Luận văn Sự thay đổi hàm lượng Flavonoid trong lá của cây Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) theo các giai đoạn phát triển

- 35 - Chương 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ 3.1.1. Khảo sát thực vật học 3.1.1.1. Đặc điểm hình thái Thân: Cây gỗ nhỏ, xốp, mọc đứng, tán rộng nhiều cành, tiết diện tròn, cao từ 8- 12 m. Lá: mọc cách, kép lông chim 3 lần lẻ, có từ 5-7 cặp lá phụ bậc 1, 4-6 cặp lá phụ bậc 2, 6 - 9 cặp lá phụ bậc 3, lá phụ bậc 3 hình elíp, mọc đối, cuống ngắn 1-2 mm, gân lá hình lông chim, dài 1,5-2,5 cm; rộng 1,0-2,0 cm (Ảnh 3.2). Cụm hoa: xim 2 ngã, mọc ở nách lá hay ngọn cành (Ảnh 3.2). Hoa: màu trắng hơi ngả vàng, mùi thơm, cuống hoa dài 1-2cm; lá bắc hình sợi. Hoa có 5 lá đài nhỏ màu xanh, hình tam giác, 5 cánh hoa màu trắng, gần bằng nhau, lõm vào trong giống hình 1 cái muỗng, dài 1,5cm, rộng khoảng 0,5 cm. Bộ nhị: gồm 5 nhị thụ màu vàng xen với 5 nhị lép, nhị thụ nằm đối diện với cánh hoa, nhị lép nằm xen kẽ cánh hoa; bao phấn 2 ô, hướng ngoài. Bộ nhuỵ: 3 lá noãn dính với nhau tạo thành 1 ô, đính phôi trắc mô; bầu noãn thượng (Ảnh 3.1), (Ảnh 3.2). Quả: nang treo, có 3 cạnh, dài 25 - 30cm, màu xanh, hơi gồ lên ở chỗ có hạt, khía có rãnh dọc. Hạt: màu đen, to bằng hạt đậu Hà Lan, tròn có 3 cạnh và 3 cánh màu đà, dạng màng mỏng (Ảnh 3.2). Hoa thức: *♀ K5 C5 A5 G(3) Hoa Đồ: Hoa đồ của hoa Chùm ngây được thể hiện ở hình 3.1 - 36 - Hình 3.1. Hoa đồ của hoa Chùm ngây Ảnh 3.1. Các bộ phận trong Hoa Chùm ngây 50µm 0,2mm Đài Cánh Bộ nhị HoaBộ nhuỵ Bầu noãnHạt phấn - 37 - Dạng sống Lá Cụm hoa Hoa Quả Hạt Ảnh 3.2. Thân, lá, hoa, quả, hạt Chùm ngây ngoài tự nhiên tại Đồng Nai - 38 - 3.1.1.2. Đặc điểm cấu tạo giải phẫu thực vật ¾ Thân: Tiết diện tròn, từ ngoài vào trong gồm có: (Ảnh 3.3) Lớp bần: gồm 2-4 lớp tế bào hình chữ nhật vách hóa bần, sắp xếp thành dãy đồng tâm và xuyên tâm, rãi rác có những đám tế bào bị rách bong ra ngoài. Nhu mô vỏ: gồm những tế bào có hình đa giác hay bầu dục, vách cellulose, bên trong có tinh thể calci oxalate hình cầu gai. Sợi Trụ bì: hóa mô cứng thành từng đám. Libe I: gồm những tế bào vách cellulose có màu hồng đậm, sắp xếp lộn xộn thành từng đám trên 1 vòng tròn. Libe II: phân bố đều trên 1 vòng, gồm những lớp tế bào hình chữ nhật vách cellulose, trong tế bào chứa những tinh thể calci oxalate hình cầu gai. Gỗ II: phân bố đều trên 1 vòng, gồm các mạch gỗ to hình cầu hay bán nguyệt, sắp xếp liên tục thành 1 dãy từ trong ra ngoài, nhu mô gỗ sắp xếp thành những vòng liên tục, xen kẽ có những tia gỗ thẳng hàng. Gỗ I: sắp xếp thành từng cụm dưới gỗ II, gồm 2-3 mạch gỗ, xung quanh có những đám tế bào nhu mô gỗ vách cellulose. Nhu mô tủy: ở trong cùng. - 39 - Ảnh 3.3. Cấu tạo giải phẫu của thân Chùm ngây. A : Toàn bộ vi phẫu. B1, B2, B3 : Cấu tạo các mô từ ngoài vào trong Chú Thích 1: Lớp bần 2: Mô cứng 3: Nhu mô vỏ 4: Sợi Trụ bì 5: Libe I 6: Libe II 7: Calci oxalate 8: Gỗ II 9: Gỗ I 10: Nhu mô tuỷ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A B1 B3 B2 - 40 - ¾ Lá cây Phần gân giữa: Mặt trên phẳng, mặt dưới lồi. Biểu bì trên tế bào to hơn biểu bì dưới, ở ngoài phủ một lớp cutin, có lông che chở đơn bào. Nhu mô: gồm những tế bào hình đa giác, vách mỏng bằng cellulose, sắp xếp lộn xộn để hở những khoảng gian bào nhỏ, trong tế bào có chứa tinh thể calci oxalate hình cầu gai. Bó dẫn xếp thành hình cung, gỗ ở trên, libe ở dưới. Mô dày góc ở trên biểu bì dưới (Ảnh 3.4). Phiến lá: Tế bào biểu bì trên có kích thước to hơn tế bào biểu bì dưới và có lông che chở; biểu bì dưới có lỗ khí, không có lông che chở. Dưới biểu bì trên là nhu mô hình giậu chứa những hạt lục lạp. Nhu mô khuyết: tế bào có hình bầu duc hay đa giác, vách cellulose, sắp xếp lộn xộn chừa những khuyết to, trong tế bào có chứa calci oxalate canxi hình cầu gai; rải rác có những bó libe–gỗ của gân phụ (Ảnh 3.4). Ảnh 3.4. Cấu tạo giải phẫu của lá Chùm ngây. A : Toàn bộ vi phẫu lá B1 : Cấu tạo các mô ở gân giữa B2 : Cấu tạo các mô ở phiến lá Chú Thích 1: Biểu bì trên 2: Nhu mô giậu 3: Calci oxalate 4: Gỗ 5: Libe 6: Mô dày 7: Biểu bì dưới 8: Nhu mô khuyết A 1 2 3 4 5 6 7 1 2 8 B2 B1 - 41 - ¾ Rễ cây Mặt cắt rễ gần tròn, từ ngoài vào trong có: (Ảnh 3.5) Lớp bần: gồm những tế bào nhỏ, dẹt, xếp thành dãy đồng tâm và xuyên tâm, phía ngoài có nhiều chỗ bị bong ra. Nhu mô vỏ: cấu tạo từ những tế bào hình đa giác, vách mỏng, xếp lộn xộn, rải rác trong vùng này có những cụm mô cứng. Libe I: bị ép dẹp khó xác định. Libe II: gồm những lớp tế bào hình chữ nhật vách bằng cellulose, sắp xếp thành dãy xuyên tâm rõ. Gỗ II: chiếm tâm, mạch gỗ II ít, xếp rãi rác, nhu mô gỗ vách cellulose, sắp xếp thành dãy xuyên tâm. Ảnh 3.5. Cấu tạo giải phẫu của rễ Chùm ngây A : Toàn bộ vi phẫu rễ B1, B2: Cấu tạo các mô từ ngoài vào trong của rễ Chú Thích 1: Lớp bần 2: Nhu mô vỏ 3: Cụm mô cứng 4: Tia libe 5: Libe I 6: Libe II 7: Mạch gỗ II 8: Nhu mô gỗ II 1 2 3 4 5 6 7 8 A B1 B2 - 42 - 3.1.1.3. Xác định tên khoa học cây Chùm ngây Cây Chùm ngây nghiên cứu trồng tại Đồng Nai hay ở Thành Phố Hồ Chí Minh có tên khoa học là “Moringa oleifera Lam.”. 3.1.2. Khảo sát vài đặc tính sinh lý của lá cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa, có trái non 3.1.2.1. Xác định lá chức năng Kết quả đo cường độ quang hợp của lá cây Chùm ngây ngoài tự nhiên ở giai đoạn tăng trưởng từ lá số 1 đến lá số 7 (Ảnh 3.6) được trình bày ở bảng 3.1. Ảnh 3.6. Vị trí các lá trên cây Chùm ngây. Lá số 4 Lá số 5 Lá số 6 Lá số 7 Lá số 1 Lá số 2 Lá số 3 - 43 - Bảng 3.1. Cường độ quang hợp của lá cây Chùm ngây ở giai đoạn tăng trưởng Vị trí lá Cường độ quang hợp (µmol CO2/m2.s) 1 40,54 ± 0,83b 2 45,72± 0,14c 3 62,56± 0,69d 4 88,84± 0,28f 5 64,46± 1,22d 6 37,87± 1,03a 7 36,45± 0,33a Các số trung bình biểu diễn mức độ sai biệt có ý nghĩa (theo cột) ở độ tin cậy 95% 40,54 45,72 62,56 88,84 64,46 37,87 36,45 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 2 3 4 5 6 7 Vị trí lá Cư ờ ng đ ộ qu an g hợ p Hình 3.2. Cường độ quang hợp của lá cây Chùm ngây ở các vị trí khác nhau Cường độ quang hợp của lá tăng dần từ lá số 1 đến lá số 4, từ lá thứ 5 trở đi cường độ quang hợp giảm nhanh. Lá số 4 có cường độ quang hợp cao nhất (88,84 %). Do đó lá số 4 là lá chức năng của cây. (µmol /m2/s) - 44 - 3.1.2.2. Khảo sát cường độ quang hợp của lá cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa, có trái non Lá số 4 của cây ở giai đoạn tăng trưởng Lá số 4 của cây ở giai đoạn ra hoa Lá số 4 của cây ở giai đoạn có trái non Ảnh 3.7. Lá số 4 của cây Chùm ngây ở các giai đoạn phát triển. Lá chức năng (lá số 4) của cây ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa, có trái non (Ảnh 3.7) được tiến hành đo cường độ quang hợp, kết quả được thể hiện ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Cường độ quang hợp lá chức năng của cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn phát triển. Cây ở giai đoạn Cường độ quang hợp (µmol CO2/m2/s) Tăng trưởng 88,84± 0,28d Ra hoa 69,74± 0,37b Có trái non 63,42± 0,18a - 45 - 88,84 69,74 63,42 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 2 3 Giai đoạn phát triển C ư ờ ng đ ộ qu an g hợ p Hình 3.3. Cường độ quang hợp của lá chức năng cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn phát triển. 1: Tăng trưởng 2: Ra hoa 3: Có trái non 3.1.2.3. Khảo sát trọng lượng khô/trọng lượng tươi Lá chét của lá số 4 của cây ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa và có trái non được xác định trọng lượng khô/trọng lượng tươi. Kết quả thể hiện ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Tỷ lệ TLK/TLT của lá chét Chùm ngây ở 3 giai đoạn phát triển. Các số trung bình biểu diễn mức độ sai biệt có ý nghĩa (theo cột) ở độ tin cậy 95% TLT: Trọng lượng tươi, TLK: Trọng lượng khô Lá chét của lá chức năng ở cây TL Tươi TB (g) TL Khô TB (g) Tỷ lệ TLK/TLT (%) Tăng trưởng 10,07 ± 0,02a 1,84 ± 0,02a 18,27 ± 0,02a Ra hoa 10,03 ± 0,05a 2,25 ± 0,01b 22,43 ± 0,03b Có trái non 10,05 ± 0,05a 2,43 ± 0,08c 24,18 ± 0,05c (µmol /m2/s) - 46 - 18,27 22,43 24,18 0 5 10 15 20 25 30 1 2 3 Giai đoạn phát triển Tỷ lệ T LK /T LT (% ) Hình 3.4. Sự thay đổi tỷ lệ TLK/TLT của lá chét Chùm ngây ở 3 giai đoạn phát triển. 1: Tăng trưởng 2: ra hoa 3: Có trái non Tỷ lệ TLK/TLT tăng theo từng giai đoạn phát triển, cao nhất ở giai đoạn cây có trái non (24,18 %) và thấp nhất ở giai đoạn cây tăng trưởng (18,27 %). 3.1.2.4. Khảo sát hoạt tính chất ĐHSTTV nội sinh Ly trích và đo hoạt tính hợp chất điều hoà sinh trưởng thực vật ở lá chức năng của cây ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa, có trái non. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.4. Bảng 3.4. Hoạt tính hợp chất ĐHSTTV nội sinh trong lá chức năng Chùm ngây ở 3 giai đoạn phát triển. Hoạt tính chất ĐHSTTV (mg/l) Lá chức năng của cây Auxin Cytokinin Giberelin AAB Tăng trưởng 1,57± 0,14d 1,78± 0,22d 0,02±0,01a 0,18±0,07a Ra hoa 0,74±0,23b 1,46± 0,17c 0,08±0,01a 0,45±0,12b Có trái non 0,58±0,20a 0,65± 0,14a 0,04±0,01a 0,52±0,15b Các số trung bình biểu diễn mức độ sai biệt có ý nghĩa (theo cột) ở độ tin cậy 95% - 47 - 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 1 2 3 Giai đoạn phát triển Ho ạt tí nh c hấ t Đ H ST TV (m g/ l) Auxin Cytokinin Giberelin ABA Hình 3.5. Hoạt tính chất ĐHSTTV trong lá chức năng của cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn phát triển. Theo từng giai đoạn phát triển hoạt tính auxin và cytokinin nội sinh cao ở giai đoạn tăng trưởng, ra hoa và thấp ở giai đoạn có trái non. Hoạt tính giberelin không có sự khác biệt giữa 3 giai đoạn, hoạt tính acid abcisic lại tăng theo giai đoạn phát triển. 3.1.3. Phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật của lá Chùm ngây Phân tích sơ bộ thành phần hóa học trong lá cây Chùm ngây ở giai đoạn tăng trưởng (3 tháng tuổi). Kết quả được thể hiện ở bảng 3.5. - 48 - Bảng 3.5. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học trong lá cây Chùm ngây ở giai đoạn tăng trưởng Thành phần Phản ứng định tính Kết quả Tinh dầu - Mùi thơm nhẹ đặc trưng ++ Chất béo - Vết trong mờ +++ Carotenoid - Phản ứng Carr-Price ++ Triterpenoid - Phản ứng Liebermamn – Burchard + Coumarin - Tăng cường độ huỳnh quang ++ Alkaloid - TT Valse- Mayer - TT Dragendrorff + Anthraquinon - Tăng màu trong dd NaOH 10% - Flavonoid - Tạo phức với AlCl3 - Tạo phức với FeCl3 - Phản ứng Cyanidin +++ ++++ ++ Saponin - Phản ứng tạo bọt - Các chất khử - TT Fehling ++ Các acid hữu cơ - Tinh thể Na2CO3 ++ Tanin - dung dịch FeCl3 +++ Ghi chú : (−) : không có (+) : có ít (++) : có (+++) : có nhiều (++++) : có rất nhiều Kết quả cho thấy trong lá của cây Chùm ngây có các nhóm hợp chất sau: Chất béo, tinh dầu, carotenoid, triterpenoid, coumarin, flavonoid, tanin, acid hữu cơ… nhưng trong đó hợp chất: flavonoid, tanin, chất béo… có nhiều hơn. 3.1.4. Khảo sát hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá cây Chùm ngây 3.1.4.1. Khảo sát hàm lượng flavonoid toàn phần theo vị trí lá ¾ Độ ẩm - 49 - Xác định độ ẩm trên 7 mẫu bột lá của cây Chùm ngây ở giai đoạn tăng trưởng, kết quả được trình bày ở bảng 3.6. Bảng 3.6. Độ ẩm bột lá. Vị trí lá 1 2 3 4 5 6 7 Độ ẩm (%) 6,52 6,83 7,23 6,34 7,65 6,48 7,23 ¾ Định tính flavonoid Dịch chiết lá số 4 của cây Chùm ngây ở giai đoạn tăng trưởng được định tính flavonoid bằng SKLM với quercetin làm chất chuẩn. Hệ dung môi khai triển: n- Butylacetat – nước – acid formic (15:5:5). Phát hiện bằng UV 254 nm, UV 365 nm, hơi NH3. UV 254 nm UV 365 nm hơi NH3 đậm đặc Hình 3.6. Sắc ký đồ quercetin chuẩn (Q) và dịch chiết từ bột lá Chùm ngây (C) Sắc ký đồ cho thấy dịch chiết của bột lá Chùm ngây có 2, 3 vết flavonoid (phát quang ở bước sóng 365 nm, và 254 nm và có màu xanh đen khi tiếp xúc hơi NH3 đậm - 50 - đặc). Trong đó vết trùng với vết của quercetin chuẩn chiếm hàm lượng lớn nhất, do đó được xem là chất chuẩn dùng để định lượng flavonoid toàn phần trong lá Chùm ngây. ¾ Hàm lượng flavonoid toàn phần theo vị trí của lá - Kết quả đo độ hấp thu của quercetin chuẩn tại các nồng độ khác nhau ở bước sóng 415 nm được trình bày ở bảng 3.7, từ kết quả đo độ hấp thu của từng nồng độ quercetin ta dựng đường chuẩn quercetin được trình bày ở hình 3.7. Bảng 3.7. Độ hấp thu của dung dịch quercetin chuẩn trong MeOH. Nồng độ Quercetin (μg/ml) Độ hấp thu 1 0,045 5 0,227 10 0,432 20 0,97 30 1,42 40 1,84 50 2,49 60 2,90 - 51 - Biểu đồ tương quan giữa độ hấp thu và nồng độ Quercetin y = 20,438x + 0,6241 R2 = 0,998 0 10 20 30 40 50 60 70 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Độ hấp thu A N ồn g đ ộ Q ue rc et in Hình 3.7. Đường chuẩn quercetin (y = 20,438x + 0,6241). Đường chuẩn quercetin (y = ax + b) có hệ số a (20,438) lớn hơn nhiều so với hệ số b (0,6241) và R2 = 0,998 gần bằng 1, điều đó chứng tỏ phương pháp chính xác ít có sai số. - Kết quả xác định hàm lượng flavonoid toàn phần theo vị trí của lá trên cây Chùm ngây ở giai đoạn tăng trưởng (3 tháng tuổi) bằng phương pháp UV-Vis được thể hiện ở bảng 3.8 và phụ lục 2.1. Bảng 3.8. Hàm lượng flavonoid toàn phần theo vị trí của lá trên cây Chùm ngây. Vị trí lá Hàm lượng flavonoid toàn phần (%) 1 1,17 2 1,51 3 2,16 4 2,38 5 1,13 6 0,63 7 0,44 (µg/ml) - 52 - 1,17 1,51 2,16 2,38 1,13 0,63 0,44 0 0,5 1 1,5 2 2,5 1 2 3 4 5 6 7 Vị trí lá H àm lư ợ ng fl av on oi d (% ) Hình 3.8. Hàm lượng flavonoid toàn phần theo vị trí của lá trên cây Chùm ngây 3 tháng tuổi. Trên cây Chùm ngây 3 tháng tuổi, hàm lượng (%) flavonoid toàn phần có sự thay đổi theo từng vị trí của lá trên cây, tăng cao dần ở những lá non từ lá số 1 đến lá số 4, giảm dần ở lá già từ lá số 5 trở đi. Hàm lượng flavonoid cao nhất ở lá số 4 (2,38 %), sau đó có sự giảm đáng kể ở lá số 7 (0,44 %). 3.1.4.2. Khảo sát hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá của cây ở 3 giai đoạn phát triển Lá số 1 đến lá số 5 của cây ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa và có trái non được dùng để xác định hàm lượng flavonoid toàn phần. ¾ Độ ẩm Độ ẩm của bột lá của cây ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa và có trái non được trình bày ở bảng 3.9. Bảng 3.9. Độ ẩm bột lá của cây ở 3 giai đoạn phát triển. Bột lá ở cây Tăng trưởng Ra hoa Có trái non Độ ẩm (%) 7,52 7,83 7,03 - 53 - ¾ Định tính flavonoid Lá của cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa và có trái non được định tính flavonoid bằng SKLM với quercetin làm chất chuẩn. Hệ dung môi khai triển: n-Butylacetat – nước – acid formic (15:5:5). Phát hiện bằng UV 254 nm, UV 365 nm. Sắc ký đồ cho thấy có flavonoid trong dịch chiết của lá ở 3 giai đoạn phát triển. Hình 3.9. Sắc ký đồ dịch chiết lá của cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn phát triển. M1, M2, M3 : Dịch chiết lá tuần tự ở cây tăng trưởng, ra hoa và có trái non; Q: Quercetin chuẩn Sắc ký đồ cho thấy dịch chiết lá của cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn phát triển đều có flavonoid vì trùng với vết của quercetin chuẩn. ¾ Hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá của cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn phát triển Kết quả định lượng flavonoid toàn phần trong lá của cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa và có trái non bằng phương pháp UV-Vis được trình bày ở bảng 3.10. UV 365 nm UV 254 nm - 54 - Bảng 3.10. Hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá Chùm ngây ở 3 giai đoạn phát triển. Cây ở giai đoạn Hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá (%) Tăng trưởng 1,67 Ra hoa 1,51 Có trái non 1,09 1,67 1,51 1,09 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 1 2 3 Giai đoạn phát triển của cây H àm lư ợ ng fl av on oi d tr on g lá (% ) Hình 3.10. Hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá của cây ở giai đoạn tăng trưởng (1), ra hoa (2), có trái non (3). Kết quả cho thấy hàm lượng % flavonoid toàn phần trong lá của cây ở giai đoạn tăng trưởng (3 tháng tuổi) là cao nhất (1,67 %), và giảm dần ở giai đoạn ra hoa (1,51 %), có trái non (1,09 %) là thấp nhất.. 3.1.5. Nuôi cấy tạo mô sẹo 3.1.5.1. Thử nghiệm khử trùng mẫu Các hạt Chùm ngây sau khi khử trùng ở tỷ lệ javel/nước và thời gian khác nhau. Nuôi cấy trong môi trường MS0. Kết quả thế hiện ở bảng 3.11. - 55 - Bảng 3.11. Tỷ lệ mẫu sống và không nhiễm sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS0 Ảnh 3.8. Hạt tạo cây mầm sau 1, 2 tuần nuôi cấy trong môi trường MS0 Tỷ lệ mẫu không nhiễm khi khử trùng bằng Javel/nước cất (1: 2) trong thời gian 15 phút là 96 % là tốt nhất. 3.1.5.2. Tạo cây con in-vitro Sau 3 tuần nuôi cấy hạt trong môi trường MS có bổ sung GA3 ở các nồng độ khác nhau, hạt nảy mầm tạo rễ và tạo cây con (Bảng 3.12). Tỷ lệ (Javel: nước cất) Thời gian khử trùng (phút) 1:2 1:3 10 80% 70% 15 96% 90% - 56 - Bảng 3.12. Tỷ lệ tạo rễ và hình thành cây con sau 3 tuần nuôi cấy trên các môi trường bổ sung GA3 ở nồng độ khác nhau Môi trường Tỉ lệ tạo rễ Tỷ lệ tạo cây con MS 100% 80% MS + GA3 0,2 mg/l 100% 100% MS + GA3 0,5 mg/l 100% 80% MS + GA3 1,0 mg/l 100% 60% Sau 3 tuần nuôi cấy tất cả các môi trường đều tạo rễ 100% nhưng chỉ có môi trường MS + GA3 0,2 mg/l cho ta kết quả tốt nhất (100% tạo rễ và cây con), cây con hình thành phát triển tốt về chiều cao , có 2 lá non ở ngọn (Ảnh 3.9). Ảnh 3.9. Cây con in-vitro sau 3 tuần nuôi cấy trong môi trường MS + GA3 0,2 mg/l 3.1.5.3. Khảo sát sự tạo sẹo Lá chét cây con in-vitro 3 tuần tuổi được cấy trên môi trường kích thích tạo sẹo có tỷ lệ NAA và BA thay đổi. Kết quả cho thấy lá non cây Chùm ngây in-vitro rất dễ dàng tạo sẹo trên các môi trường đã khảo sát sau 1 tuần nuôi cấy, nhưng trên môi trường MS + NAA 1mg/l, sẹo tạo thành nhanh chóng phân hóa tạo rễ, chỉ một ít tiếp - 57 - tục nhân sẹo. Nhưng trên môi trường MS + NAA 1mg/l + BA 0,2 mg/l, sẹo tạo thành rất sớm và nhân lên rất nhanh (Ảnh 3.10). Ảnh 3.10: Hình thái mô sẹo lá sau 3 tuần nuôi cấy trên các môi trường 3.1.5.4. Khảo sát đặc điểm hình thái và giải phẫu mô sẹo Mô sẹo trên môi trường MS + NAA 1 mg/l + BA 0,2 mg/l sau 2 tuần tuổi được cấy sang môi trường MS + NAA 1 mg/l + BA 0,2 mg/l. Quan sát mô tả hình thái của mô sẹo theo thời gian. Mô sẹo thu được chủ yếu là sẹo xốp, tuần 1 mô sẹo có màu xanh lá chuối non, tuần 2, 3 mô sẹo chuyển sang màu trắng đục và tiếp tục phát triển, sang tuần 4 sẹo phát triển chậm, có màu nâu (Bảng 3.13). MS + NAA 1 mg/l MS + NAA 1 mg/l + BA 0,2 mg/l Rễ non - 58 - Bảng 3.13. Đặc điểm hình thái mô sẹo và ảnh minh họa. Thời gian Đặc điểm hình thái Ảnh minh họa Tuần 1 Tế bào bắt đầu phân chia, tạo sẹo từ màu xanh lá chuối non chuyển sang màu trắng đục. Tuần 2 Sẹo vẫn phát triển mạnh, chuyển dần sang màu trắng đục và vàng nhạt. Tuần 3 Sẹo tiếp tục phát triển, hình thái giống giai đoạn tuần 2. Tuần 4 Sẹo phát triển chậm, có màu nâu. - 59 - Ảnh 3.11. Cấu trúc giải phẫu của lá và mô sẹo lá 1, 2 tuần tuổi. Mô sẹo được hình thành chủ yếu là do sự phản phân hoá lớp tế bào ở vùng nhu mô và vùng tượng tầng giữa bó gỗ và bó libe. Sự phản phân hoá xảy ra ở tuần 1, sang tuần thứ 2 thì có sự phân chia mạnh. 3.1.5.5. Khảo sát sự tăng trọng của mô sẹo theo thời gian Mô sẹo sau 2 tuần tuổi nuôi cấy được cấy sang môi trường MS + NAA 1 mg/l + BA 0,2 mg/l, khảo sát sự tăng trưởng của mô sẹo theo thời gian. Trọng lượng cấy ban đầu là 1,0 g tươi. Kết quả sự tăng trưởng của mô sẹo được trình bày ở hình 3.11 và bảng 3.14. Bảng 3.14. Trọng lượng của mô sẹo lá Chùm ngây theo thời gian trên môi trường MS + NAA 1 mg/l + BA 0,2 mg/l. Thời gian (tuần) Trọng lượng tươi (g) Trọng lượng khô (g) 0 1,00± 0,06a 0,05± 0,02a 1 2,84 ± 0,13c 0,14 ± 0,06b 2 4,81 ± 1,14f 0,29 ± 0,13d 3 5,67 ± 0,57fg 0,34 ± 0,05df 4 6,08 ± 0,32g 0,34 ± 0,01df Các số trung bình biểu diễn mức độ sai biệt có ý nghĩa (theo cột) ở độ tin cậy 95% Lá ban đầu Mô sẹo lá 1 tuần Mô sẹo lá 2 tuần Bó gỗ Nhu mô Nhu mô phân chia Nhu mô phân chia mạnh - 60 - 0 0,5 1 1,5