Luận văn Phân tích đa dạng di truyền quần thể nấm corynespora cassiicola (berk. & curt.) wei gây bệnh trên cây cao su (hevea brasiliensis muell. arg.) tại lai khê (bến cát – bình dƣơng) bằng phƣơng pháp rflp – pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** NGÔ QUANG HƢỞNG PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) TẠI LAI KHÊ (BẾN CÁT – BÌNH DƢƠNG) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) TẠI LAI KHÊ (BẾN CÁT – BÌNH DƢƠNG) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN NGÔ QUANG HƢỞNG ThS. PHAN THÀNH DŨNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** STUDYING GENETIC DEVERSITY OF Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei POPULATION, DESTRUCTIVE FUNGAL PATHOGEN OF Hevea brasiliensis Muell. Arg. AT LAI KHE (BEN CAT – BINH DUONG), WAS CARRIED OUT BY USING RFLP – PCR Graduation thesis Major: Biotechnology Professor: Student: PhD. BUI CACH TUYEN NGO QUANG HUONG MSc. PHAN THANH DUNG Term: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 LỜI CẢM TẠ Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: Thầy PGS.TS. Bùi Cách Tuyến - hiệu trưởng trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. ThS. Phan Thành Dũng - trưởng Bộ môn bảo vệ thực vật, Viện nghiên cứu cao su Việt Nam. Đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường. - Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp . - KS. Nguyễn Ngọc Mai, KS. Vũ Thị Quỳnh Chi cùng tập thể cô chú, anh chị làm việc tại Bộ môn bảo vệ thực vật - Viện nghiên cứu cao su Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên và ủng hộ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận. - ThS. Nguyễn Văn Cường cùng các anh chị làm việc tại Trung tâm phân tích thí nghiệm hoá sinh - Đại học Nông Lâm TP. HCM đã giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn để hoàn thành tốt khóa luận . Tập thể các bạn sinh viên lớp Công nghệ sinh học 28 - Trường ĐH. Nông Lâm TP. HCM đã luôn ở bên tôi những lúc khó khăn, cùng tôi chia sẽ vui buồn trong quá trình học và quá trình thực hiện khóa luận. Và đặc biệt con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dƣỡng dục con nên ngƣời, để Con đƣợc nhƣ ngày hôm nay. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2006. Sinh viên Ngô Quang Hưởng. TÓM TẮT NGÔ QUANG HƢỞNG, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 8/2006. “Phân tích đa dạng di truyền của quần thế nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) tại Lai Khê (Bến Cát – Bình Dƣơng) bằng kỹ thuật RFLP – PCR”. Hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Bùi Cách Tuyến ThS. Phan Thành Dũng Thời gian thực hiện từ tháng 2/2006 đến tháng 8/2006, tại Viện Nghiên Cứu Cây Cao Su Việt Nam, Lai Khê, Bến Cát, Bình Dương và tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá – Sinh, trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Vấn đề bảo vệ thực vật luôn nhận được sự quan tâm rất lớn của toàn xã hội. Đối với một nước sản xuất cao su thiên nhiên như Việt Nam, những nghiên cứu về vi sinh vật, côn trùng, sâu hại trên cây cao su là vô cùng cấp thiết. Bệnh rụng lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola gây ra là một bệnh mới và vô cùng nguy hiểm. Nó gây ra những thiệt hại rất lớn về kinh tế. Để tạo những tiền đề cho các nghiên cứu về loại bệnh này, chúng tôi sử dụng phương pháp RFLP – PCR để phân tích tính đa dạng di truyền của quần thể nấm C. cassiicola tại Lai Khê, Bến Cát, tỉnh Bình Dương. Nôi dung nghiên cứu: - Phân lập và tách đơn bào tử các dòng nấm Corynespora cassiicola. - Dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại vùng ITS bằng 2 primer ITS A và ITS B. - Phân tích RFLP trên sản phẩm PCR thu được. Các kết quả đạt được: - Phân lập được 65 dòng nấm và tách đơn bào tử 24 dòng nấm C. cassiicolai trên các dòng vô tính cao su khác nhau. - Dùng PCR khuếch đại được vùng gene nằm giữa đầu 3’ của rDNA 18S và đầu 5’ của rDNA 28S, với kích thước là 540 bp. - Phân cắt sản phẩm PCR với 7 loại enzyme cắt là Hae III, Sau3A I, EcoR I, Nde II, Cfo I, Rsa I, Alu I. Kết quả là không tìm thấy băng đa hình khi cắt bằng 7 loại enzyme trên. Việc sử dụng kỹ thuật RFLP – PCR để phân tích đa dạng di truyền nấm C. cassiicola chưa cho kết quả như mong muốn. Không tìm thấy bất cứ sự khác biệt nào khi phân cắt bằng 7 loại enzyme trên. Do đó, cần có những nghiên cứu sâu hơn như giải trình tự để có những kết luận chính xác về mức độ đa dạng di truyền của quần thể nấm này. MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .................................................................................................................. iii Tóm tắt ....................................................................................................................... iv Mục lục ...................................................................................................................... vi Danh sách các chữ viết tắt .......................................................................................... x Danh sách các bảng .................................................................................................. xi Danh sách các hình ................................................................................................... xii 1. MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1 1.2. Mục đích – Yêu cầu ....................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích ............................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu ................................................................................................. 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................... 3 2.1. Giới thiệu về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg ............................... 3 2.1.1. Sơ lược về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg trên thế giới và tại Việt Nam ................................................................... 3 2.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ, lượng mưa, tốc độ gió đến sự phát triển của cây cao su ..................................................................... 4 2.1.3. Tình hình bệnh hại trên cây cao su ........................................................ 5 2.2. Giới thiệu về nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei ................. 6 2.2.1. Lịch sử phát hiện nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt. ) Wei ..................................... 6 2.2.2. Đặc điểm phân loại học của nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei ....................................... 6 2.2.3. Hình thái học và đặc tính sinh học của nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei ....................................... 7 2.2.4. Phạm vi ký chủ, phạm vi phân bố và triệu chứng của bệnh rụng lá Corynespora .............................................................. 8 2.2.5. Tình hình bệnh rụng lá Corynespora ở các nước trồng nhiều cao su trên thế giới ............................................................................... 9 2.3. Giới thiệu về phản ứng PCR (polymerase chain reaction) ...................... 10 2.3.1. Sơ lược về kỹ thuật PCR .................................................................... 10 2.3.2. Thành phần phản ứng PCR và các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR ................................................................. 10 2.3.3.1. DNA mẫu ................................................................................. 10 2.3.3.2. Primer và nhiệt độ lai ............................................................... 11 2.3.3.3. Enzyme ..................................................................................... 12 2.3.3.4. Mg 2+ ......................................................................................... 12 2.3.3.5. dNTPs ....................................................................................... 12 2.3.3.6. Số lượng chu kỳ ....................................................................... 12 2.3.3.7. Nhiệt độ và pH ......................................................................... 13 2.3.3.8. Thiết bị và dụng cụ phản ứng PCR .......................................... 13 2.3.4. Các bước thực hiện một phản ứng PCR ............................................. 13 2.3.5. Ưu và nhược điểm của phản ứng PCR ............................................... 14 2.3.6. Ứng dụng của kỹ thuật PCR ............................................................... 14 2.4. Giới thiệu về kỹ thuật RFLP ........................................................................ 15 2.4.1. Sơ lược về enzyme cắt giới hạn ......................................................... 15 2.4.1.1. Giới thiệu chung ....................................................................... 15 2.4.1.2. Tên gọi các enzyme cắt giới hạn .............................................. 15 2.4.1.3. Các loại RE .............................................................................. 16 2.4.1.4. Ứng dụng của các enzyme RE ................................................. 17 2.4.2. Sơ lược về phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism Polymerase Chain Reaction) ............................. 17 2.4.2.1. Giới thiệu chung ....................................................................... 17 2.4.2.2. Quy trình thực hiện một phản ứng RFLP ................................ 17 2.4.2.3. Sơ lược về kỹ thuật RFLP – PCR ............................................ 18 2.6. Giới thiệu về vùng ITS ................................................................................. 19 2.7. Một số nghiên cứu về nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trong nước và ngoài nước ......................... 20 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .................................................................... 22 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành .............................................................. 22 3.1.1. Thời gian ....................................................................................... 22 3.1.2. Địa điểm ........................................................................................ 22 3.1.3. Đối tượng nghiên cứu ................................................................... 22 3.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 22 3.3. Vật liệu và phương pháp .............................................................................. 22 3.3.1. Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối .......................................... 22 3.3.1.1. Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm .................................................. 22 3.3.1.2. Phương pháp lấy mẫu ............................................................... 23 3.3.1.3. Phương pháp phân lập nấm ...................................................... 23 3.3.1.4. Phương pháp tách đơn bào tử ................................................... 23 3.3.1.5. Phương pháp nhân sinh khối .................................................... 24 3.3.2. Phương pháp tách chiết DNA của nấm ............................................... 24 3.3.2.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm ............................................... 24 3.3.2.2. Phương pháp tách chiết DNA .................................................. 24 3.3.2.3. Định tính DNA bằng kỹ thuật điện di ...................................... 25 3.3.2.4. Tinh sạch sản phẩm ly trích ..................................................... 25 3.3.2. Khuếch đại vùng ITS của nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei bằng kỹ thuật PCR ........... 26 3.3.2.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm ............................................... 26 3.3.2.2. Thực hiện phản ứng PCR ......................................................... 26 3.3.2.3. Điện di sản phẩm PCR và đánh giá kết quả điện di ................. 27 3.3.3. Phân tích RFLP vùng ITS của các dòng nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei ..................................... 28 3.3.3.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm ............................................ 28 3.3.3.2. Thực hiện phân tích RFLP .................................................... 28 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................... 29 4.1. Phân lập và tách đơn bào tử nấm Corynespora cassiicola trên một số dòng vô tính cao su ............................................................... 29 4.1.1. Diễn biến và mức độ gây hại của tác nhân gây bệnh rụng lá Corynespora................................................................... 29 4.1.2. Kết quả phân lập .................................................................................. 32 4.1.3. Kết quả tách đơn bào tử ....................................................................... 32 4.1.4. Kết quả nhân sinh khối ........................................................................ 35 4.2. Kết quả ly trích và tinh sạch DNA sợi nấm ................................................. 36 4.3. Kết quả khuếch đại vùng ITS của nấm nhờ PCR ........................................ 37 4.4. Phân tích RFLP vùng ITS của các dòng nấm Corynespora cassiicola ........ 40 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................... 46 5.1. Kết luận .................................................................................................... 46 5.2. Đề nghị ..................................................................................................... 46 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 48 7. PHỤ LỤC ........................................................................................................... 52 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism. CLFP: Corynespora leaf fall disease. cm: centimét. dNTPs: deoxyribonucleotide – 5 – triphosphate. ITS: Internal Transcribed Spacer. Kb: Kilobase pair. m: mét. mm: milimét. Nu: Nucleotide. PCR: Polymerase Chain Reaction. PDA: Potato Dextrose Agar. PGA: Potato Glucose Agar. PSA: Potato Sucrose Agar. R – M: Restriction – Modification. RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA. rDNA: ribosome Deoxynucleotide acid. RE: Restriction Endonuclease. RFLP – PCR: Restriction Fragment Length Polymorphism Polymerase Chain Reaction. RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism. rRNA: ribosome Deoxyribonucleotide acid. TAE: TrisAcetic Ethylene diamine tetra acetate. TE: Tris Ethylene diamine tetra acetate. Tm: melting Tempereture. VNCCSVN: Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Một vài RE và vị trí cắt của nó ................................................................ 16 Bảng 3.1. Thành phần phản ứng PCR ...................................................................... 26 Bảng 3.2. Thành phần phản ứng enzyme cắt ............................................................ 28 Bảng 4.1. Tình hình nhiễm bệnh tại một số vườn trên địa bàn Lai Khê – Bình Dương ......................................................... 30 Bảng 4.2. Các dòng nấm được tách đơn bào tử ........................................................ 33 Bảng 4.3. Thành phần phản ứng PCR đã có thay đổi............................................... 39 Bảng 4.4. Kích thước các đoạn DNA sau khi phân cắt bằng các enzyme giới hạn ... 44 DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Hình dạng bào tử nấm C. cassiicola ........................................................... 7 Hình 2.2. Mô tả phản ứng RFLP .............................................................................. 18 Hình 2.3. Sơ đồ vùng ITS của nấm .......................................................................... 19 Hình 4.1. Triệu trứng bệnh rụng lá Corynespora ..................................................... 31 Hình 4.2. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trường nhân tạo (3 ngày sau khi cấy) ................................................................................. 32 Hình 4.3. Bào tử nấm C. cassiicola .......................................................................... 32 Hình 4.4. Sự khác biệt giữa 2 khuẩn lạc từ 2 đơn bào tử của một dòng nấm .......... 34 Hình 4.5. Sinh khối nấm sau 4 ngày lắc ................................................................... 35 Hình 4.6. Kết quả li trích 24 dòng nấm khác nhau ................................................... 36 Hình 4.7. DNA tổng số đã tinh sạch ......................................................................... 37 Hình 4.8. Sản phẩm PCR theo quy trình cũ của Silva và cộng sự (1998) ................ 38 Hình 4.9.Sản phẩm PCR theo quy trình mới ............................................................ 39 Hình 4.10. Sản phẩm PCR cắt bằng Hae III ............................................................. 41 Hình 4.11. Sản phẩm PCR cắt bằng EcoR I ............................................................. 41 Hình 4.12. Sản phẩm PCR cắt bằng Sau3A I ........................................................... 42 Hình 4.13. Sản phẩm PCR cắt bằng Alu I ................................................................ 42 Hình 4.14. Sản phẩm PCR cắt bằng Cfo I ................................................................ 43 Hình 4.15. Sản phẩm PCR cắt bằng Nde II .............................................................. 43 Hình 4.16. Sản phẩm PCR cắt bằng Rsa I ................................................................ 43 PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Đối với thực vật thì những tác nhân gây thiệt hại về năng suất, chất lượng chủ yếu là sâu hại, virus hoặc nấm gây ra. Trên cây cao su cũng vậy, đặc biệt là các loại bệnh do nấm và vi khuẩn. Ngay từ khi xuất hiện, bệnh rụng lá do nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây ra đã gây thiệt hại rất lớn đối với năng suất và chất lượng của nhiều cây trồng khác nhau (khoảng trên 11 loại cây vùng nhiệt đới) như đậu nành, đu đủ, cao su…Từ đó, ảnh hưởng rất lớn đến nền kinh tế của các quốc gia, đặc biệt là các quốc gia có thu nhập chính từ nông nghiệp, trong đó có Việt Nam. Đối với cây cao su bệnh rụng lá do nấm Corynespora cassiicola gây ra hay còn gọi là bệnh rụng lá Corynespora (CLFD) đã gây thiệt hại rất nghiêm trọng đối với ngành cao su ở nhiều quốc gia, lãnh thổ trên thế giới. Đợt dịch bệnh bùng phát đầu tiên trên cây cao su vào năm 1985 đã gây rất nhiều sự chú ý của các nhà khoa học. Cho đến nay, tính chất của bệnh rụng lá Corynespora càng ngày càng nghiêm trọng, quy mô và phổ ký chủ càng ngày càng mở rộng. Đồng thời nấm Corynespora cassiicola có khả năng biến đổi sinh hóa rất lớn. Bệnh này làm rụng lá trên quy mô lớn ảnh hưởng đến năng suất mủ của cây cao su. Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện đầu tiên trên cây cao su vào tháng 9/1999