Luận văn Thiết kế và nghiên cứu hệ thống Bioreactor cho cây đứa cayenne

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** NGUYỄN BẰNG PHI THIẾT KẾ VÀ NGHIÊN CƢ́U HÊ ̣THỐNG BIOREACTOR CHO CÂY DƢ́A CAYENNE Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh -2006- 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** THIẾT KẾ VÀ NGHIÊN CƢ́U HÊ ̣THỐNG BIOREACTOR CHO CÂY DƢ́A CAYENNE Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TRẦN THỊ DUNG NGUYỄN BẰNG PHI NGUYỄN VĂN HÙNG Thành phố Hồ Chí Minh -2006- 3 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ************ DESIGN AND RESEARCH BIOREACTOR SYSTEM FOR CAYENNE PINEAPPLE Graduation thesis Major: Biotechnology Professor Student TRAN THI DUNG NGUYỄN BẰNG PHI NGUYỄN VĂN HÙNG Ho Chi Minh City -2006- 4 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THIẾT KẾ VÀ NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG BIOREACTOR CHO CÂY DỨA CAYENNE NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2002 – 2006 SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN BẰNG PHI Thành phố Hồ Chí Minh 2006 5 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC THIẾT KẾ VÀ NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG BIOREACTOR CHO CÂY DỨA CAYENNE GVHD: TS. TRẦN THỊ DUNG SVTH: NGUYỄN BẰNG PHI TS. NGUYỄN VĂN HÙNG MSSV: 02126078 Thành phố Hồ Chí Minh 2006 6 LỜI CẢM TẠ Để hoàn tất cuốn luận văn này tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giảng dạy, góp ý, giúp đỡ của các thầy cô, bạn bè và gia đình. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: -Ba mẹ đã dày công nuôi dưỡng, dạy dỗ con -Các Thầy cô Bộ môn Công Nghệ Sinh Học- trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. - TS.TRẦN THỊ DUNG, Trưởng Bộ môn Công Nghệ Sinh Học- Trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. - TS.NGUYỄN VĂN HÙNG, Trưởng Bộ môn điều khiển tự động khoa Cơ khí Trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh -KS.NGÔ THANH HOÀNG, Giảng viên khoa Cơ khí- Trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh -Các kỹ sư ở Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học- Trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. -Tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 28 Tháng 08 năm 2006 Nguyễn Bằng Phi 7 TÓM TẮT NGUYỄN BẰNG PHI, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2006. “THIẾT KẾ VÀ NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG BIOREACTOR CHO CÂY DỨA CAYENNE” Hội đồng hướng dẫn:  TS. Trần Thị Dung  TS.Nguyễn Văn Hùng Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ sinh học-Trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM trên đối tượng cây dứa Cayenne in vitro. Tiến hành nhân chồi dứa Cayenne bằng bioreactor. Mẫu cấy là chồi dứa 3 tháng tuổi của phòng Nuôi cấy mô thực vật, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học- Đại Học Nông Lâm tp.HCM. Chồi dứa nuôi cấy 6 tuần bằng bioreactor. Quá trình thực hiện bao gồm 2 giai đoạn : +Giai đoạn 1: Thiết kế hệ thống bioreactor sục khí tự tạo và bioreactor ngâm chìm định kỳ tự tạo. +Giai đoạn 2: Nghiên cứu hệ thống bioreactor trên qua 2 thí nghiệm : Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố thể tích dinh dưỡng trong hệ thống bioreactor sục khí đối với hệ số nhân chồi Thí nghiệm 2: Thay đổi yếu tố thời gian đối vơi hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ(Temporary immersion bioreactor) Những kết quả thu được : +Bioreactor sau khi thiết kế đã hoạt động tốt. +Hình thức nuôi cấy cây dứa bằng bioreactor sục khí là không phù hợp cho sự phát triển của cây dứa. +Thể tích môi trường 1,5L cho kết quả khả quan hơn so với thể tích 1L khi nuôi cấy bằng bioreactor sục khí liên tục. +Bioreactor sục khí liên tục giúp cho cây dứa phát triển tốt hơn so với bioreactor sục khí gián đoạn. 8 +Bioreactor ngâm chìm định kỳ là loại bioreactor phù hợp cho sự phát triển của cây dứa. +Bioreactor ngâm chìm định kỳ với thời gian ngâm chìm định kỳ 10’/2h cho hiệu quả nhân chồi dứa tốt nhất. 9 MỤC LỤC Trang Tóm tắt luận văn ......................................................................................................... 7 Danh sách các bảng .................................................................................................... 11 Danh sách các hình ..................................................................................................... 12 Danh mục viết tắt ........................................................................................................ 13 Phần 1 : Giới thiệu 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 14 1.2. Mục đích-yêu cầu ................................................................................................. 15 1.3. Giới hạn đề tài ...................................................................................................... 15 Phần 2 : Tổng quan tài liệu 2.1. Đặc điểm thực vật học và sinh thái cây dứa ........................................................ 16 2.2.Phân loại .............................................................................................................. 17 2.3. Các nhóm dứa chính và các giống dứa phổ biến ở Việt Nam ............................. 18 2.4. Tình hình sản xuất và sản lượng dứa ................................................................... 20 2.5. Giới thiệu về nuôi cấy mô ................................................................................... 22 2.6. Các yếu tố ảnh hưởng trong nuôi cấy invitro ...................................................... 25 2.7. Tổng quan về bioreactor ...................................................................................... 28 2.8. Giới thiệu các phương pháp nhân chồi cây dứa .................................................. 34 2.9. Các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình nuôi cấy ngâm chìm điṇh kỳ .................. 38 2.10. Ảnh hưởng hệ thống ngâm chìm định kỳ đến chất lượng cây trồng ................. 40 2.11. Ảnh hưởng của hệ thống ngập chìm đến chi phí sản xuất ................................. 44 2.12. Các nghiên cứu và ứng dụng bioreactor trên đối tượng cây dứa ...................... 44 Phần 3 : Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 3.1. Thời gian và địa điểm .......................................................................................... 45 3.2 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 45 3.3 Vật liệu ................................................................................................................. 45 3.4. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 45 3.4.1Thiết kế hệ thống tự động cho bioreactor sục khí tự tạo và ngâm chìm định kỳ (TIB) ..................................................................................................... 45 10 3.4.2 Tiến hành thí nghiệm ......................................................................................... 48 3.5. Xử lý số liệu ........................................................................................................ 50 Phần 4 : Kết quả và thảo luận 4.1 Thiết kế hệ thống tự động cho bioreactor sục khí tự tạo và ngâm chìm định kỳ (TIB) ........................................................................................................................... 51 4.1.1Thiết kế hệ thống tự động bioreactor sục khí tự tạo ........................................... 51 4.1.2 Thiết kế hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ tự động ................................ 51 4.2 Kết quả thí nghiệm ............................................................................................... 53 4.2.1 Thí nghiệm 1 Khảo sát hiệu quả nhân chồi dứa bằng bioreactor sục khí liên tục. .......................................................................................... 53 4.2.2 Thí nghiệm 2 : Ảnh hưởng của thời gian ngâm chìm định kỳ đến khả năng nhân chồi dứa bằngTIB ............................................................................... 55 Phần 5 : Kết luận và đề nghị 5.1. Kết luận................................................................................................................ 60 5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 60 Tài liệu tham khảo ...................................................................................................... 61 Phần phụ lục ............................................................................................................... 63 11 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 3.1 Các nghiệm thức của thí nghiệm 1a ........................................................... 45 Bảng 3.2 Các nghiệm thức của thí nghiệm 1b ........................................................... 45 Bảng 3.3 Các nghiệm thức của thí nghiệm 2 ............................................................. 45 Bảng 4.1- Các chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm 1a .................................................... 49 Bảng 4.2- Ảnh hưởng của yếu tố thể tích đến hệ số nhân chồi của cây dứa Cayenne trong bình bioreactor sục khí liên tục ........................................................................ 49 Bảng 4.3- Các chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm 1b .................................................... 51 Bảng4.4- Ảnh hưởng của yếu tố thể tích đến hệ số nhân chồi của cây dứa Cayenne trong bình bioreactor sục khí gián đoạn .................................................................... 51 Bảng 4.5- Các chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm 2 ...................................................... 53 Bảng 4.6- Ảnh hưởng của yếu tố thời gian ngâm chìm đến hệ số nhân chồi của cây dứa Cayenne trong bình bioreactor TIB .............................................................. 54 12 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 2.1- Cấu trúc bioreactor ............................................................................ 26 Hình 3.1- Sơ đồ lắp ráp hệ thống bioreactor sục khí hình cầu kiểu Hàn Quốc .... 42 Hình 3.2-Sơ đồ lắp ráp hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ.......................... 43 Hình 4.1-Bioreactor sục khí .................................................................................. 47 Hình 4.2- Sơ đồ mạch điện thiết kế cho TIB tự động ........................................... 47 Hình 4.3-Hộp điều khiển tự động TIB tự chế ....................................................... 48 Hình 4.4-Chồi dứa sau 4 tuần nuôi cấy trong bình bioreactor sục khí liên tục và sục khí gián đoạn .............................................................................................. 50 Hình 4.5- Chồi dứa sau 4 tuần nuôi cấy trong bình TIB 10’/2h ........................... 53 Hình 4.6-Biểu đồ hệ số nhân chồi ......................................................................... 55 13 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BAP : 6-benzylaminopurine GA3 : Gibberellic acid IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole-3-butyric acid NAA : -Naphthaleneacetic acid TDZ : Thidiazuron MS : Môi trường Murashige và Skoog, 1962 TIB : Temporary immersion bioreactor 14 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nước ta thuộc vùng nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm khá phù hợp cho nhiều loại cây trồng khác nhau phát triển. Dứa là cây ăn quả nhiệt đới, là một trong ba loại cây ăn quả hàng đầu của nước ta (chuối-dứa-cam quýt) dùng để ăn tươi, đặc biệt có thể chế biến xuất khẩu. Chính vì vậy, cây dứa được trồng ở nhiều vùng trong nước và với điều kiện thích hợp nhiệt độ và ẩm độ cao thì cây dứa có thể sinh trưởng quanh năm. Do là loại cây không kén đất, dứa có thể trồng ở vùng gò đồi, đất dốc (200 trở xuống), đất xấu nghèo dinh dưỡng. Vì vậy chúng ta có thể nói cây dứa giúp con người tận dụng quỹ đất để có thêm sản phẩm và mang lại hiệu quả kinh tế khi thu hoạch. Dứa còn dùng để chiết xuất enzyme bromelin dùng trong công nghiệp thuộc da, vật liệu làm film. Quả dứa dùng để chế biến đồ hộp, làm rượu, giấm, nước ép, nước cô đặc, làm bột dứa dùng cho giải khát….. Lá dứa dùng để lấy sợi (2-2.5% cellulose). Chính vì khả năng ứng dụng khá lớn của cây dứa mà cây dứa ngày càng chiếm vị thế quan trọng được thể hiện qua năm 1993 thì kim ngạch xuất khẩu chỉ đạt 658 triệu đô la Mỹ và cho đến năm 1998 thì đã đạt 3450 triệu đô la Mỹ. Để phục vụ nhu cầu ngày càng cao của con người thì việc tận dụng lại chồi con của cây dứa từ cây mẹ không mang lại hiệu quả kinh tế. Do những cây này thường cho quả nhỏ dần trong các mùa vụ sau. Việc cung ứng đủ giống dứa đạt chất lượng và sạch bệnh là vấn đề cấp thiết. Nhân giống vô tính in vitro có thể đáp ứng được những yêu cầu về chất lượng đồng đều với số lượng lớn. Tuy nhiên việc nhân chồi dứa bằng phương pháp nuôi cấy mô vi nhân giống tốn nhiều chi phí về lao động, phải cấy từng chai một trong điều kiện vô trùng nghiêm ngặt, và phải cấy chuyền sau khoảng 4-6 tuần do cạn kiệt môi trường dinh dưỡng. Việc sản xuất giống ở quy mô công nghiệp khó có thể thực hiện một cách tự động hóa được. Từ những thực trạng đó, năm 1981 Takayama lần đầu tiên ứng dụng bioreactor để nhân giống với số lượng lớn trên đối tượng cây Begonia. Qua quá trình phát triển, nhiều kiểu bioreactor khác nhau ra đời như : bioreactor sục khí, bioreactor khuấy, bioreactor ngâm chìm định kỳ....Trong đó, bioreactor ngâm chìm định kỳ trong môi trường lỏng đem lại hiệu quả cao hơn phương pháp nhân giống thông thường trên 15 môi trường thạch và phương pháp nuôi cấy trong dịch lỏng có khuấy và sục khí liên tục, đồng thời cây con khi ra vườn cũng tốt hơn so với cây con nuôi ở môi trường thạch. Hiện nay ở Việt Nam những nghiên cứu về bioreactor còn rất ít, đặc biệt là trên đối tượng cây dứa. Do vậy, đề tài : “ THIẾT KẾ VÀ NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG BIOREACTOR CHO CÂY DỨA CAYENNE” được tiến hành tại Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Đại Học Nông Lâm Tp.HCM. 1.2 Mục đích - Yêu cầu Mục đích Xác định được cấu trúc, cách vận hành và mô hình của hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ trong môi trường lỏng (temporary immersion bioreactor (TIB)) cho cây dứa. So sánh hiệu quả nhân chồi giữa 2 kiểu bioreactor : ngâm chìm định kỳ và sục khí. Xác định thời gian ngâm chìm định kỳ trong TIB thích hợp để cho hiệu quả nhân chồi cây dứa tốt nhất. Yêu cầu Nắm được cấu trúc và cách vận hành hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ trong môi trường lỏng(TIB) Đánh giá hiệu quả nhân chồi của hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ(TIB) 1.3 Giới hạn đề tài : - Do giới hạn về thời gian và điều kiện trang thiết bị thí nghiệm nên đề tài chỉ tiến hành quá trình nhân chồi trong phòng thí nghiệm, chưa thực hiện thí nghiệm ngoài đồng - Do giới hạn về kinh phí nên hệ thống điều khiển chưa kiểm soát các yếu tố pH, dinh dưỡng, ánh sáng ... trong quá trình nuôi cấy một cách tự động. 16 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm thực vật học và sinh thái cây dứa  Đặc điểm thực vật học Dứa là cây thân thảo lâu năm, thuộc lớp đơn tử diệp. Sau khi thu hoạch quả các mầm nách ở thân tiếp tục phát triển và hình thành một cây mới giống như cây trước; quả thứ hai thường bé hơn quả trước. Cây dứa trưởng thành cao đến 1 m và rộng 0,5 m trong khi cây dứa Smooth Cayenne trưởng thành cao 1,5 m và có đường kính từ 1,3 – 1,5 m. Đây là giống dứa được trồng nhiều nhất trên thế giới. Hoa Hoa gồm có 3 lá đài, 3 cánh hoa, 6 nhị đực xếp thành 2 vòng tròn, 1 nhị cái có 3 tâm bì và bầu hạ. Cánh hoa màu xanh, đỏ tía, gốc có màu trắng nhạt và trên mặt cánh hoa có những vảy. Tràng hoa dạng ống dài hơi loe ở phía đầu, ở giữa lồi lên 3 núm nhụy tím mờ của vòi nhụy. Hoa tự bất thụ (self-sterile) và phát triển quả không hạt; thụ phấn nhờ gió không xảy ra và sinh sản hữu tính hiếm thấy trong tự nhiên. Nhân giống vô tính là hình thức sinh sản tiêu biểu sử dụng chồi bao gồm chồi đỉnh, chồi bên và chồi rễ. Quả Quả dứa thuộc loại quả tụ do 100 – 200 quả nhỏ hợp lại. Các giống khác nhau thì hình dạng quả và mắt quả cũng khác nhau. Bộ phận ăn được của dứa là do trục của chùm hoa và lá bắc phát triển nên. Sau khi hoa tàn thì quả bắt đầu phát triển. Hạt Hạt dứa nhỏ, màu tím đen, có vỏ và nội nhủ rất cứng, tỉ lệ nảy mầm thấp và bất thường nếu không qua tiền xử lí. Mỗi quả con chỉ có vài hạt. Dứa thường không hạt nếu để thụ phấn tự do. Hạt dứa thường do thụ phấn nhân tạo và được sử dụng trong các chương trình lai tạo giống mới. Thân Thân cây dứa chia làm 2 phần: một phần trên mặt đất và một phần dưới mặt đất. Phần ở trên thường bị các lá che kín nên khó nhìn thấy. Khi cây đã phát triển đến mức độ nhất định, có thể dùng các mầm ngủ trên các đốt để nhân giống. Lá 17 Lá dứa mọc trên thân cây theo hình xoắn ốc. Lá thường dày, không có cuống, hẹp ngang và dài. Bề mặt và lưng lá thường có một lớp phấn trắng hoặc một lớp sáp có tác dụng làm giảm độ bốc hơi nước ở lá. Các giống dứa thường có gai nhọn và cứng ở mép lá, nhưng cũng có giống lá không gai như Cayenne. Tùy theo giống, một cây dứa trưởng thành có khoảng 60 – 70 lá. Rễ Rễ dứa gồm rễ cái và rễ nhánh (mọc ra từ phôi hạt); rễ bất định (mọc ra từ mầm rễ trên các đốt của các loại chồi dứa trước khi đem trồng). Rễ dứa thuộc loại ăn nông, phần lớn do nhân giống bằng chồi nên mọc từ thân ra, rễ nhỏ và phân nhiều nhánh. Bộ rễ dứa thường tập trung ở tầng đất 10 – 26 cm và phát triển rộng đến 1 m. Sinh thái cây dứa Dứa là cây ăn quả nhiệt đới thích nhiệt độ cao, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng 28 – 320C, nhiệt độ giới hạn 15 – 400C. Nhiệt độ có ảnh hưởng đặc biệt quan trọng đến quá trình hình thành quả chín của quả do đó là yếu tố đầu tiên ảnh hưởng đến phẩm chất của quả. Yếu tố quan trọng không kém là chế độ nước bao gồm lượng mưa hàng năm và phân bố mưa. Dựa vào 2 chỉ tiêu trên, các vùng sinh thái thích hợp được thiết lập đảm bảo việc trồng dứa trên diện rộng đạt năng suất cao. Theo kinh nghiệm, lượng mưa thích hợp nhất cho dứa là 1000 – 1.500 mm. Tuy nhiên dứa vẫn phát triển tốt ở những vùng có lượng mưa thấp nhưng thuộc khí hậu đại dương, quanh năm ấm mát. Cây dứa ưa ánh sáng tán xạ hơn ánh sáng trực xạ. Lượng chiếu sáng thích hợp làm tăng năng suất và cải thiện phẩm chất hương vị quả. Độ chiếu sáng còn ảnh hưởng đến màu sắc quả. Dứa có bộ rễ tập trung ở lớp đất mặt do đó yêu cầu đất phải tơi xốp, thoáng, có kết cấu hạt, không có nước đọng vào mùa mưa. Về pH, các giống khác nhau có yêu cầu khác nhau. pH 5,6 – 6,0 có thể lên đến 7,5 đối với giống Cayenne; nhóm dứa Queen có thể sinh trưởng tốt trên đất phèn pH 4,0 trong khi giống Spanish (các giống dứa ta) thích nghi với pH từ 4,5 – 5,0. 2.2.Phân loại Dứa có tên khoa học là Ananas comosus (L.) Merr thuộc:  Phân lớp: Magnoliophyta 18  Lớp: Liliopsida  Bộ: Poales  Họ: Bromeliaceae  Giống: Ananas  Loài: A. comosus 2.3. Các nhóm dứa chính và các giống dứa phổ biến ở Việt Nam Các nhóm dứa chính Dứa gồm khoảng 50 giống và 2000 loài phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Mỹ . Các giống dứa đang được trồng trọt hiện nay được chia thành 3 nhóm: nhóm dứa Cayenne, nhóm dứa Queen (còn gọi là hoàng hậu) và nhóm Spanish (nhóm Tây Ban Nha). Nhóm Cayenne Lá dài, không có gai hoặc có một ít ở đầu chóp lá, dày, lòng máng lá sâu, có thể dài hơn 100 cm, hoa có màu xanh nhạt, hơi đỏ, quả có dạng hình trụ, mắt rất nông, quả nặng bình quân 1,5 – 2,0 kg rất phù hợp cho việc chế biến làm đồ hộp. Khi chưa chín quả màu xanh đen, sau đó chuyển dần và đến lúc chín quả có màu đỏ hơi pha da đồng. Cây đẻ yếu, trung bình chỉ cho 1 – 2 chồi một gốc trong một năm. Trong điều kiện chăm sóc kém có thể không có chồi cuốn