Luận văn Phân tích proteomics mô ung thư của bệnh nhân ung thư đại trực tràng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Thị Ngọc Hà PHÂN TÍCH PROTEOMICS MÔ UNG THƯ CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Thị Ngọc Hà PHÂN TÍCH PROTEOMICS MÔ UNG THƯ CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. Trịnh Hồng Thái Hà Nội – Năm 2012 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Trịnh Hồng Thái, người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu khoa học và thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong suốt thời gian học tập tại Trường. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh, chị, các bạn sinh viên làm việc tại Phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tại Phòng. Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của các cán bộ nhân viên thuộc khoa Tế bào và Giải phẫu bệnh, Bệnh viện K Tam Hiệp, Hà Nội và khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Việt Đức, Hà nội. Tôi xin chân thành cảm ơn. Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn khích lệ động viên tôi trong suốt thời gian qua. Hà Nội, tháng 12 năm 2012 Học viên Nguyễn Thị Ngọc Hà MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 Chương 1 – TỔNG QUAN ...................................................................................... 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ..................................... 3 1.1.1. Ung thư đại trực tràng là gì? .................................................................... 3 1.1.2. Nguyên nhân dẫn đến ung thư đại trực tràng ........................................... 6 1.1.3. Các hệ thống phân loại giai đoạn ung thư đại trực tràng .......................... 8 1.2. NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƯ ....................... 12 1.2.1. Chỉ thị sinh học đối với ung thư ............................................................ 12 1.2.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng để nghiên cứu chỉ thị sinh học ung thư ..................................................................................................... 14 1.3. PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 16 1.3.1. Proteomic là gì? .................................................................................... 16 1.3.2. Công cụ nghiên cứu proteomics ............................................................ 17 1.3.3. Ứng dụng của proteomics trong nghiên cứu ung thư đại trực tràng ........ 19 Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 28 2.1. NGUYÊN LIỆU .......................................................................................... 28 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 28 2.1.2. Hóa chất ................................................................................................ 28 2.1.3. Thiết bị .................................................................................................. 29 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 29 2.2.1. Xử lý mẫu mô đại trực tràng.................................................................. 29 2.2.2. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford ................................... 31 2.2.3. Điện di hai chiều ................................................................................... 31 2.2.4. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều .......................................... 33 2.2.5. Cắt và thủy phân spot ............................................................................ 34 2.2.6. Phân tích khối phổ và nhận dạng protein ............................................... 35 Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................... 37 3.1. TÁCH CHIẾT PROTEIN MÔ ĐẠI TRỰC TRÀNG ................................... 37 3.2. PHÂN TÁCH PROTEIN MÔ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRÊN BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU .................................................................................................. 39 3.3. PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU ...................... 41 3.4. XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MALDI-TOF MS ........... 44 3.5. ĐẶC ĐIỂM, VAI TRÒ CỦA CÁC PROTEIN BIỂU HIỆN KHÁC BIỆT .. 52 3.5.1. Protein liên quan đến chu trình tế bào và apoptosis ............................... 56 3.5.2. Protein liên quan đến quá trình miễn dịch và bảo vệ cơ thể ................... 58 3.5.3. Protein tham gia cấu trúc tế bào............................................................. 60 3.5.4. Protein tham gia các quá trình trao đổi chất ........................................... 61 3.5.5. Protein liên quan đến quá trình phiên mã, dịch mã, cải biến sau phiên mã, dịch mã ........................................................................................................... 62 KẾT LUẬN ........................................................................................................... 64 KIẾN NGHỊ .......................................................................................................... 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 66 PHỤ LỤC 1. DANH SÁCH BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ............................................................ i PHỤ LỤC 2. KẾT QUẢ NHẬN DIỆN PROTEIN BẰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU NCBI SỬ DỤNG PHẦN MỀM MASCOT ........................................................................ ii BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2-DE Điện di hai chiều (Two - Dimensional Electrophoresis) ABC Ammonium Bicarbonate AcCN Acetonitrile AFAP Hội chứng đa polyp tuyến nhẹ di truyền (Attenuated Familial Adenomatous Polypsis) APC Adenomatous Polyposis Coli CHAPS 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid CHCA α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid CEA Kháng nguyên phôi thai (Carcinoembryonic Antigen) CK Cytokeratin cs Cộng sự Da Dalton DTT Dithiothreitol ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay FAP Hội chứng đa polyp tuyến gia đình (Familial Adenomatous Polyposis) HCCS Suppressor of tumorigenicity 20 protein HNPCC Hội chứng ung thư đại tràng di truyền không phải đa polyp (Hereditary Nonpolyposis Colon Cancer) HSP Protein sốc nhiệt (Heat sock protein) HUPO Tổ chức nghiên cứu hệ protein người (Human Proteome Organisation) IAA Iodoacetamide IEF Điện di phân vùng đẳng điện (Isoelectric Focusing) IPG Gradient pH cố định (Immobilized pH gradient) LC-MS/MS Sắc ký lỏng kết nối với khối phổ (Liquid Chromatography coupled with tandem Mass Spectrometry) MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS Khối phổ (Mass spectrometry) PBS Đệm muối Photphat (Phosphate Buffer Saline) PMF Đặc trưng khối peptide (Peptide Mass Fingerprint) SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Điện di trên gel polyacrylamide có SDS (SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) SELDI-TOF Surface-enhanced laser desorption/ionization time - of - flight Spot Điểm protein TAA Kháng nguyên liên quan đến khối u (Tumor Associated Antigens) TFA Trifluoroacetic acid TNM Tumor – Lympho node – Metastases DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các giai đoạn bệnh khác nhau Bảng 2 Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu Bảng 3 Các bước chạy điện di đẳng điện trên thanh IPG strip dài 17cm Bảng 4 Số lượng spot protein phân tách trên bản gel điện di hai chiều Bảng 5 Thống kê các spot protein biểu hiện khác biệt trên bản gel điện di hai chiều của 5 bệnh nhân Bảng 6 Danh sách các protein được xác định bằng MALDI TOF-MS từ bản gel mô ung thư so sánh với bản gel mô đại trực tràng bình thường của bệnh nhân ung thư đại trực tràng Bảng 7 Tóm tắt chức năng chính của các protein đã được định danh biểu hiện khác biệt giữa mô ung thư đại trực tràng so với mô đại trực tràng bình thường DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Hình ảnh đại trực tràng Hình 2 Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng Hình 3 Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều sử dụng phần mềm Phoretix Hình 4 Điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết protein từ mô đại trực tràng bình thường và mô ung thư đại trực tràng trên cùng bản gel polyacrylamide 10% có SDS Hình 5 Điện di kiểm tra mẫu tủa của phân đoạn dịch chiết protein PBS 1 và lysis 1 từ mô đại trực tràng bình thường và mô ung thư đại trực tràng Hình 6 Phân tách protein mô đại trực tràng của bệnh nhân mã số 11781 trên bản gel điện di hai chiều Hình 7 Minh họa các spot biểu hiện khác biệt trên bản gel mô ung thư so với mô bình thường Hình 8 Các spot protein biểu hiện khác biệt giữa bản gel điện di hai chiều của mẫu mô ung thư đại trực tràng so với mẫu mô đại trực tràng bình thường của bệnh nhân ung thư đại trực tràng mã số 11781 Hình 9 Phân tích khối phổ các peptide thu được sau khi thủy phân protein T17B33 bằng enzyme trypsin Hình 10 Kết quả nhận dạng protein bằng tra cứu cơ sở dữ liệu NCBI sử dụng phần mềm Mascot Hình 11 Các nhóm protein theo chức năng Hình 12 Quá trình apoptosis trong tế bào Hình 13 Sơ đồ trình diện kháng nguyên của phức hệ phù hợp tổ chức mô cho tế bào lympho T Hình 14 Cơ chế tác dụng của Zinc finger protein đối với quá trình phiên mã LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ 1 MỞ ĐẦU Ung thư đại trực tràng là một trong những bệnh ung thư phổ biến nhất trên thế giới, nó đứng thứ ba chỉ sau ung thư phổi và ung thư vú. Đây là căn bệnh có tỷ lệ tử vong cao và tỷ lệ mắc bệnh có xu hướng ngày càng tăng. Theo thống kê, năm 2008 ước tính có khoảng 1,24 triệu người trên thế giới được chẩn đoán là mắc ung thư đại trực tràng, chiếm khoảng 10% trong số các loại ung thư. Số ca tử vong do ung thư đại trực tràng trong năm 2008 là 610.000 ca trên toàn thế giới, chiếm khoảng 8% số lượng tử vong do ung thư. Tại Việt Nam, ung thư đại trực tràng là loại ung thư đứng thứ năm trong các loại ung thư thường gặp, sau ung thư dạ dày, phổi, vú, vòm họng. Theo thống kê của Bệnh viện Ung Bướu thành phố Hồ Chí Minh, năm 2008, bệnh viện có 306 ca bệnh ung thư đại trực tràng và con số này ngày càng gia tăng. Tính đến tháng 9 năm 2009, đã có đến trên 220 bệnh nhân mới đến điều trị ung thư đại trực tràng tại đây [54]. Tỷ lệ mắc ung thư đại trực tràng là 9% tổng số bệnh nhân ung thư [55]. Việc chẩn đoán và phát hiện sớm ung thư đại trực tràng có ý nghĩa rất quan trọng, giúp làm tăng hiệu quả điều trị bệnh, giảm tỷ lệ tử vong do loại ung thư này gây ra. Thực tế cho thấy, nếu phát hiện khối u đại trực tràng ở giai đoạn đầu và chữa trị kịp thời thì tỷ lệ sống sót của bệnh nhân sau 5 năm sẽ là 80 – 100%. Hiện nay, một số phương pháp xét nghiệm lâm sàng đang được áp dụng để chẩn đoán ung thư đại trực tràng như chẩn đoán hình ảnh thông quan nội soi, sinh thiết, chụp X quang, xét nghiệm tìm máu trong phân, thăm khám trực tiếp, sử dụng chỉ thị CEA. Nhược điểm của các phương pháp này là thường phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn, phương pháp nội soi thường gây khó chịu cho bệnh nhân, xét nghiệm máu trong phân cho nhiều kết quả dương tính và âm tính giả nên hiệu quả chẩn đoán và điều trị bệnh không cao. Vì vậy, nhu cầu đặt ra cho các nhà khoa học là làm thế nào để tìm ra được các chỉ thị sinh học đặc trưng để chẩn đoán, phát hiện ung thư đại trực tràng ở giai đoạn sớm. LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ 2 Hiện nay, một trong những hướng nghiên cứu chỉ thị sinh học cho ung thư đại trực tràng đang được các nhà khoa học quan tâm là sử dụng công cụ proteomics. Bằng việc phân tích sự biến đổi trong thành phần, số lượng các protein có mặt trong huyết thanh, dịch cơ thể, mô ung thư của bệnh nhân ung thư, các nhà khoa học hi vọng tìm ra được các chỉ thị sinh học mới, dễ nhận biết để ứng dụng chẩn đoán ung thư đại trực tràng ở giai đoạn sớm, nhằm phục vụ công tác chẩn đoán, điều trị bệnh một cách hiệu quả. Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Phân tích proteomics mô ung thư của bệnh nhân ung thư đại trực tràng“ với mục tiêu: - Phân tách hệ protein tách chiết từ mô đại trực tràng bình thường và mô ung thư đại trực tràng của bệnh nhân ung thư đại trực tràng. - Phân tích và so sánh sự biểu hiện khác biệt của các protein ở mô ung thư đại trực tràng so với mô đại trực tràng bình thường thông qua biểu hiện của các điểm protein trên bản gel điện di hai chiều. - Nhận dạng được một số protein biểu hiện khác biệt đặc trưng giữa mô ung thư đại trực tràng và mô đại trực tràng bình thường. Đề tài được thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ 3 Chương 1 – TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.1.1. Ung thư đại trực tràng là gì? Ung thư là thuật ngữ được sử dụng để chỉ các bệnh liên quan đến việc các tế bào phân chia mất kiểm soát và có thể xâm lấn các mô khác. Các tế bào ung thư có thể di căn tới các phần khác của cơ thể thông qua máu hoặc hệ bạch huyết. Ung thư không chỉ là một bệnh mà bao gồm nhiều bệnh. Hiện nay, có hơn 100 loại ung thư khác nhau. Hầu hết ung thư được đặt tên theo cơ quan hoặc loại tế bào, nơi ung thư phát sinh. Ví dụ ung thư phát sinh từ đại tràng được gọi là ung thư đại tràng, ung thư phát sinh từ gan được gọi là ung thư gan [48]. Ung thư là một trong 8 nguyên nhân gây chết đối với nhân loại trên toàn thế giới. Số lượng người tử vong do ung thư còn lớn hơn số lượng tử vong do nhiễm HIV, lao và sốt xuất huyết cộng lại. Đối với các nước có nền kinh tế phát triển, ung thư là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu. Đối với các nước đang phát triển, ung thư là nguyên nhân gây tử vong thứ hai, sau bệnh tim mạch [45]. Năm 2008, ước tính có khoảng 12,66 triệu người mắc ung thư và 7,56 triệu người chết do căn bệnh này. Trong đó 4 loại ung thư là ung thư phổi, ung thư vú, ung thư dạ dày và ung thư đại trực tràng chiếm 2/5 tổng số ca mắc ung thư trên thế giới [45]. Ung thư đại trực tràng là loại ung thư phổ biến nhất trong các loại ung thư đường tiêu hóa [28], bao gồm ung thư đại tràng và ung thư trực tràng được gọi theo tên của mô, nơi phát sinh ung thư. Đại tràng và trực tràng là một phần của hệ tiêu hóa. Đại trực tràng (hay còn gọi là ruột già) là phần cuối của ống tiêu hóa ở người, gồm có đại tràng (hay còn gọi là ruột kết) và trực tràng (hay còn gọi là ruột thẳng). Đại tràng chia ra làm nhiều phần: manh tràng, đại tràng lên, đại tràng ngang, đại tràng xuống và đại tràng sigma (Hình 1). Trực tràng nằm ngay trước hậu môn. Ung thư xảy ra ở đại tràng gọi là ung thư đại tràng và ung thư xảy ra ở trực tràng gọi là LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ 4 ung thư trực tràng. Ung thư ở đại tràng xảy ra thường xuyên hơn ung thư ở trực tràng [21Error! Reference source not found.]. Hình 1. Hình ảnh đại trực tràng [57] Ung thư đại trực tràng xảy ra khi một số tế bào ở lớp lót trong (còn gọi là niêm mạc) của đại tràng hay trực tràng trở nên bất thường và phát triển một cách không kiểm soát được, tạo thành khối u (còn gọi là polyp). Các khối u này có thể là u lành tính hay u ác tính. U lành tính thường không gây hại cho cơ thể, có thể cắt bỏ dễ dàng mà không tái phát trở lại, không xâm lấn các mô xung quanh, không di căn đến các bộ phận khác của cơ thể và khối u lành tính không phải là ung thư. U ác tính là ung thư thường gây hại cho cơ thể, có thể cắt bỏ khối u ác tính nhưng đôi khi chúng sẽ tái phát trở lại. Khối u ác tính thường xâm lấn và gây tổn thương các mô, cơ quan xung quanh. Các tế bào ung thư từ khối u ác tính có thể phát tán đến các bộ phận khác của cơ thể bằng cách đi vào máu hoặc hệ bạch huyết và gọi là di căn. Khi ung thư đại trực tràng phát triển ra ngoài đại tràng và trực tràng, các tế bào ung thư thường di căn đến các hạch bạch huyết. Khi các tế bào ung thư đến được hạch bạch huyết, chúng có thể phát tán đến các các hạch bạch huyết khác hay các cơ quan khác. Các tế bào ung thư đại trực tràng thường phát tán đến gan [10]. LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ 5 Hầu hết các trường hợp ung thư đại trực tràng là ung thư biểu mô tuyến, chiếm 90 – 95% trong các loại ung thư đại trực tràng [21Error! Reference source not found.]. Điều này có nghĩa là tế bào ung thư được hình thành từ các tế bào biểu mô tuyến bất thường ở bề mặt lớp lót bên trong của đại trực tràng. Một số dạng ung thư đại trực tràng khác, ít gặp hơn là ung thư bắt đầu từ các tế bào lympho và các tế bào biểu mô vảy. Ung thư đại trực tràng là ung thư phổ biến thứ ba trên thế giới chỉ sau ung thư phổi và ung thư vú. Năm 2008 ước tính có khoảng 1,24 triệu người trên thế giới được chẩn đoán là mắc ung thư đại trực tràng, chiếm khoảng 10% trong số các loại ung thư. Số ca tử vong do ung thư đại trực tràng trong năm 2008 là 610.000 ca trên toàn thế giới, chiếm khoảng 8% số lượng tử vong do ung thư [16, 45]. Ung thư đại trực tràng thường gặp ở các nước phát triển nhiều hơn các nước đang phát triển. Năm 2008, 60% các ca được chẩn đoán ung thư đại trực tràng là ở các nước phát triển [16]. Tỷ lệ bệnh nhân mắc ung thư đại trực tràng cũng tăng lên ở các khu công nghiệp và thành thị. Tỷ lệ ung thư đại trực tràng ở các nhóm tuổi khác nhau là khác nhau. Số lượng người mắc ung thư đại trực tràng ở nhóm tuổi trên 75 tuổi là cao nhất (250/100.000/năm). Ung thư đại tràng ít xảy ra ở độ tuổi dưới 45 tuổi và tỷ lệ này là 2/100.000/năm. Ở nhóm tuổi từ 45 đến 54, tỷ lệ mắc ung thư đại tràng là 20/100.000/năm. Nhóm tuổi từ 55 đến 64, tỷ lệ mắc ung thư đại tràng là 55/100.000/năm. Nhóm tuổi từ 65 đến 74, tỷ lệ này là 150/100.000/năm [21Error! Reference source not found., 30]. Tại Việt Nam, ung thư đại trực tràng là loại ung thư đứng thứ năm trong các loại ung thư thường gặp, sau ung thư dạ dày, phổi, vú, vòm họng và bệnh này có xu hướng ngày càng tăng cao. Theo thống kê của Bệnh viện Ung Bướu TPHCM, năm 2007, bệnh viện có 218 ca bệnh ung thư đại trực tràng. Năm 2008 con số này là 306 ca và tính đến tháng 9 năm 2009, đã có đến trên 220 bệnh nhân mới đến điều trị ung thư đại trực tràng [54]. Theo thống kê của Bệnh viện K, tỷ lệ mắc ung thư đại tràng LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ 6 là 9% tổng số bệnh nhân ung thư [55]. Theo một nghiên cứu được tiến hành tại Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ, độ tuổi mắc ung thư đại tràng trung bình của các bệnh nhân điều trị ung thư đại trực tràng ở đây là 54 tuổi, tỉ lệ mắc bệnh nam/nữ là 1,34 [3]. 1.1.2. Nguyên nhân dẫn đến ung thư đại trực tràng Nguyên nhân chính xác dẫn đến ung thư đại trực tràng vẫn chưa được chứng minh rõ ràng. Tuy nhiên, các nghiên cứu về di truyền học, dịch tễ học cũng đã cho thấy một số yếu tố có khả năng làm tăng nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng, bao gồm yếu tố di truyền và yếu tố không di truyền. Yếu tố không di truyền Theo một số nghiên cứu, số lượng người mắc ung thư đại trực tràng không liên quan đến các yếu tố di truyền chiếm 75 - 95% tổng số người mắc bệnh [41]. Các yếu tố này bao gồm: lứa tuổi, giới tính, chế độ ăn uống, thuốc lá, chế độ vận động của cơ thể, các bệnh liên quan đến viêm đại tràng, polyp đại tràng Ung thư đại trực tràng thường gặp ở nh