Luận văn Tạo dòng và biểu hiện gene mã hóa Interferon Alpha 2B của người trên hệ thống Pichia Pastoris

Chương III KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN Luận văn Thạc sĩ KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN Trang 28 III.1 TẠO DÒNG ESCHERICHIA COLI MANG GENE MÃ HÓA CHO INTERFERON ALPHA 2B CỦA NGƯỜI III.1.1. Tổng hợp gene mã hóa cho Interferon alpha 2b của người Protein hIFN-α2b có kích thước 165 aa, trọng lượng khoảng 19,2 kDa. Gene mã hóa cho hIFN-α2b nằm ở vị trí 9p22, là một gene không có intron. Chiều dài của gene là 498 bp. Với mục tiêu là nhân dòng gene mã hóa hIFN-α2b, hai mồi chuyên biệt ñược thiết kế tại hai ñầu của gene, với trình tự gốc lấy từ ngân hàng gene (NM_000605.2). Mồi xuôi (IFN-F) bắt ñầu từ vị trí 138, kéo dài 31bp và ñược gắn thêm trình tự cắt của EcoRI ở ñầu 5’ và mồi ngược (IFN-R2) bắt ñầu từ vị trí 632, kéo dài 30 bp ñược gắn trình tự cắt của NotI. ðoạn gene mục tiêu sẽ ñược khuếch ñại bằng phương pháp PCR (Hình 3.1). Hình 3.1. Cơ chế khuếch ñại gene mã hóa hIFN-α2b bằng phương pháp PCR Vì gene mã hóa hIFN-α2b chỉ bao gồm extron không có intron nên DNA bộ gene ñược tách từ tế bào biểu bì má ñược trực tiếp sử dụng làm khuôn khuếch ñại trình tự gene mã hóa cho hIFN-α2b trong phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt IFN-F/IFN-R2. Sản phẩm khuếch ñại có kích thước mong muốn là 516bp tương ứng với trình tự gene mã hóa cho hIFN-α2b có kích thước là 498bp và trình tự Luận văn Thạc sĩ KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN Trang 29 enzyme cắt giới hạn có kích thước là 18bp. Sản phẩm PCR ñược tiến hành ñiện di trên gel agarose 2% ñể kiểm tra. Kết quả ñiện di sản phẩm PCR khuếch ñại ñoạn gene hIFN-α2b (Hình 3.2) cho thấy ở giếng 1 xuất hiện 1 vạch có kích thước khoảng 500bp so với thang chuẩn tương ñương với kích thước của gene mã hóa hIFN-α2b trên lý thuyết, ñồng thời không xuất hiện ở ñối chứng âm là hỗn hợp PCR không chứa bản mẫu (Giếng 2, Hình 3.2). Như vậy, ñoạn gene hIFN-α2b ñã ñược khuếch ñại thành công bằng phương pháp PCR. Hình 3.2. Kết quả ñiện di trên gel agarose 2% của sản phẩm PCR. M: thang DNA 100 bp; 1: sản phẩm PCR; 2: chứng âm Nhằm mục ñích thu nhận ñoạn DNA mục tiêu tinh sạch dùng cho các công ñoạn tạo dòng tiếp theo, sản phẩm PCR ñược ñiện di và tinh chế vạch mục tiêu bằng kit tinh sạch từ gel của Qiagen. Kết quả tinh sạch ñược tiến hành ñiện di DNA trên gel agarose 2% ñể kiểm tra (Hình 3.3) cho thấy chỉ có duy nhất ñoạn DNA có kích thước khoảng 500bp tương ứng với kích thước của gene hIFN-α2b như mong muốn khi so với thang chuẩn (Giếng 1, Hình 3.3). Sản phẩm này ñược dùng ñể thực hiện cho bước nhân dòng tiếp theo. 500 2 M 1 Luận văn Thạc sĩ KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN Trang 30 Hình 3.3. Kết quả ñiện di trên gel agarose 2% của sản phẩm PCR sau khi ñược tinh sạch từ gel. M: thang DNA 100 bp; 1: sản phẩm tinh sạch III.1.2. Tạo dòng Escherichia coli DH5α mang vector nhân dòng gene mã hóa Interferon alpha 2b của người ðoạn DNA mục tiêu sau khi tinh sạch ñược gắn chèn vào plasmid pJET1.2 (Fermentas). Plasmid tái tổ hợp ñược biến nạp vào tế bào E. coli DH5α bằng phương pháp ñiện biến nạp. ðể sàng lọc các chủng E. coli mang vector chứa gene mã hóa hIFN-α2b, 20 khuẩn lạc mọc ñược trên môi trường LB có Amp 50µg/ml (kí hiệu từ EJ1 ñến EJ20) ñược chọn ngẫu nhiên ñể làm mẫu thực hiện PCR khuẩn lạc với cặp mồi pJET-F/pJET-R (Hình 3.4). Kết quả ñiện di DNA sản phẩm PCR khuẩn lạc cho thấy có 4 chủng EJ4, EJ8, EJ15, EJ16 (Giếng 4, 8, 15 và 16, Hình 3.5) cho vạch có kích thước khoảng 600bp phù hợp với kích thước ñoạn gene hIFN-α2b khi khuếch ñại với cặp mồi pJET- F/pJET-R. ðồng thời, ñối chứng âm không có bản mẫu (Giếng (-), Hình 3.5) của phản ứng PCR khuẩn lạc không cho vạch. Dựa vào kết quả này có thể khẳng ñịnh 4 chủng EJ4, EJ8, EJ15 và EJ16 có mang ñoạn gene hIFN-α2b mục tiêu. M 1 500 Luận văn Thạc sĩ KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN Trang 31 Hình 3.4. Cơ chế kiểm tra sự hiện diện của ñoạn gene mục tiêu trong plasmid pJET1.2 tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với cặp mồi pJET-F/pJET-R Hình 3.5. Kết quả ñiện di trên gel agarose 2% sản phẩm PCR khuẩn lạc. M: thang DNA 100 bp; 1-20: sản phẩm PCR khuẩn lạc từ các khuẩn lạc trắng lấy ngẫu nhiên theo thứ tự từ EJ1 ñến EJ20; (-): Chứng âm Bốn chủng dự tuyển ñược tách chiết plasmid và tiến hành kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng cắt với cặp enzyme cắt giới hạn EcoRI/NotI (Hình 3.6). Kết quả ñiện di DNA sản phẩm cắt cho thấy, ở các giếng 1, 2, 3 và 4 là sản phẩm cắt của plasmid tách chiết từ các chủng EJ4, EJ8, EJ15 và EJ16 với hai enzyme trên ñều cho hai vạch có kích thước lần lượt là khoảng 500bp và khoảng 3kb tương ứng với kích thước ñoạn gene hIFN-α2b và kích thước của plasmid pJET1.2 khi mở vòng ñược dự ñoán trên lý thuyết. 634bp 118bp pJET-F pJET-R Trước khi chèn ñoạn gene hIFN-α2b plasmid pJET1.2 ðoạn gene hIFN α2b pJET-F pJET-R Sau khi chèn ñoạn gene hIFN-α2b pJET1.2 pJET1.2 plasmid pJET1.2 ðoạn gene hIFN α2b 600 X X X X M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 () M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Luận văn Thạc sĩ KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN Trang 32 Hình3.6. Kết quả ñiện di trên gel agarose 2% của sản phẩm của phản ứng cắt giới hạn plasmid pJET1.2 tái tổ hợp bằng EcoRI và NotI. M: thang DNA 100 bp; 1-4: sản phẩm cắt plasmid tách từ 4 chủng tương ứng EJ4, EJ8, EJ15, EJ16 Bên cạch ñó, nhằm xác ñịnh trình tự chính xác của ñoạn gene hIFN-α2b thu nhận, plasmid pJET1.2 mang gene mã hóa hIFN-α2b ñã kiểm tra ñược tiến hành gửi giải trình tự. Kết quả giải trình tự cho thấy, chủng EJ15 mang plasmid pJET1.2 chứa ñoạn gene hIFN-α2b có trình tự tương ñồng 100% với trình tự gene mã hóa cho hIFN-α2b trên Ngân hàng Gene (Hình 3.7). Như vậy, chúng tôi ñã tạo và nhân dòng ñược gene mã hóa cho hIFN-α2b của người trong tế bào E. coli DH5α. M 1 2 3 4 500 500 M 1 2 3 4 Luận văn Thạc sĩ KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN Trang 33 Hình 3.7. Kết quả so sánh trình tự giữa gene hIFN-α2b từ chủng EJ15 (IFNsyn) và gene hIFN-α2b từ ngân hàng gene (NM_000605.2) Luận văn Thạc sĩ KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN Trang 34 III.2. TẠO DÒNG PICHIA PASTORIS BIỂU HIỆN INTERFERON ALPHA 2B CỦA NGƯỜI III.2.1. Tạo dòng Escherichia coli DH5α mang vector biểu hiện Interferon alpha 2b của người Gene mã hóa cho hIFN-α2b ñược thu nhận từ vector nhân dòng pJET1.2 bằng phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn EcoRI và NotI. Sản phẩm cắt ñược ñiện di và tinh chế từ gel agarose ñể tiến hành thu nhận gene chuẩn bị cho giai ñoạn gắn chèn vào vector biểu hiện pPIC9K. Kết quả thu nhận gene kiểm tra trên gel agarose (Hình 3.8) cho thấy ở giếng 1 xuất hiện một vạch có kích thước tương ứng với kích thước gene hIFN-α2b vào khoảng 500bp. ðồng thời plasmid pPIC9K cũng ñược cắt bằng hai enzyme trên. Sản phẩm cắt sau khi tinh sạch ñược ñiện di trên gel agarose (Giếng 2, Hình 3.8) cho một vạch có kích thước khoảng 9.3kb tương ứng với kích thước pPIC9K ñã mở vòng bằng hai enzyme trên. Hình 3.8. Kết quả ñiện di trên gel agarose 1% sản phẩm tinh sạch từ gel ñoạn gene hIFN-α2b và plasmid pPIC9K sau khi ñược cắt bằng cặp enzyme EcoRI/NotI. M: thang DNA 100bp; 1: sản phẩm tinh sạch từ gel của ñoạn gene hIFN-α2b; 2: sản phẩm tinh sạch từ gel của plasmid pPIC9K M 1 2 500 Luận văn Thạc sĩ TÀI LIỆU THAM KHẢO Trang 35 Plasmid pPIC9K ñã mở vòng ñược nối với ñoạn gene hIFN-α2b ñã qua xử lý với cặp enzyme EcoRI/NotI bằng T4 ligase. (Hình 3.9). Sản phẩm nối ñược chuyển vào tế bào E. coli DH5α bằng phương pháp ñiện biến nạp. Chỉ có những tế bào E. coli DH5α có mang plasmid tái tổ hợp mang ñoạn gene kháng Amp mới có khả năng tạo khuẩn lạc trên môi trường LB có chứa Amp (50µg/ml). Các khuẩn lạc dự tuyển (EP1, EP2, EP3, EP4, và EP5) ñược tiến hành kiểm tra bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi chuyên biệt cho gene mã hóa hIFN-α2b (IFN-F và IFN-R2) (Hình 3.10) và bằng phản ứng cắt giới hạn với 2 enzyme EcoRI và NotI (Hình 3.11). Kết quả ñiện di sản phẩm PCR khuẩn lạc (Hình 3.10) cho thấy cả 5 chủng ñều cho sản phẩm có kích thước khoảng 500bp tương ứng với kích thước ñoạn gene hIFN-α2b, trong khi chứng âm (Giếng 2, Hình 3.10) không xuất hiện vạch, chứng tỏ, cả 5 chủng này ñều có mang ñoạn gene chèn. Kết quả kiểm tra chủng EP3 bằng phản ứng cắt giới hạn với cặp enzyme EcoRI/NotI (Hình 3.11) cho thấy ở giếng 1 có 1 vạch có kích thước khoảng 500bp tương ứng với kích thước của ñoạn gene hIFN-α2b và 1 vạch có kích thước khoảng 9.3kb tương ứng với kích thước của plasmid pPIC9K khi mở vòng. Như vậy, chủng EP3 là chủng tế bào E. coli DH5α mang plasmid pPIC9K có chứa gen mã hóa hIFN-α2b. Hình 3.9. Cấu trúc vector biểu hiện có mang gene mã hóa cho hIFN-α2b Luận văn Thạc sĩ TÀI LIỆU THAM KHẢO Trang 36 Hình 3.10. Kết quả ñiện di trên gel agarose 2% sản phẩm PCR khuẩn lạc với mồi IFN-F và IFN-R2. M: thang DNA 100 bp; 1, 3, 4, 5, 6: sản phẩm PCR từ khuẩn lạc EP1, EP2, EP3, EP4, EP5 lấy ngẫu nhiên; 2: chứng âm Hình 3.11. Kết quả ñiện di trên gel agarose 1% sản phẩm cắt plasmid bằng EcoRI và NotI. 1: sản phẩm cắt từ plasmid lấy từ chủng EP3. 2: sản phẩm cắt từ plasmid pPIC9K không mang gene. M: thang DNA 1kb 1 2 3 M 4 5 6 500bp 1 2 M 500 516 10000 9300 E Luận văn Thạc sĩ TÀI LIỆU THAM KHẢO Trang 37 III.2.2. Tạo dòng Pichia pastoris có khả năng biểu hiện Interferon alpha 2b của người Plasmid pPIC9K mang gene mã hóa cho hIFN-α2b ñã qua kiểm tra ñược xử lý bằng enzyme cắt giới hạn SalI ñể tăng khả năng trao ñổi chéo giữa plasmid và bộ gene của tế bào nấm men, cũng như ñể tạo ñược chủng Pichia pastoris tái tổ hợp dạng Mut+. Plasmid pPIC9K dạng thẳng ñược chuyển vào tế bào Pichia pastoris GS115 bằng phương pháp ñiện biến nạp. Trong tế bào, do có sự tương ñồng giữa trình tự gene mã hóa cho histidinol dehydrogenase trên bộ gene của tế bào và trên plasmid nên xảy ra trao ñổi chéo, dẫn ñến việc gene mục tiêu từ plasmid ñược chuyển vào trong bộ gene của tế bào (Hình 3.12). Nhờ vậy, gene mục tiêu tồn tại ổn ñịnh trong tế bào. Hình 3.12. Cơ chế trao ñổi chéo xảy ra tại locus his4 giữa bộ gene của tế bào với vector biểu hiện Tế bào có mang gene mã hóa cho hIFN-α2b sẽ mọc ñược trên môi trường YPD có kháng sinh G418 (4mg/ml). Kết quả nhóm thu nhận ñược 27 khuẩn lạc (ñược ñặt tên từ P1 ñến P27). 27 chủng này ñược chuyển sang môi trường MM có methanol là chất ñể cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu và ñược kiểm tra khả năng Luận văn Thạc sĩ TÀI LIỆU THAM KHẢO Trang 38 biểu hiện hIFN-α2b bằng phương pháp lai khuẩn lạc với kháng thể ñơn dòng kháng hIFN-α2b. Khuẩn lạc có khả năng biểu hiện ñược hIFN-α2b sẽ hiện màu trên màng lai. Kết quả hiện màu cho thấy có 23 khuẩn lạc cho tín hiệu dương tính trên màng lai và 5 khuẩn lạc không cho tín hiệu (Hình 3.13). Như vậy, trong 27 chủng thu nhận ñược có 23 chủng có khả năng biểu hiện hIFN-α2b. Hình 3.13. Kết quả lai khuẩn lạc, có 23 khuẩn lạc cho kết quả dương tính khi lai với kháng thể kháng hIFN-α2b III.3. BIỂU HIỆN INTERFERON ALPHA 2B CỦA NGƯỜI Căn cứ sơ bộ trên kết quả lai khuẩn lạc, chủng P9 ñược chọn ñể tiến hành lên men trong ñiều kiện nuôi cấy lắc ñể kiểm tra mức ñộ biểu hiện hIFN-α2b. ðiều kiện lên men ñược thiết lập theo ñiều kiện nuôi cấy chuẩn cho Pichia pastoris là pH 6.0, nhiệt ñộ tăng sinh và nhiệt ñộ cảm ứng là 28oC, thời gian nuôi cấy là 96 giờ và nồng ñộ methanol cảm ứng là 0.5% ñược thêm vào sau mỗi 24 giờ. Kết quả phân tích dịch môi trường sau lên men bằng SDS-PAGE cho thấy tại các thời ñiểm cảm ứng là 72 giờ và 96 giờ (Giếng 2, 3, Hình 3.14-A) ñều có xuất hiện Luận văn Thạc sĩ TÀI LIỆU THAM KHẢO Trang 39 vạch protein có kích thước tương ứng với kích thước của hIFN-α2b (19.2 kDa), ñồng thời ở ñối chứng âm là dịch môi trường tại thời ñiểm 0 giờ (Giếng 1, Hình 3.14 - A) không xuất hiện vạch protein này. Như vậy kết quả cho thấy chủng P9 có khả năng biểu hiện protein có kích thước 19.2 kDa tương ứng với kích thước của hIFN-α2b khi có sự cảm ứng biểu hiện của MeOH. Nhằm xác nhận protein có kích thước 19.2 kDa ñược ghi nhận trên SDS- PAGE là hIFN-α2b, các mẫu tương ứng ñược tiến hành lai Western blot với kháng thể ñơn dòng kháng hIFN-α2b. Kết quả hiện màu (Hình 3.14 - B) cho thấy xuất hiện tín hiệu dương tính tại vị trí tương ứng với vạch protein có kích thước 19.2 kDa ñã ghi nhận trên SDS-PAGE. Như vậy, có thể kết luận chủng P9 có khả năng biểu hiện protein hIFN-α2b ở dạng tan tiết vào môi trường. Tuy nhiên, kết quả phân tích bằng SDS-PAGE cũng cho thấy hàm lượng hIFN-α2b ñược biểu hiện từ chủng P9 chưa cao. Mặt khác, dịch môi trường sau cảm ứng lại có nhiều protein tạp với hàm lượng cao hơn rất nhiều so với hIFN-α2b mục tiêu. Hình 3.14. Kết quả ñánh giá hàm lượng hIFN-α2b ñược biểu hiện ở ñiều kiện nuôi cấy chuẩn cho Pichia pastoris bằng SDS-PAGE (A) và Western blot (B). M: thang protein thường (97.4, 66.2, 45, 31, 21.5, và 14.4 (kDal) ); Giếng 1-3 tương ứng dịch nổi thu sau 0 giờ, 72 giờ, 96 giờ cảm ứng biểu hiện; M 1 2 3 1 2 3 97.4 66.2 45.0 31.0 21.5 14.4 A B Luận văn Thạc sĩ TÀI LIỆU THAM KHẢO Trang 40 Phân tích trên kết quả SDS-PAGE cho thấy, các protein tạp này giống nhau giữa các mẫu trước và sau biểu hiện, nên có thể ñây là các protein của tế bào nấm men tiết ra trong quá trình sinh trưởng của chúng. Vì vậy, ñể tối ưu hóa sự cảm ứng biểu hiện hIFN-α2b tiết vào môi trường, ñiều kiện nuôi cấy và cảm ứng cần ñược thay ñổi. Trong các ñiều kiện nuôi cấy, nhiệt ñộ cảm ứng và pH là hai yếu tố có thể kiểm soát ñược, nhưng pH 6.0 theo các nghiên cứu trước cho thấy là tối ưu cho biểu hiện protein ở nấm men, vì vậy, nhiệt ñộ cảm ứng là yếu tố ñược thay ñổi, cụ thể là từ 28oC xuống còn 20oC. Bên cạnh ñó, nồng ñộ MeOH cũng ñược tăng từ 0.5% lên 1% theo các tài liệu tham khảo [1], [6]. Dịch môi trường sau khi nuôi cấy cảm ứng ñược tiến hành ño nồng ñộ protein tổng bằng phương pháp Bradford cho thấy hàm lượng protein tổng thu nhận là 297µg/ml. Kết quả ñiện di dịch môi trường sau khi nuôi cấy cảm ứng (Hình 3.15) cho thấy mẫu thu nhận tại các thời ñiểm cảm ứng là 24, 48, 72, 96 và 104 giờ (Giếng 2-6, Hình 3.15) ñều có xuất hiện vạch protein hIFN-α2b với hàm lượng tăng dần theo thời gian cảm ứng. ðồng thời ở mẫu chứng âm tại thời ñiểm 0 giờ (Giếng 1, Hình 3.15) không xuất hiện vạch protein này. Bên cạnh ñó, tại các thời ñiểm 72 giờ (Giếng 4, Hình 3.15) cho thấy lượng protein hIFN-α2b ñược biểu hiện nhiều nhất ở cùng một lượng mẫu ñiện di. Hình 3.15. Kết quả ñánh giá hàm lượng hIFN-α2b ñược biểu hiện ở ñiều kiện nuôi cấy cải tiến cho Pichia pastoris bằng SDS-PAGE. (M) thang protein của Biolab; 1-6 tương ứng dịch nổi thu sau 0 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 104 giờ cảm ứng biểu hiện; Vạch protein có kích thước tương ứng với hIFN-α2b 1 2 3 4 5 6 M 175 80 58 46 30 23 17 7 Luận văn Thạc sĩ TÀI LIỆU THAM KHẢO Trang 41 Tuy nhiên ñể khẳng ñịnh phần lớn protein ñược ghi nhận trên SDS-PAGE (Hình 3.15) là hIFN-α2b, các mẫu tương ứng ñược tiến hành lai Western blot với kháng thể ñơn dòng kháng hIFN-α2b. Sự hiện diện của hIFN-α2b ñược ghi nhận bằng vạch màu trên màng lai. Kết quả hiện màu của phản ứng lai Western blot cho thấy, mẫu dịch môi trường tại các thời ñiểm 24, 48, 72, 96 và 104 giờ sau khi cảm ứng (Giếng 2, 3, 4, 5, Hình 3.16) ñều cho kết quả dương tính tại vị trí của các vạch protein ñược ghi nhận trên SDS-PAGE có kích thước tương ứng với hIFN-α2b, trong khi ñó chứng âm là dịch môi trường khi chưa cảm ứng (Giếng 1, Hình 3.16) không cho tín hiệu trên màng lai. Bên cạnh ñó, mức ñộ hiện màu tại thời ñiểm 72 giờ là cao nhất, tương ứng với kết quả SDS-PAGE là vạch protein rõ nhất. ðiều này cho thấy có sự hiện diện của hIFN-α2b trong các dịch môi trường sau cảm ứng và tại thời ñiểm 72 giờ lượng protein ñích thu nhận ñược cao nhất. Như vậy, giai ñoạn cảm ứng biểu hiện hIFN-α2b có thể dừng lại sau 72 giờ cảm ứng thay vì 96 giờ theo ñiều kiện chuẩn. Hình 3.16. Kết quả ñánh giá protein ñược biểu hiện bằng Western blot; 1-6: dịch nổi thu sau 0 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 104 giờ cảm ứng biểu hiện; Kết quả SDS-PAGE và Western blot cho thấy có sự hiện diện của hIFN-α2b trong dịch môi trường sau lên men và là protein ñược biểu hiện chủ yếu, vượt trội 1 2 3 4 5 6 hIFN-α2b Luận văn Thạc sĩ TÀI LIỆU THAM KHẢO Trang 42 so với các protein khác. Như vậy, ñiều kiện này cho phép biểu hiện tốt hIFN-α2b, ít lẫn protein tạp hơn trong môi trường bởi chủng P9.