Luận văn Sử dụng các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phòng trừ vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây cà chua

Luận văn Sử dụng các dịng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phịng trừ vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây cà chua Luận văn tốt nghiệp SVTH: Hồ Thanh Hoàng Download» Agriviet.com 1 Chương 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Cà chua là một trong số những cây rau màu quan trọng, được phân bố rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới. Tuy nhiên việc gieo trồng cà chua vẫn gặp nhiều khó khăn, trở ngại. Một trong những nguyên nhân làm hạn chế sự phát triển sản xuất và làm giảm năng xuất cà chua đó là sâu và bệnh hại. Trong đó đáng chú ý hơn cả là bệnh héo rũ do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra. Đây là loại vi khuẩn có khả năng gây hại trên 200 loài cây cỏ, đặc biệt gây hại nặng trên cây họ cà như cà chua, cà tím, khoai tây, thuốc lá và các cây khác họ như đậu phụng, gừng, chuối, chúng có khả năng sống rất lâu trong đất và lây lan rất nhanh, di chuyển từ nơi nay sang nơi khác. Cây chết hàng loạt khi lá vẫn còn xanh giống như bị cắt ngang gốc. Ước tính thiệt hại cho sản xuất cây trồng hàng năm do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra là 15-95%(Emil Q.Javier, 1994). Để khắc phục tình trạng này, các biện pháp phòng trừ tác nhân gây bệnh bằng phương pháp sinh học được nhiều nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu. Đây là một trong những phương pháp phòng chống có hiệu quả nhất hiện nay ở khả năng phòng trừ vi khuẩn Ralstonia solanacearum, giúp cây cà chua sinh trưởng và phát triển tốt hơn, làm cho tác nhân gây bệnh không kháng thuốc, an toàn với môi trường sinh thái cho kết quả nhanh và chính xác rất phù hợp với xu hướng nông nghiệp an toàn hiện nay và đang được rất nhiều nước trên thế giới áp dụng. Việc nghiên cứu các loại vi khuẩn đối kháng như : Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, để chống lại vi khuẩn Ralstonia solanacearum là một vấn đề hết sức cần thiết hiện nay. Vì vậy, nghiên cứu về tính đa dạng của các cá thể trong quần thể vi khuẩn gây bệnh và sự lưu hành của chúng Luận văn tốt nghiệp SVTH: Hồ Thanh Hoàng Download» Agriviet.com 2 ở các vùng sản xuất là rất cần thiết, nó làm cơ sở khoa học cho các giải pháp phòng chống và chọn tạo giống kháng bệnh sau này. Xuất phát từ thực tiễn trên và để đánh giá khả năng phòng trừ của các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens. Chúng tôi thực hiện đề tài: “Sử dụng các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phòng trừ vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây cà chua”. 1.2 Mục đích – yêu cầu Đánh giá khả năng phòng trừ của các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens với các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây cà chua. 1.3 Giới hạn đề tài Đề tài được thực hiện trong tháng có nhiều mưa, đất trồng bị nhiễm nhiều loại bệnh. Cây cà chua là loại cây dễ mẫn cảm với nhiều loại bệnh. 1.4 Đối tượng nghiên cứu Các dòng vi khuẩn đối kháng thuộc nhóm Pseudomonas fluorescens Dòng vi khuẩn gây bệnh Ralstonia solanacearum Cây trồng: cà chua 1.5 Nội dung nghiên cứu Đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens với các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên đĩa petri trong phòng thí nghiệm. Luận văn tốt nghiệp SVTH: Hồ Thanh Hoàng Download» Agriviet.com 3 Đánh giá khả năng phòng trừ của dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens với dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây cà chua trong điều kiện nhà lưới. Đánh giá khả năng phòng trừ của dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens với dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây cà chua ngoài đồng ruộng. Luận văn tốt nghiệp SVTH: Hồ Thanh Hoàng Download» Agriviet.com 4 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh Vi khuẩn Ralstonia solanacearum là vi khuẩn gây bệnh mạch dẫn gây hại trên 200 loài cây cỏ. Halted đã nghiên cứu bệnh này vào năm 1892, năm 1896 E.F.Smith nghiên cứu, mô tả, định tên Pseudomonas solanacearum. Những năm sau đó, bệnh héo rũ được nhiều nhà khoa học trên thế giới đi sâu, nghiên cứu một cách toàn diện như Kelman 1953, Hayward 1964, Cook and Baker 1983, Yabuuchi 1992, 1995(Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998). Bệnh héo rũ do vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cà chua có tên là: Southern wilt (theo cách gọi của người Hoa Kỳ), Bacterial wilt (theo cách gọi của người Anh), ở Việt Nam gọi là bệnh héo xanh, héo rũ. 2.2 Mức độ phổ biến và gây hại của Ralstonia solanacearum Ngày nay, Ralstonia solanacearum được ghi nhận là vi khuẩn gây hại ở hầu hết các châu lục, phổ biến là ở các nước như Angola, Trung quốc, Bangladesh, Aán Độ, Indonesia, Srilanka, Đông Aán Ethiopia, Lybia, Kenya, Malaysia, Nigieria, Philippin, Nam Phi, Đài Loan, Thái Lan, Uganda, Hoa Kỳ, Việt Nam, Zambia (Subrhmagam, 1994). Ở Việt Nam, bệnh héo xanh cà chua do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra là một trong những bệnh gây hại rất phổ biến làm chết héo hàng loạt cây cà chua trên đồng ruộng, gây tổn thất lớn ở các vùng trồng cà chua trong nước, nhất là ở vùng đồng bằng sông Hồng. Bệnh được ghi nhận trên cà chua, khoai tây, cà tím, thuốc lá, đậu phụng, gừng, ớt. Qua một số kết quả nghiên cứu công bố gần đây cho Luận văn tốt nghiệp SVTH: Hồ Thanh Hoàng Download» Agriviet.com 5 thấy ở nước ta vi khuẩn gây bệnh héo xanh thuộc division Châu Á (Lê Lương Tề, 2002), race1, biovar 3 và 4 (Nguyễn Thị Yến, 2002). Ở Hoa Kỳ, vi khuẩn Ralstonia solanacearum được phát hiện trên khoai tây, thuốc lá ở Florida được xác định bằng phương pháp PCR là biovar 1 (Prakash, 2002). Ở Indonesia, bệnh được phát hiện đầu tiên trên đậu phụng vào năm 1905, ở vung Cirebon. Về sau bệnh được ghi nhận trên nhiều loại cây trồng khác như cà chua, khoai tây, thuốc lá, ớt, chuối. Kết quả nghiên cứu bệnh héo xanh trên đậu phụng giữa AARD và ACIAR vào năm 1985 cho rằng đây là bệnh chính trên đậu phụng ở Indonesia, sự thiệt hại do bệnh gây ra có thể từ 15-90% năng suất (Wright, 1991). Ở Đài Loan bệnh được gây hại trên cà chua, khoai tây, thuốc lá, ớt, cà tím, đậu phụng, dâu tây, tía tô, thầu dầu, mè, củ cải, rau dền và một số cây trồng khác. Trên nhiều loại cây trồng sự thiệt hại do bệnh gây ra có thể từ 5-100% năng suất. Các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum chủ yếu thuộc race1 (Yung-An Lee, 2001). Ở Ai Cập, bệnh héo xanh vi khuẩn do Ralstonia solanacearum được ghi nhận là gây hại nặng nhất trên cà chua và a ti sô trong những năm gần đây, sự thiệt hại gây ra trên a ti sô từ 5-20% năng suất (Aly, 2000). 2.3 Sơ lược về vi khuẩn Ralstonia solanacearum Vi khuẩn Ralstonia solanacearum có dạng hình gậy, hai đầu hơi tròn, có một lông roi ở một đầu, kích thướt 0,5-1,5µ, nhuộm gram âm là loài vi sinh vật tồn tại ở trong đất thường xuyên gây ra các bệnh chết héo (héo rũ, héo xanh) trên nhiều loại cây trồng như lạc, khoai tây, cà chua, ớt, thuốc lá phổ biến rộng ở hầu hết khắp các vùng, gây tác hại lớn cho sản xuất. Chúng lan truyền theo nước tưới, xâm nhập vào Luận văn tốt nghiệp SVTH: Hồ Thanh Hoàng Download» Agriviet.com 6 cây qua các vết thương và di chuyển vào trong bó mạch. Bệnh thường xảy ra vào lúc cây đang tăng trưởng. Vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ tương đối cao, đất ẩm, xâm nhập qua vết thương, sinh sản ở các bó mạch, kí chủ và di chuyển ở các bó mạch từ thân đến lá, sinh độc tố làm cây héo, chết. Phá bó mạch làm tắt ngẽn sự vận chuyển nước và các chất dinh dưỡng, bệnh hại nhiều trên đất cát pha, đất thịt bệnh nhẹ hơn. Trên những ruộng trồng luân canh với cây lúa nước bệnh nhẹ. Vi khuẩn thích hợp ở nhiệt độ 30-370C, nhiệt độ tối thiểu là 100C, tối đa 410C, nhiệt độ gây chết là 520C, mẫn cảm được môi trường khô. 2.4 Sự phân chia vi khuẩn Ralstonia solanacearum theo đặc tính gây hại 2.4.1 Race Dựa trên phạm vi ký chủ được chia làm 4 race (Martin và French, 1997) + Race 1: Tấn công trên nhiều vùng địa lý, loại cây trồng khác nhau. Đặc biệt trên các cây như khoai tây, cà chua, cà tím, ớt, thuốc lá, đậu phụng. Vi khuẩn Ralstonia solanacearum thuộc race 1 thường gây hại ở những vùng có nhiệt độ ấm áp và gây hại nặng ở vùng nhiệt đới. + Race 2: Chủ yếu tấn công trên các cây thuộc họ chuối như chuối tam bội, chuối lá, chuối sợi. + Race 3: Chủ yếu tấn công trên khoai tây. Khác với race 1, race 3 thường gây hại ở những vùng có nhiệt độ thấp hơn và những vùng có vĩ độ cao. + Race 4: Được ghi nhận tấn công trên cây dâu tằm (mulberry) ở Trung Quốc. Sự phân chia các race thường rất phức tạp do phụ thuộc vào thầnh phần cây ký chủ và phạm vi phân bố của chúng. Theo Martin và French (1997), race 1 lưu Luận văn tốt nghiệp SVTH: Hồ Thanh Hoàng Download» Agriviet.com 7 tồn nhiều năm trong đất, ngược lại race 3 thường có xu hướng giảm sau vài năm nếu không có khoai tây dại làm ký chủ. 2.4.2 Biovar Dựa vào đặc tính sinh lý, sinh hoá khác nhau của các mẫu phân lập, 5 biovar có thể nhận dạng dựa vào khả năng sử dụng và oxi hoá 3 disaccharides (cellobiose, lactose, maltose) và 3 rượu 6 cacbon (dulcitol, mannitol, sorbitol). Biovar 2 thường bao gồm race 3, biovar 5 gồm race 4 và biovar 1, 3, 5 gồm race 1. 2.5 Triệu chứng gây hại của vi khuẩn Ralstonia solanacearum Triệu chứng thường biểu hiện ngay sau khi bệnh xâm nhập vào cây. Ở cây bị bệnh ban ngày lá mất màu nhẵn bóng, tái xanh, héo cụp xuống, ở giai đoạn cây con thường biểu hiện trên toàn cây còn ở giai đoạn cây trưởng thành triệu chứng thường biểu hiện ở lá ngọn trước. Ở 1-2 ngày đầu cây có thể phục hồi lại được vào lúc trời mát hoặc về đêm, nhưng sau 2-3 ngày lá héo không thể hồi phục lại được nữa và toàn cây bị héo rũ rồi chết. Cắt ngang đoạn thân cây gần mặt đất ta thấy bó mạch bị hoá nâu, trong điều kiện ẩm độ cao thân cây bị bệnh dần dần thối mềm, ấn mạnh gần miệng cắt có thể thấy dịch nhờn vi khuẩn tiết ra màu trắng sữa. Rễ có màu nâu đen và thối. 2.6 Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh Thời gian vi khuẩn lưu tồn trong đất phụ thuộc nhiều yếu tố như ẩm độ, nhiệt độ, hoá lý đất. Bên cạnh đó còn phụ thuộc vào race gây bệnh, race 1 thường lưu tồn lâu trong đất trái lại race 3 thường giảm sau vài năm do khả năng thích ứng thấp hơn. Vi khuẩn có thể lưu tồn trong đất từ 5-6 năm, trong cơ thể ký chủ thực vật hoặc trong hạt giống có thể sống tới 7 tháng, còn nếu bám dính trên bề mặt hạt chỉ tồn tại 2-7 ngày (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998). Luận văn tốt nghiệp SVTH: Hồ Thanh Hoàng Download» Agriviet.com 8 Vi khuẩn xâm nhập vào cây qua rễ, vết thương cơ giới, thân non, lỗ hở tự nhiên, do côn trùng, khi vào bên trong chúng sinh sản rất nhanh làm bít các lỗ mạch đồng thời tiết ra độc tố làm các bó mạch bị hoá nâu, đen và gây ra hiện tượng héo do cây bị thiếu nước. Dưới những điều kiện thuận lợi vi khuẩn có thể di chuyển xuyên qua lớp vỏ và đi ra bên ngoài môi trường đất, đó cũng là sự tương tác giữa đất và rễ, rễ bị nhiễm vi khuẩn từ đất và ngược lại vi khuẩn từ trong cây đi ra môi trường đất (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). Vi khuẩn lan truyền chủ yếu bằng nguồn nước, đất như bám dính vào giầy dép, dụng cụ canh tác (Martin và French, 1997). Bệnh héo xanh vi khuẩn phát sinh phát triển phụ thuộc vào đièu kiện đất đai như trên các chân đất cao bệnh thường nặng hơn các chân đất thấp, đất được luân canh với lúa nước làm giảm tỉ lệ bệnh đáng kể (Đỗ Tấn Dũng, 2001). Thời vụ trồng cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát sinh phát triển bệnh, thời vụ trồng có mưa nhiều, ẩm độ cao làm gia tăng sự phát sinh phát triển bệnh. Mật độ trồng cao tỉ lệ bệnh thường cao do chúng tạo một vùng khí hậu thuận lợi cho sự phát sinh phát triển bệnh. Vì nước là nguồn lây lan chủ yếu của bệnh, do đó phương pháp tưới là một trong những yếu tố gia tăng tỉ lệ gây hại của bệnh. 2.7 Biện pháp phòng trừ 2.7.1 Biện pháp hoá học Hiện nay, vẫn chưa có loại thuốc nào đặc hiệu để phòng trừ bệnh héo xanh trên cây cà chua, tuy nhiên biện pháp hoá học vẫn được xem là cần thiết hiện nay, nhưng xét về lâu dài biện pháp hoá học ngày càng thể hiện các mặt trái của nó như làm cho tác nhân gây bệnh trở nên kháng thuốc, đặc biệt là gây ô nhiễm môi Luận văn tốt nghiệp SVTH: Hồ Thanh Hoàng Download» Agriviet.com 9 trường và sức khỏe con người một cách nghiêm trọng. Dùng formol, Mocap 10G, Furadan 3H, vôi, CuSO4 xử lý đất. Dùng thuốc: Kasuran, Rovral, Dithan. 2.7.2 Biện pháp sinh học Khi sử dụng thuốc hoá học để bảo vệ thực vật thì thuốc sẽ tạo thành một lớp mỏng trên bề mặt lá, quả, thân cây, mặt đất, mặt nước và một lớp chất lắng gọi là dư lượng ban đầu của thuốc vì vậy biện pháp sinh học trong công tác bảo vệ thực vật ngày càng chú ý khai thác và vị trí của biện pháp nay ngày càng được nâng cao. Việc bảo vệ môi trường sống, môi trường sản xuất cũng như tiến hành nông nghiệp sạch thì biện pháp này càng có ý nghĩa hơn. Sử dụng một số vi khuẩn đối kháng như Bacillus sudtilis, Pseudomonas fluorescens để xử lí hạt trước khi gieo, nhúng rể cây con trước khi trồng hoặc đưa vi sinh vật đối kháng vào vùng rễ sau trồng nhằm ức chế, cạnh tranh và tiêu diệt vi khuẩn Ralstonia solanacearum (Đỗ Tấn Dũng, 2001). Sử dụng chế phẩm V58 có chứa vi sinh vật đối kháng trên ruộng trồng cà chua ở Tiền Phong - Mê Linh - Vĩnh Phúc, kết quả thu được có công thức sử dùng V58 tỉ lệ chết giảm còn 25% so với đối chứng 80% (Lê Như Kiểu, 2001). Ngoài ra, chúng ta cần phải làm đất vườn ươm sạch bệnh, cày bừa kỹ, bón đạm vừa phải, phân chuồng phải ủ hoai, luân canh với cây lúa nước và dùng thuốc một cách hợp lý. 2.8 Phòng trừ sinh học bệnh cây 2.8.1 Khái niệm phòng trừ sinh học bệnh cây Theo Cook và Baker (1983), phòng trừ sinh học bệnh cây (PTSHBC) là thông qua việc sử dụng một hoặc nhiều sinh vật (ngoại trừ con người) để khống chế mầm bệnh hay làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của một tác nhân gây hại nào đó. Đến năm 1988, Cook đã đưa ra một khái niệm rộng hơn về phòng trừ sinh Luận văn tốt nghiệp SVTH: Hồ Thanh Hoàng Download» Agriviet.com 10 học. Theo ông PTSHBC là việc sử dụng sinh vật, gen và các sản phẩm của gen để điều khiển tác nhân gây bệnh. Các cách điều khiển tác nhân gây bệnh có thể là: (i) duy trì mật số nguồn bệnh ở mức thấp dưới ngưỡng kinh tế, (ii) làm chậm hoặc loại trừ tiến trình xâm nhiễm của bệnh, (iii) kích hoạt và tạo điều kiện phát huy hệ thống tự vệ của cây. 2.8.2 Lựa chọn tác nhân phòng trừ sinh học Chiến lược PTSHBC có thể chia thành hai loại (1) chiến lược dựa trên nguyên tắc cơ bản về sinh thái học hay còn gọi là phòng trừ sinh học cổ điển (Hokkaness và Lynch, 1995) hay phòng trừ sinh học chỉ xử lý một lần (Cook, 1993), (2) chiến lược sử dụng vi sinh vật như là một loại thuốc sinh học và việc xử lý có những điểm gần giống như xử lý thuốc hoá học nhằm mục đích kiểm soát bệnh trong một khoảng thời gian giới hạn. Chiến lược này còn được gọi là phòng trừ sinh học tăng dần (Hokkaness và Lynch, 1995). Sự khác nhau về chiến lược phòng trừ ảnh hưởng đến sự lựa chọn và phương pháp sàng lọc tác nhân phòng trừ sinh học. Đối với chiến lược PTSHBC tăng dần, người ta chú ý đến nguồn gốc của vi sinh vật đối kháng. Tuy nhiên những hiểu biết về khía cạnh này là điều cần thiết cho việc đánh giá rủi ro và là một trong những yêu cầu cần thiết cho quá trình đăng ký thương mại hoá sản phẩm (Lumsden và Lewis, 1989). Có một số phương pháp sàng lọc tác nhân phòng trừ sinh học dựa trên hoạt tính của men thủy phân của vi sinh vật đối kháng, tương tác giữa vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật đối kháng, phương pháp có liên quan đến cây kí chủ. 2.8.3 Vi khuẩn - một tác nhân phòng trừ sinh học: Nhiều công trình nghiên cứu về các tác nhân phòng trừ sinh học đã công bố từ dầu thế kỷ 20 trong đó có vi khuẩn. Đang là nhóm vi khuẩn hoại sinh mà phổ Luận văn tốt nghiệp SVTH: Hồ Thanh Hoàng Download» Agriviet.com 11 biến nhất là Pseudomonas spp., kế đến là Bacillus spp. và Streptomyces (Burr và ctv, 1978, Weller và Cook, 1983). Những nghiên cứu về vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn trên thân lá cây đã dẫn đến việc chia chúng thành ba loại: loại có hại cho cây, loại trung tính và loại có ích cho cây. Aûnh hưởng có ích của nhóm vi khuẩn này là do chúng sản sinh ra chất kích thích tăng trưởng cây, các chất ức chế hoặc làm suy yếu tác nhân gây bệnh hoặc cả hai (Baker, 1988). Cơ chế ban đầu ức chế tác nhân gây bệnh là tiết ra các chất kháng sinh (Fravell, 1988). Tuy nhiên những yếu tố khác như việc tiết ra chất sidrophores, HCN, sự cạnh tranh dinh dưỡng cũng có vai trò quan trọng trong việc ức chế tác nhân gây bệnh (Cook và Baker, 1983). Trong số các loài Pseudomonas spp., Pseudomonas fluorescens được chú ý và tăng cường nghiên cứu hơn hết, vì ngoài khả năng đối kháng với 10 loại nấm bệnh lưu tồn trong đất, loài vi khuẩn này có khả năng kích thích sự phát triển cây trồng. Bằng cách xử lý hạt có hay không có chất mang hoạt chủng vào đất cùng với giá thể làm thức ăn nền, đã làm giảm mức trầm trọng cũa bệnh, làm gia tăng sự phát triển và tăng năng suất cây trồng. Với thuận lợi là có nhiều cơ chế tác dụng như: định cư, chiếm chỗ, loại trừ mầm bệnh ra khỏi vùng thích hợp, tiết chất kháng sinh (Pyrrolnitrin, pyoluteorin) ngoại ký sinh, cạnh tranh dinh dưỡng (hợp chất sắt), gia tăng sức đề kháng cho cây, Pseudomonas rất có triển vọng sử dụng trên lãnh vực thương mại. Biện pháp sinh học trong phòng trừ bệnh cây là điều khiển môi trường, cây trồng và sinh vật đối kháng một cách thích hợp, để tạo nên một thế cân ba