Luận văn Tạo virus cúm A tái tổ hợp mang gene NA của chủng H5N1 Việt Nam bằng kỹ thuật di truyền ngược

Tổng quan tài liệu Phaàn 1: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU Tổng quan tài liệu 2 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam 1. Tổng quan tài liệu 1.1 Tình hình dịch tễ virus cúm A Trong suốt thế kỷ XX, virus cúm A đã gây ra nhiều trận dịch với các mức độ thiệt hại khác nhau cho người và gia cầm, một vài trận trong số đó phát triển thành đại dịch. Đại dịch cúm xảy ra thường để lại hậu quả nặng nề, thậm chí làm xáo trộn xã hội. Các virus cúm gây ra đại dịch thường là chủng virus mới, xa lạ với hệ thống miễn dịch của người và gia cầm, mà các virus mới này chủ yếu là do sự tái sắp xếp (reassortment) các protein bề mặt HA, NA hoặc protein bên trong của các chủng virus giữa người và gia cầm sinh ra. Đại dịch “cúm thế kỷ” H1N1 năm 1918 ban đầu xuất hiện ở Tây Ban Nha (nên còn gọi là “cúm Tây Ban Nha” – Spanish flu) sau đó nhanh chóng lan rộng ra toàn thế giới làm thiệt mạng ước tính từ 50 đến 100 triệu người (riêng ở Hoa Kỳ là 675.000 người), là một ví dụ điển hình nhất về tính khốc liệt [41]. Sau đó, đại dịch “cúm Châu Á” (Asian flu) H2N2 năm 1957 và đại dịch “cúm HongKong” (HongKong flu) H3N2 năm 1968 làm thiệt mạng chỉ tính riêng ở Hoa Kỳ là 70.000 và 34.000 người, đều là các chủng virus đã có sự tái sắp xếp hai kháng nguyên bề mặt HA và NA [32]. Năm 1983 trận dịch do chủng H5N2 gây ra ở bang Pennsylvania (Hoa Kỳ) làm thiệt mạng hơn 17 triệu gia cầm, phải mất hơn hai năm để khống chế dịch bằng việc tiêu hủy và cách ly mầm bệnh, làm thiệt hại hơn 300 triệu đôla cho ngành công nghiệp [13]. Năm 1997, lần đầu tiên virus H5N1 lây nhiễm sang cho người ở HongKong làm 6 người thiệt mạng trong số 18 người nhiễm bệnh. Hầu hết những người bị bệnh này trước đó một tuần đều có sự tiếp xúc với gia cầm sống bán ở chợ. Để ngăn cản quá trình lan rộng của dịch, các nhà chức trách đã cho tiêu hủy 1,4 triệu gia cầm chỉ trong vòng ba ngày [65]. Theo các số liệu nghiên cứu từ năm 1959 đến năm 2006 cho thấy, tần suất dịch cúm A xảy ra ngày càng thường xuyên hơn, từ 3,09 năm xuống còn 0,83 năm một trận [3]. Đặc biệt, cuối năm 2003 đến năm 2005 dịch cúm H5N1 HPAI xảy ra ở Châu Á (Asia) và nhanh chóng lan rộng cho hơn 60 quốc gia trên toàn thế giới bao gồm Đông Nam Á (South-East Asia), Trung Đông (Middle East), Châu Âu (Europe) và Châu Phi (Africa). Có ba nguyên nhân chính cho sự lan truyền nhanh Tổng quan tài liệu 3 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam chóng này: sự di trú của các loài vịt, ngỗng, thiên nga trong tự nhiên; sự giao thương buôn bán gia cầm hay các loài chim hoang dã giữa các quốc gia [33, 65]. Theo FAO, tổng thiệt hại về kinh tế chỉ riêng vùng Đông Nam Á trong đợt dịch này ước tính khoảng 10 tỉ đôla [19]. Hình 1.1. Sự lan truyền của chủng H5N1 ở các quốc gia Châu Á, Châu Âu và Châu Phi vào cuối năm 2005 [33]. Từ tháng 11/2003 đến tháng 5/2009, theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới đã có 261 trường hợp tử vong trong số 424 ca dương tính với chủng virus cúm A độc lực cao H5N1 của 15 quốc gia: Azerbaijan, Bangladesh, Cambodia, China, Djibouti, Egypt, Indonesia, Iraq, Laos, Myanmar, Nigeria, Pakistan, Thailand, Turkey, và Việt Nam. Tỉ lệ tử vong trung bình là 60%. Việt Nam là một trong những nước chịu thiệt hại nặng nề nhất trong đợt dịch này trong vùng Đông Nam Á. Kể từ cuối năm 2003 đến nay (trừ năm 2006), năm nào Việt Nam cũng có người tử vong vì cúm gia cầm H5N1 với 56 trường hợp trong số 111 ca dương tính. Ngay từ đầu năm 2004 đã có 58 trên tổng số 64 tỉnh Tổng quan tài liệu 4 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam thành bị dịch cúm tấn công và phải tiêu hủy hơn 44 triệu gia cầm các loại, tổng thiệt hại kinh tế ước tính hơn 200 triệu đôla [19]. Hình 1.2. Các quốc gia có người tử vong do virus H5N1 từ năm 2003 đến tháng 5/2009. Điều này cho thấy cúm gia cầm luôn là mối đe dọa thường trực không chỉ cho ngành công nghiệp gia cầm mà còn đối với sức khỏe cộng đồng. Mối quan ngại lớn nhất hiện nay là liệu virus H5N1 này có thể nhiễm từ người sang người không? Những nghiên cứu hiện tại cho thấy chưa có bằng chứng rõ rệt nào để khẳng định điều này và cũng còn nhiều câu hỏi chưa trả lời được về việc virus H5N1 lây nhiễm cho người. Tuy nhiên, virus cúm H5N1 vẫn tiếp tục tiến hóa và lưu hành giữa các loài gia cầm tại rất nhiều quốc gia trên thế giới, vì vậy nguy cơ về một đại dịch cúm H5N1 khác vẫn luôn là mối đe dọa tiềm ẩn. Tổng quan tài liệu 5 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam Hình 1.3. Biểu đồ biểu diễn số ca tử vong do virus H5N1 theo từng năm tại Việt Nam. ( 1.2 Đại cương về virus cúm A 1.2.1 Phân loại và cách đọc tên Virus cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, bộ gene là RNA mạch đơn (-), và được chia thành 4 type chính: Virus cúm A, B, C và Thogovirus (đôi khi còn gọi là virus cúm D) dựa trên sự khác nhau của các kháng nguyên protein Nucleocapsid (NP) và Matrix (M) của chúng [34]. Trong đó, virus cúm A được phân chia thành các thứ type (subtype) dựa trên 2 kháng nguyên bề mặt glycoprotein của chúng là Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA), các thứ type này khác nhau khoảng từ 30% hay hơn trong trình tự axít amin [59]. Cho đến nay, có 16 kháng nguyên HA và 9 kháng nguyên NA đã được xác định. Sự kết hợp giữa các kháng nguyên HA và NA sẽ tạo ra các thứ type virus cúm A khác nhau [23]. Virus cúm A lây nhiễm cho gia cầm được chia thành hai nhóm gồm: nhóm virus cúm A độc lực cao (highly pathogenic avian Influenza – HPAI) với mức độ độc tính gây tử vong trên gia cầm gần như 100%, thường do các thứ type H5 và H7 gây ra, nhưng không phải tất cả các thứ type H5 và H7 đều độc, và nhóm virus cúm A độc lực thấp (low pathogenic avian Influenza – LPAI) với mức độ độc tính thấp hơn hoặc đôi khi không gây triệu chứng gì trên gia cầm [3]. Tổng quan tài liệu 6 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam — Hệ thống danh mục (nomenclature system) của virus cúm bao gồm: Type virus/ vật chủ/ vị trí địa lý phân lập/ số chủng phân lập/ năm phân lập (thứ type HA và thứ type NA). Sự mô tả kháng nguyên Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) được đặt trong dấu ngoặc ( ). Ví dụ A/Swine/Iowa/15/30 (H1N1). Bằng cách này, nếu con người đóng vai trò vật chủ thì không ghi, như A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) [74]. 1.2.2 Đặc điểm sinh thái virus cúm A Thời gian tồn tại trong môi trường nước của các chủng virus gia cầm khác nhau. Virus cúm A độc lực thấp (LPAI) trong phân các loài thủy cầm hay chim hoang dã có thể tồn tại ít nhất 30 ngày ở 40C và 7 ngày ở 200C trong môi trường nước mà vẫn còn khả năng lây nhiễm. Virus cúm A độc lực cao (HPAI) H5 và H7 có khả năng tồn tại trong môi trường nước rất lâu dài, ngay trong cùng thứ type thời gian tồn tại cũng khác nhau. Một số chủng virus cúm gia cầm hoang dại H7 vẫn còn khả năng lây nhiễm sau hơn 190 ngày tồn tại trong nước 170C (pH = 7,4) như A/Mallard/MN/182761/98 (H7N3) hay A/Laughing Gull/DE/AI00-2455 (H7N3) với nồng độ TCID50 virus ban đầu là 106. Cũng ở điều kiện tương tự, chủng A/Duckmeat/Anyang/01 (H5N1) tồn tại hơn 90 ngày, còn chủng A/Whooper Swan/Mongolia/244/05 (H5N1) tồn tại hơn 150 ngày [10]. 1.2.3 Hình thái - cấu trúc hạt virus cúm A Thành phần cấu trúc của virus cúm A gồm có: 1% RNA, 70% protein, 20% lipid, và 5 - 8% carbohydrate. Vỏ lipid của virus cúm được cấu trúc từ màng sinh chất (plasma membrane) của tế bào chủ (host cell). Các virion (hạt virus hoàn chỉnh, dạng virus nghỉ ở ngoài tế bào chủ) cúm A phát triển trong trứng gà và trong các mô tế bào nuôi cấy có hình dạng khá đều đặn khi chụp dưới kính hiển vi, với đường kính từ 80 - 120 nm. Phần lớn các chủng virus cúm A phân lập từ gia cầm có hình cầu, trong khi từ các loài khác thì hình dạng virus cũng rất khác nhau về đường kính, độ dài, và thậm chí có hình dáng rất lạ [74]. Điểm nổi bật nhất của virion cúm A là có khoảng 500 mấu gai (spikes) nhô ra Tổng quan tài liệu 7 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam xung quanh ngoài màng lipid, dài 10 - 14 nm, đường kính 4 - 6 nm. Các mấu gai này có 2 loại: mấu gai hình que (rod-shaped) của HA và mấu gai hình nấm (mushroom-shaped) của NA. Tỉ lệ giữa HA và NA trong 1 virion thường khoảng 4:1 đến 5:1. Bên dưới lớp màng đôi lipid là các protein nền M1 (matrix protein) và chúng liên kết với lõi ribonucleprotein của virion, M1 là một trong những protein phong phú nhất. Ngoài ra, virus cúm A còn mã hóa cho một protein xuyên màng M2, đóng vai trò như kênh ion kiểm soát các proton (ion H+), các bằng chứng sinh hóa cho thấy chỉ có một vài bản sao M2 trong virion [77]. Hình 1.4. Cấu trúc hạt virus cúm A. (A) Virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử. (B) Sự phân bố các protein trong virus cúm A [74]. Bên trong virus là các phức hợp ribonucleoprotein (RNP) với nhiều kích thước khác nhau, phụ thuộc vào đoạn vRNA (viral RNA) liên kết, loại lớn dài từ 90 - 110 nm, loại trung bình từ 60 - 90 nm và loại nhỏ từ 30 - 50 nm. Virus cúm A có 8 đoạn RNA mã hóa cho các protein: PB2, PB1, PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M1 và M2, NS1 và NS2. Các sợi RNP thường có các vòng xoắn ở một đầu, điều này là do chúng tự gấp lại sau đó tiếp tục cuộn xoắn để hình thành sợi đôi xoắn. Mỗi RNP gồm có bốn protein NP, PB1, PB2, PA và một sợi RNA, trong đó protein NP có số lượng nhiều nhất và ba protein còn lại đóng vai trò là phức hợp RNA polymerase [35]. 1.2.4 Đặc điểm vật chất di truyền và chức năng Tổng quan tài liệu 8 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam Bộ gene virus cúm A gồm 8 đoạn RNA mạch đơn, xoắn âm (single-stranded RNA (-)), mã hoá cho 11 protein của virus: - RNA1 mã hóa Polymerase B2 protein (PB2) - RNA2 mã hóa Polymerase B1 protein (PB1) và PB1-F2 - RNA3 mã hóa Polymerase A protein (PA) - RNA4 mã hóa Haemagglutinin (HA hay H) - RNA5 mã hóa Nucleocapsid protein (NP) - RNA6 mã hóa Neuraminidase (NA hay N) - RNA7 mã hóa Matrix protein (M): gồm M1 và M2 - RNA8 mã hóa Non-structural protein (NS): gồm NS1 và NS2 Mỗi đoạn RNA được bao xung quanh bởi protein NP (nucleoprotein) tạo thành cấu trúc RNP. RNP kết hợp với phức hợp gồm 3 loại polymerase protein là PB1, PB2, PA chịu trách nhiệm cho sự phiên mã và sao chép RNA của virus. Trình tự hai đầu 5’ và 3’ của mỗi đoạn RNA đều được bảo tồn ở mức độ cao. Polymerase B2 Protein (PB2) Polymerase PB2 được mã hoá bởi đoạn RNA 1, trọng lượng phân tử 85.700. Protein này là thành viên của phức hợp có hoạt tính RNA polymerase phụ thuộc RNA (RNA – dependent RNA polymerase). Protein PB2 nhận diện và liên kết cấu trúc mũ chụp (m7GpppXm) đầu 5’ của các mRNA của tế bào chủ và sử dụng chúng như các mồi cho quá trình phiên mã mRNA của virus [72]. Polymerase B1 Protein (PB1) Polymerase PB1 được mã hoá bởi đoạn RNA 2, trọng lượng phân tử 86.500. Nó thực hiện đồng thời nhiều chức năng, vừa có chức năng như một endonuclease vừa có chức năng như polymerase kéo dài trong quá trình tổng hợp mRNA virus cũng như trong tổng hợp các RNA khuôn (cRNA) và vRNA. Ngoài ra, trên khung đọc mở (Open Reading Frame) của PB1 còn mã hóa một protein nhỏ, ngắn gồm 87 axít amin là PB1-F2. Trong đa số trường hợp tế bào các loài bị nhiễm, PB1-F2 có mặt phần lớn trong ti thể (chiếm 50%), còn lại chúng có thể phân bố trong nhân hoặc trong bào tương. PB1-F2 thúc đẩy quá trình chết của tế bào nhiễm (apoptosis) bằng cách tiêu diệt các đại thực bào phổi, đồng thời hỗ trợ cho các vi khuẩn gây Tổng quan tài liệu 9 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam bệnh khác xâm nhiễm, từ đó góp phần vào độc tính của virus cúm A [14, 24]. Polymerase A Protein (PA) Polymerase PA được mã hoá bởi đoạn RNA 3, trọng lượng phân tử 84.200. Protein này là thành viên của phức hợp RNA polymerase phụ thuộc RNA. Tuy nhiên, chức năng của protein PA vẫn chưa được biết rõ, nhưng cũng đã có những bằng chứng cho thấy PA có hoạt tính như protein kinase hay protein tháo xoắn [72]. PB1 và PB2 được tìm thấy trong quá trình tổng hợp mRNA và PA được tìm thấy trong quá trình tổng hợp RNA của virus. Ba protein này tạo thành một phức hợp enzyme chịu trách nhiệm phiên mã, sao chép, có hoạt tính endonuclease. Sau khi được tổng hợp trong tế bào chất, chúng được vận chuyển vào nhân. Hemagglutinin (HA) HA được mã hóa bởi đoạn RNA 4, là protein xuyên màng và là kháng nguyên bề mặt chủ yếu của virus cúm. Protein HA giúp virus gắn vào các thụ thể (receptor) chứa axít sialic của tế bào chủ và giúp sự dung hợp giữa vỏ hạt virus và màng tế bào chủ. HA được tổng hợp trên màng liên kết ribosome, sau đó được chuyển tới khoang lưới nội chất (ER - endoplasmic reticulum) ở dạng sợi polypeptide đơn HA0 (trọng lượng phân tử khoảng 76.000). Tùy thuộc vào chủng virus, tế bào chủ, và điều kiện sinh trưởng, HA có thể tồn tại ở dạng tiền thân HA0 hoặc dạng phân cắt gồm hai chuỗi HA1 và HA2 liên kết với nhau bằng cầu nối disulfide. Sự phân cắt HA0 này là điều kiện tiên quyết cho quá trình xâm nhiễm của virus cúm A, vì vậy đây là một tiêu chuẩn cho sự xác định độc tính của virus trong các trận dịch [62]. Nucleocapsid Protein (NP) Phân đoạn RNA 5 mã hóa cho protein NP. NP là protein cấu trúc chính, tương tác với các đoạn RNA để hình thành RNP (ribonucleoprotein). NP cũng là một trong những kháng nguyên chính để phân biệt các type A, B, C. Sau khi được tổng hợp trong tế bào chất, NP được chuyển vào nhân. Neuraminidase (NA) Neuraminidase (NA) là glycoprotein bề mặt của virus cúm có hình nấm, là một trong những kháng nguyên quan trọng của virus cúm [58], do đoạn RNA 6 mã hóa. NA có chức năng chủ yếu là thúc đẩy sự giải phóng virus ra khỏi tế bào, bằng cách Tổng quan tài liệu 10 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam loại bỏ axít sialic trên protein HA và NA mới được tổng hợp. Nếu không có NA, các hạt virus không giải phóng được và kết lại thành khối trên bề mặt tế bào chủ [4]. Bảng 1.1. Các đoạn RNA virus cúm A và chức năng mã hóa [34] *Các số liệu này có tính tương đối; **Số lượng phân tử trong một virion. Matrix protein (M) Đoạn RNA số 7 mã hóa cho hai protein M1 và M2. M1 là protein nền, nằm sát dưới lớp vỏ lipid của virus, giúp cho hạt virus cứng chắc. Ở giai đoạn cuối của quá trình xâm nhiễm, protein M1 tương tác với các RNP mới được lắp ráp bên trong nhân, giúp cho các RNP bền vững. M2 là protein xuyên màng, hoạt động như một kênh ion kiểm soát các ion H+, hỗ trợ cho sự cởi vỏ của virus trong các endosome của tế bào bị nhiễm [72]. Non-structural protein (NS) Đoạn RNA số 8 mã hóa cho hai protein NS1 và NS2. NS1 có nhiều trong các tế bào bị nhiễm, nhưng lại không có trong các hạt virion. NS1 là protein đa chức năng, STT Dài (Nu)* Protein Dài (aa)* Số lượng** Chức năng 1 2341 PB2 759 30-60 Thành phần của phức hệ enzyme phiên mã, có vai trò nhận diện mũ chụp m7GpppXmNm của RNA tế bào chủ. 2341 PB1 757 30-60 Thành phần của phức hệ enzyme phiên mã, có vai trò xúc tác bổ sung nucleotide. 2 303 PB1-F2 101 - Protein tiền apoptotic, tương tác với bộ máy đáp ứng miễn dịch của vật chủ, số lượng thay đổi. 3 2233 PA 716 30-60 Thành phần của phức hệ enzyme sao chép và phiên mã, chức năng chưa được biết. 4 1778 HA 566 500 Glycoprotein bề mặt, có vai trò gắn kết thụ thể, dung hợp protein và là yếu tố chính quyết định kháng nguyên. 5 1565 NP 498 1000 Kết hợp với các sợi RNA virus hình thành cuộn ribonucleoprotein; khởi động quá trình tổng hợp RNA virus. 6 1413 NA 454 100 Glycoprotein bề mặt; phân tách liên kết HA-axít sialic và phóng thích virus; quyết định kháng nguyên. 1027 M1 252 3000 Protein cấu trúc chính của virus; tương tác với các RNP virus và thúc đẩy quá trình lắp ráp của virion. 7 M2 97 20-60 Protein màng; hoạt động như kênh ion cần thiết cho sự cởi vỏ của virus; bị ức chế bởi amantadine. 890 NS1 230 - Protein không cấu trúc trong tế bào chất và nhân, số lượng phong phú; ức chế sự phân tách và bổ sung đầu 3’ của tiền mRNA tế bào. 8 NS2 121 130-200 Protein không cấu trúc, có trong nhân và tế bào chất; có vai trò vận chuyển các RNP virus ra khỏi nhân. Tổng quan tài liệu 11 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam chúng ngăn chặn quá trình tự ghép nối các tiền mRNA (pre-mRNA) mới tổng hợp [22], giúp virus kháng Interferon, vận chuyển protein từ nhân ra tế bào chất [37]. Protein NS2 giúp vận chuyển các RNP ra khỏi nhân [49]. 1.2.5 Kháng nguyên Neuraminidase (NA) 1.2.5.1 Đặc điểm cấu trúc và chức năng Đoạn RNA số 6 có 1413 nucleotide, mã hóa chuỗi polypeptide NA dài khoảng 453 axít amin [34]. Mỗi homotetramer NA (hiểu ngắn gọn là gene NA) được chia thành bốn vùng chính [26]: - Vùng đuôi thuộc tế bào chất (cytoplasmic tail) của virus, gần đầu Nitơ gồm 6 axít amin N-Met-Asn-Pro-Asn-Gly-Lys (MNPNQK) được bảo tồn giữa các thứ type của virus cúm A [34], có vai trò trong sự hợp nhất của NA trong quá trình lắp ráp tạo thành hạt virion. Gốc Proline (Pro) giúp duy trì hình dáng thích hợp của cytoplasmic tail dọc theo màng tế bào (vật chủ) để tương tác với các thành phần bên trong hạt virion đang nẩy chồi [9]. Vùng đuôi này không hoàn toàn đòi hỏi trong quá trình sao chép của virus, nhưng nếu không có nó và vùng đuôi của HA, sẽ ảnh hưởng đến hình dạng hạt virus, tạo ra những hạt virus có các sợi nhỏ kỳ lạ (bizarre filamentous) [6], làm cho hạt virus nhỏ lại khoảng 10 lần [30, 47], và sự hợp nhất của các NA trong hạt virion giảm 86% [40]. - Vùng trans-membrane (TM - Vùng xuyên màng) gồm 29 axít amin bảo tồn cao trong type cúm A, với chủng A/WSN/33 (H1N1) trình tự 29 axít amin này là IITIGSICMVVGIISLILQIGNIISIWIS, đóng vai trò “tín hiệu chuyển vị” (translocation signal) và như một “mỏ neo” liên kết với màng (anchor domain) [6, 15], vùng này của các thứ type của virus cúm A và B có tính chất chung là kị nước chứ không tương đồng trong trình tự. Trong vùng cystoplasmic tail và transmembrane các axít amin 5-13 (QKIITIGSI) không cần thiết cho chức năng NA. Do khi thay thế 2 axít amin ở vị trí 5,6 (QK) bằng Alanine (A) (NA2A5), tương tự cho các vị trí 7,8,9 (NA3A7), 10,11,12,13 (NA4A10), thì virus vẫn phát triển bình thường gần như type hoang dại (Hình 1.5). Nhưng nếu thay 5 Alanine cho vị trí 27,28,29,30,31 hay 5 Alanine cho vị trí 31,32,33,34,35 sẽ ảnh hưởng Tổng quan tài liệu 12 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam mạnh đến sự sinh sản virus, làm giảm 50 lần (nếu có trypsin) và 250 lần (nếu không có trypsin) khả năng sinh sản của virus [6]. Hình 1.5. Thí nghiệm thay các axít amin trên vùng TM của gene N1 bằng Alanine [6]. - Vùng stalk (cuống thân) có chiều dài thay đổi trong các type virus cúm cũng như trong các thứ type, vùng này có thể dài từ 0 tới 52 axít amin bắt đầu từ khoảng axít amin ở vị trí 40 phía đầu Nitơ (N) [11, 58], chẳng hạn chủng A/WSN/33 có 24 axít amin, còn chủng A/Brevig Mission/1/18 (H1N1) có vùng thân đầy đủ chứa 1 gốc Cys và 4 vị trí Glycosyl [58]. Mặc dù chiều dài vùng stalk thay đổi nhiều, nhưng giữa các thứ type, chúng vẫn có một số tính chất chung như chứa ít nhất 1 gốc Cys và 1 điểm Glycosyl. Trong trứng gà vùng này thực sự cần thiết trong việc sao chép của virus, vùng stalk càng dài quá trình sao chép của virus càng mạnh, còn trong nuôi cấy tế bào (MDBK) có hay không có vùng stalk cũng không ảnh hưởng nhiều cho việc sao chép [11]. Chiều dài của vùng stalk ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme, càng dài hoạt tính enzyme càng mạnh. Khi mất vùng này hoạt tính enzyme giảm 6 lần so với NA có vùng stalk nguyên vẹn [67], thậm chí mất khả năng giải phóng virus [11]. Hình 1.6. Trình tự axít amin gene N1 của chủng WSN trong thí nghiệm gây đột biến vùng stalk. Vùng stalk được in nghiêng, vùng trasmembrane là CHỮ ĐẬM IN HOA. Phần axít amin thêm vào của chủng A/Tokyo/67 (H2N2) được gạch chân và của chủng A/Tern/Australia/G70C/75 (H11N9) được gạch chân bằng gạch đôi [11]. Tổng quan tài liệu 13 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam Năm 1993, Castrucci và Kawaoka đã thí nghiệm trên chủng A/WSN/33 (HlNl) với gene N1 bị mất một phần hay toàn bộ vùng thân và khi thêm một vài axít amin vào vùng stalk hoàn chỉnh. Cụ thể là trong thí nghiệm cắt bỏ vùng