết ADN từ mẫu mô .................................................. 47 3.2.2. Kết quả xác định phân bố đảo CpG xung quanh vị trí khởi đầu phiên mã của gen CXCL12 .................................................................................. 48 3.2.3. Khuyếch đại đoạn trình tự nằm trong đảo CpG thuộc vùng promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP ......................................................... 52 3.2.4. Phân tích tích tình trạng methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12 ở bênh ung thư đại trực tràng ..................................................................... 53 KẾT LUẬN ........................................................................................................... 62 KIẾN NGHỊ .......................................................................................................... 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 64 PHỤ LỤC 1 .............................................................................................................. i PHỤ LỤC 2 ............................................................................................................. ii PHỤ LỤC 3 ............................................................................................................ iv PHỤ LỤC 4 ............................................................................................................ ix PHỤ LỤC 5 ............................................................................................................. x BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribo Nucleic AJCC American Joint Committee on Cancer APC Adenomatous polyposis coli APS Ammonium persulfate CEA Carcinoembryonic antigen (kháng nguyên ung thư) CIN Chromosomal instability (sự bất ổn định nhiễm sắc thể) CPG-CIMP CpG island methylator phenotype CRC Colorectal cancer (ung thư đại trực tràng) cs Cộng sự CXCL12 CXC ligand 12 (phối tử dạng CXC 12) CXCR4 CXC receptor 4 (thụ thể dạng CXC 4) DHPLC Denaturing high performance liquid chromatography FAP Familial adenomatous polyposis (hội chứng polyp u tuyến theo dòng họ) FOBT Fecal occult blood test (xét nghiệm máu trong phân) IUAC International Union Against Cancer HNPCC Hereditary nonpolyposis colon cancer (ung thư ruột kết không polyp di truyền) LOI Loss of imprinting (sự mất dấu ấn) MAPK Mitogen activated protein kinase MSI Microsatellite instability (sự bất ổn định vi vệ tinh) MSP Methyl specific polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp đặc hiệu methyl) NCBI National Center for Biotechnology Information PI3KCA Phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit PCR- RFLP Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism SNP Single nucleotide polymorphism (Đa hình nucleotide đơn) SSCP Single strand conformation polymorphism TBE Tris borate EDTA TE Tris - EDTA TEMED Tetramethylethylenediamine TGF β Transforming growth factor β (yếu tố tăng trưởng chuyển hóa β) TNF Tumor necrosis factor (Yếu tố gây hoại tử khối u) TNM Tumor- lymph node- metastases (khối u-hạch-di căn) UTĐTT Ung thư đại trực tràng NST Nhiễm sắc thể DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Phân biệt hai khái niệm u lành tính và ung thư theo đặc điểm sinh học Bảng 2 Các chemokine thuộc họ CXC Bảng 3 Các thành phần của phản ứng PCR Bảng 4 Các thành phần của phản ứng cắt sản phẩm PCR bằng enzyme FastDigest MspI Bảng 5 Thành phần phản ứng PCR (với thể tích 12,5 µl) Bảng 6 Thành phần bản gel polyacrylamide 10% (bản 7cm) Bảng 7 Phân bố genotype giữa mẫu bệnh và mẫu đối chứng theo vị trí khối u Bảng 8 Phân bố genotype theo giới tính của bệnh nhân Bảng 9 So sánh phân bố genotype giữa nhóm người bệnh trên 70 tuổi và dưới 70 tuổi Bảng 10 Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu đối chứng và mẫu bệnh theo vị trí khối u Bảng 11 Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu bệnh theo giới tính Bảng 12 Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu bệnh theo độ tuổi Bảng 13 Tỷ lệ methyl hóa và không methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12 trên mô u và mô lân cận u Bảng 14 Thống kê tỷ lệ methyl hóa trong vùng promoter của gen CXCL12 theo các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ung thư đại trực tràng DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Hình ảnh đại trực tràng và polyp đại tràng nội soi Hình 2 Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng Hình 3 Hình ảnh điện di ADN tổng số tách từ máu Hình 4 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của gen CXCL12 Hình 5 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 3 băng 302bp, 202bp và 100bp Hình 6 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 2 băng 202bp và 100bp Hình 7 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 3 băng 302bp, 202bp và 100bp (genotype dị hợp tử) Hình 8 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 1 băng 302bp Hình 9 Hình ảnh điện di ADN tổng số tách từ mô Hình 10 Kết quả khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm MethPrimer Hình 11 Kết quả khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm cpgplot Hình 12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của gen CXCL12 Hình 13 Tỷ lệ methyl và unmethyl khảo sát trên 2 loại mô u và lân cận u Hình 14 Hình ảnh điện di sản phẩm MSP của gen CXCL12 của bệnh nhân ung thư đại trực tràng Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học 1 MỞ ĐẦU Ung thư trực tràng là bệnh lý hay gặp trong ung thư đường tiêu hóa, đứng hàng thứ hai sau ung thư dạ dày và chiếm 1,4 % trong tổng số ung thư. Bệnh tiến triển tương đối chậm, di căn muộn, nếu phát hiện sớm, điều trị kịp thời và triệt để thì tỷ lệ sống trên 5 năm đạt 60-80% [26]. Tuy nhiên bệnh thường được phát hiện ở giai đoạn muộn khi đã di căn hay biến chứng, do đó hiệu quả điều trị rất hạn chế. Hàng năm, trên thế giới có khoảng 650.000 người được chẩn đoán mắc bệnh ung thư đại trực tràng và có khoảng 150.000 người chết vì căn bệnh này, đây là loại ung thư nguy hiểm đứng hàng thứ ba gây tử vong trên thế giới và đứng hàng thứ hai gây ra tử vong tại Mỹ. Tại Việt Nam, bệnh này chiếm khoảng 15% trong số các loại ung thư và đang gia tăng một cách rõ rệt. Gần đây, do sự thay đổi trong thói quen ăn uống giàu chất đạm, ít chất xơ, lạm dụng thức ăn nhanh khiến ung thư đại trực tràng ngày càng phổ biến. Tuổi mắc căn bệnh chết người này ngày càng trẻ hóa, nhiều trường hợp mới 18 - 20 tuổi, thậm chí có trẻ mới 12 đã mắc ung thư đại trực tràng [30]. Trên thế giới ung thư đại trực tràng luôn được các nhà sinh y học quan tâm, có nhiều nghiên cứu genomics, transcriptomics, proteomics đã được tiến hành. Mục tiêu của những nghiên cứu này nhằm tìm ra những chỉ thị sinh học cho việc chẩn đoán bệnh sớm hơn để điều trị kịp thời. Tuy nhiên, đến nay, mới chỉ có carcinoembryonic antigen (CEA) là chỉ thị sinh học thường dùng cho chẩn đoán bệnh cho các bệnh nhân trong giai đoạn III, IV, nhưng chi phí cho xét nghiệm còn rất tốn kém[38].Vì vậy, việc tìm ra những chỉ thị mới dễ nhận biết và có thể phát hiện chính xác giai đoạn ung thư là cần thiết. Genomics và proteomics là những lĩnh vực nghiên cứu cho phép xác định các chỉ thị đặc trưng cho bệnh, phục vụ cho công tác chẩn đoán, điều trị và tìm nguyên nhân bệnh. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân tích biến đổi của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng”, nhằm mục tiêu: Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học 2 1. Nghiên cứu đa hình gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng: - Xác định được tính đa hình của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng, so sánh với các mẫu đối chứng. - Đánh giá mức độ liên quan giữa tính đa hình của gen CXCL12 với các đặc điểm lâm sàng của bệnh ung thư đại trực tràng ở Việt Nam. 2. Phân tích tình trạng methyl hóa promoter của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng: - Xác định được sự phân bố của đảo CpG và mật độ nucleotide CpG trong các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen CXCL12. - Xác định được tình trạng methyl hóa của 1 đảo CpG thuộc vùng promoter của gen CXCL12. - Đánh giá mối liên quan giữa tình trạng methyl hóa gen CXCL12 với các đặc điểm bệnh học lâm sàng của ung thư đại trực tràng ở người Việt Nam. Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học 3 Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TÌM HIỂU VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.1.1. Khái quát về ung thư Ung thư (u ác tính) là một loại bệnh của các tế bào, biểu hiện là sự phát triển không bình thường của các tế bào, tăng sinh nhanh chóng về số lượng một cách không kiểm soát được và tế bào không tuân theo các cơ chế kiểm soát và phát triển của cơ thể [33]. Trong một số trường hợp, chúng di căn (lan tràn tới các cơ quan ở xa) (bảng 1). Bảng 1. Phân biệt hai khái niệm u lành tính và ung thư theo đặc điểm sinh bệnh học U lành tính U ác tính (ung thư) - Tế bào biệt hóa cao - Phân bào ít và chậm - Không xâm lấn xung quanh - Có vỏ bọc - Không hoại tử - Rất ít tái phát và ít ảnh hưởng tới cơ thể - Tế bào ít biệt hóa - Phân bào nhanh, không tuân theo sự kiểm soát của chu trình tế bào - Xâm lấn xung quanh - Không có vỏ bọc - Thường hoại tử - Ảnh hưởng lớn tới cơ thể Ung thư không phải là một bệnh. Bệnh này là một nhóm của hơn 100 bệnh khác nhau. Ung thư có thể có nguồn gốc từ bất cứ tế bào nào của cơ thể và có rất nhiều loại khác nhau trong mỗi vùng của cơ thể. Hầu hết các bệnh ung thư được đặt tên theo loại tế bào hoặc cơ quan nơi chúng phát sinh. Nếu một khối ung thư lan rộng ra (di căn), thì khối u mới mang tên giống với tên của khối u nguồn gốc đầu tiên [33]. Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học 4 1.1.2. Ung thư đại trực tràng là gì Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là căn bệnh phổ biến, đứng hàng đầu trong ung thư đường tiêu hóa tại các nước Âu Mỹ. Tại Việt Nam và các nước châu Á, UTĐTT đứng thứ hai trong ung thư đường tiêu hóa sau ung thư dạ dày. Ở nước ta, mỗi năm có khoảng hơn 7.300 người mới mắc và hơn 4.100 người tử vong do ung thư đại trực tràng [34]. Ung thư đại trực tràng là ung thư biểu mô phổ biến hiện nay, bao gồm ung thư đại tràng và ung thư trực tràng. Đại tràng là phần ruột lớn hình chữ N gồm đoạn lên, đoạn ngang và đoạn xuống. Trực tràng là phần ruột thẳng nối giữa đại tràng và hậu môn. Ung thư thường xảy ra ở đoạn nối giữa đại tràng và trực tràng (hình 1). Ung thư đại tràng và ung thư trực tràng thường có liên hệ với nhau và khó có thể xác định ung thư nào xảy ra trước, ung thư nào xảy ra sau, vì thế chúng được gọi chung là ung thư đại trực tràng [35]. Hình 1. Hình ảnh đại trực tràng và polyp đại tràng nội soi [35] 1.1.3. Các tác nhân gây ung thư đại trực tràng Các loại ung thư khác nhau có tác nhân gây bệnh khác nhau. Trong ung thư đại trực tràng thì có rất nhiều tác nhân và các nghiên cứu cho thấy các tác nhân sau đây có thể gây nguy cơ bị bệnh ung thư đại trực tràng: Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học 5  Polyp đại trực tràng là bệnh khá thường gặp, đây là những khối u lồi vào trong lòng đại trực tràng, chúng được hình thành do sự tăng sinh quá mức của niêm mạc đại trực tràng. Triệu chứng của bệnh thường nghèo nàn và không đặc hiệu. Việc phát hiện sớm và điều trị kịp thời, đặc biệt nếu xác định rõ và loại bỏ những polyp bằng thủ thuật cắt polyp qua nội soi sẽ làm giảm thiểu đáng kể nguy cơ polyp trở thành ung thư.  Tác nhân lối sống: Những người có thói quen hút thuốc, hoặc có chế độ ăn uống giàu chất mỡ và ít trái cây, rau quả sẽ có nguy cơ mắc bệnh ung thư đại trực tràng cao hơn vì nó có thể gây nên những biến đổi trong tế bào biểu mô trực tràng, gây viêm loét đại tràng và từ đó có thể dẫn tới ung thư đại trực tràng.  Bệnh Crohn hoặc chứng lở ruột già: Người bị chứng bệnh gây viêm đại tràng (như chứng lở ruột già hoặc bệnh Crohn) trong nhiều năm sẽ có nguy cơ mắc bệnh cao.  Bệnh sử ung thư cá nhân: Người từng bị ung thư đại trực tràng có thể sẽ lại bị ung thư đại trực tràng lần thứ hai. Đồng thời, phụ nữ có tiền sử ung thư buồng trứng, dạ con, hoặc ung thư vú, sẽ có nguy cơ mắc bệnh ung thư đại trực tràng cao hơn.  Bệnh sử ung thư trong gia đình: Trong khi phần lớn các trường hợp ung thư đại trực tràng là các khối u rời rạc thì có rất ít các trường hợp xảy ra do đột biến gen di truyền. Phổ biến nhất là hội chứng polyp u tuyến theo dòng họ (familial adenomatous polyposis - FAP) và hội chứng ung thư ruột kết không polyp di truyền (hereditary nonpolyposis colon cancer - HNPCC). Dạng ung thư này thường biểu hiện từ rất sớm (trung bình dưới 45 tuổi) [20]. Khối u FAP chủ yếu nằm ở vùng ngoại biên (bên trái) trong khi HNPCC chủ yếu nằm ở vùng đầu gần (bên phải) của đại tràng. Khi có thành viên trong gia đình được chẩn đoán là mắc ung thư đại trực tràng thì nguy cơ các thành viên khác mắc căn bệnh này cao gấp nhiều lần so với bình thường, phụ thuộc nhiều vào số thành Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học 6 viên mắc bệnh và độ tuổi mắc bệnh. Thực tế, các nghiên cứu cho thấy phải có tới 20 đến 25% các bệnh nhân ung thư đại trực tràng có tiền sử gia đình mắc căn bệnh này. 1.1.4. Các hệ thống phân loại giai đoạn ung thư đại trực tràng [39] Phân loại Duke cho ung thư trực tràng Năm 1932, Cuthbert E. Dukes, một bác sĩ giải phẫu bệnh ở bệnh viện St.Mark, đã đưa ra một hệ thống phân loại giai đoạn cho ung thư trực tràng. Phân loại được chia làm 3 giai đoạn: - Dukes A: khối u giới hạn ở thành trực tràng. - Dukes B: những khối u đã vượt thành trực tràng đến những cơ quan cạnh trực tràng. - Dukes C: những khối u đã di căn đến hạch lympho vùng. Phân loại TNM (Tumor, Node, Metastasis) Phân loại này được đưa ra vào năm 1954 bởi AJCC (American Joint Committee on Cancer) và IUAC (International Union Against Cancer) dựa trên những dữ kiện lâm sàng và bệnh học. Phân loại TNM thường dùng để dự báo tỉ lệ sống sót 5 năm của bệnh nhân ung thư trực tràng. Phân loại TNM cho ung thư đại trực tràng U nguyên phát (T): Tx – không xác định được u. T0 – không có bằng chứng của khối u. Tis – u tại chỗ (niêm mạc). T1 – u xâm lấn lớp dưới niêm mạc. T2 – u xâm lấn thanh mạc. T3 – u xuyên qua thanh mạc vào lớp dưới thanh mạc hoặc vào các mô xung quanh đại tràng hay trực tràng. T4 – U xâm lấn trực tiếp các cơ quan khác hoặc xuyên vào lớp phúc mạc tạng. Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học 7 Hạch lympho vùng (N): Nx – không xác định được hạch. N0 – không có hạch di căn. N1 – di căn 1-3 hạch xung quanh đại tràng hoặc trực tràng. N2 – di căn từ 4 hạch trở lên. N3 – di căn đến bất kì một hạch nào dọc theo mạch máu chính. Di căn xa (M): Mx – không xác định được di căn x