Luận văn Tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn aeromonashydrophilatại khoa thủy sản

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN NGUYỄN HÀ GIANG TIÊU CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU SINH HÓA CỦA VI KHUẨN Aeromonas hydrophila TẠI KHOA THỦY SẢN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2008 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu i LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ. Đặc biệt là các thầy cô thuộc bộ môn Sinh học và Bệnh học Thủy sản đã truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình em học tập và nghiên cứu tại trường. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh và chị Nguyễn Thị Tiên đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp. Đồng thời xin gởi lời cám ơn đến cô cố vấn Nguyễn Thị Thu Hằng cùng gia đình và các bạn lớp Bệnh học Thủy sản K30 đã động viên và hỗ trợ cho em trong thời gian học tập cũng như thực hiện đề tài tốt nghiệp. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu ii TÓM TẮT Đề tài được thực hiện nhằm tìm hiểu những chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa sai khác từ phương pháp truyền thống và sử dụng kít API 20E. Đồng thời cũng so sánh với những kết quả định danh của các nghiên cứu trước đây tại bộ môn và một số tài liệu nghiên cứu khác. Qua đó, đề xuất các chủng vi khuẩn A. hydrophila tham khảo cùng với phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa dùng để khi định danh vi khuẩn trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ. Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa được chọn để định danh dựa theo hệ thống phân loại của Baumann et al(1984). Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa được xác định dựa theo cẩm nang Cowan và Steel (Barrow và Feltham, 1993) và phương pháp của West và Colwell (1984). Tám chủng Aeromonas hydrophila (A. hydrophila) gồm CAF 2 (LMG 2844, chủng chuẩn), CAF 23, CAF25, CAF 131, CAF 132, CAF 133, CAF 134 và CAF 135 là các chủng đã được phân lập và định danh từ các đề tài trước và được trữ trong tủ âm 800C Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ. Các chủng A. hydrophila đều là vi khuẩn gram âm, hình que ngắn, di động, catalase dương tính, oxidase âm tính và có khuẩn lạc dạng tròn, nhẵn. Đặc điểm khác cơ bản ở các chủng A. ydrophila này với các nghiên cứu trước là các chủng đều cho kết quả oxidase âm tính. Phương pháp định danh truyền thống và API 20E thể hiện ở các chỉ tiêu giống nhau thì kết quả thể hiện giống nhau nhưng chỉ khác ở phản ứng của các chủng nghiên cứu đối với chỉ tiêu arginine và ornithine trong cùng điều kiện phòng thí nghiệm. Các chủng nghiên cứu qua kiểm tra bằng phương pháp PCR (Panangala et al, 2007) chưa cho sản phẩm đặc hiệu (không hiện vạch 209bp). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu iii MỤC LỤC Trang PHẦN 1 GIỚI THIỆU ..................................................................................................... 01 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................. 03 2.1 Bệnh trên động vật thủy sản ................................................................... 03 2.2 Bệnh do vi khuẩn trên động vật thủy sản ................................................ 04 2.3 Vi khuẩn Aeromonas sp. ........................................................................ 05 2.4 Phương pháp định danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila ....................... 08 PHẦN 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................... 11 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................ 11 3.2 Vật liệu........................................................................................................ 11 3.2.1 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................. 11 3.2.2 Thiết bị................................................................................................ 11 3.2.3 Hóa chất, thuốc thử và môi trường để kiểm tra các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn ....................... 11 3.2.4 Các hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR ........................................... 13 3.2.5 Các chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila ........................................ 13 3.3 Phương pháp nghiên cứu.............................................................................. 13 3.3.1 Định danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila bằng phương pháp truyền thống .................................................................. 14 3.3.2 Định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20E ............................................ 14 3.3.3 Phát hiện vi khuẩn bằng phương pháp PCR......................................... 16 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 19 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu iv 4.1 Kết quả ........................................................................................................ 19 4.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng vi khuẩn A. hydrophila xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống ......... 19 4.1.2 Kiểm tra kết quả định danh vi khuẩn A. hydrophila theo bộ kít API 20E ............................................................................ 23 4.1.3 Kết quả kiểm tra bằng phương pháp PCR ............................................ 25 4.2 Thảo luận .................................................................................................... 26 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .............................................................................. 29 5.1 Kết luận....................................................................................................... 29 5.2 Đề xuất ........................................................................................................ 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 30 PHỤ LỤC ......................................................................................................... 35 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu v DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 3.1: Các nguồn vi khuẩn .........................................................................13 Bảng 3.2: Bảng đọc kết quả bộ kít API 20E....................................................16 Bảng 3.3: Thành phần tham gia phản ứng PCR ...............................................17 Bảng 4.1: Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá của chủng vi khuẩn chuẩn và 7 chủng tham khảo .............................................................19 Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra bằng bộ kít API 20E chủng vi khuẩn chuẩn và 7 chủng tham khảo .......................................................................24 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu vi DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 3.1 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR theo quy trình Panangala et al (2007) có chỉnh sửa .................................... 18 Hình 4.1 Hình dạng A. hydrophila (100X)......................................................... 21 Hình 4.2 A. hydrophila trên môi trường TSA................................................... 21 Hình 4.3 A. hydrophila trên môi trường Aeromonas agar................................... 22 Hình 4.4 Phản ứng citrate (+) ............................................................................ 22 Hình 4.5 Phản ứng VP (+) ................................................................................. 23 Hình 4.6 Phản ứng indole (+) ............................................................................ 23 Hình 4.7 Kết quả định danh API 20E của dòng CAF2 (a) và dòng CAF25 (b)... 25 Hình 4.8 Kết quả điện di 5 chủng A. hydrophila ................................................ 26 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Trang 1 PHẦN 1 GIỚI THIỆU Nghề nuôi thủy sản trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng đang phát triển rất nhanh. Ở Việt Nam trong báo cáo tháng 12 năm 2007 của Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn thì sản lượng nuôi thủy sản đạt 2.085 nghìn tấn tăng 23% so với năm 2006. Tuy nhiên, do lợi nhuận cao nên diện tích nuôi trồng thủy sản tăng cũng rất nhanh và mật độ nuôi cũng tăng dẫn đến tình trạng ô nhiễm môi trường, dịch bệnh xảy ra tràn lan và mầm bệnh ngày càng đa dạng nhất là bệnh do vi khuẩn. Trong số các mầm bệnh vi khuẩn ở thủy sản thì vi khuẩn Aeromonas hydrophila là một trong những tác nhân gây bệnh nổi bật. Chúng xuất hiện cũng như gây chết trên nhiều đối tượng thủy sản khác nhau. Hiện nay có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để định danh vi khuẩn A. hydrophila. Các phương pháp phổ biến là phương pháp sinh hóa truyền thống hoặc bộ kít API 20E để kiểm tra các đặc tính sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn. Tuy nhiên, các đặc điểm sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn thường biến đổi tùy thuộc vào điều kiện của từng phòng thí nghiệm, loại hóa chất sử dụng, hãng cung cấp và chủng vi khuẩn chuẩn hay chủng tham khảo được sử dụng. Hiện tại, các kỹ thuật phân tử như PCR (phản ứng trùng hợp), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) và AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) cũng được sử dụng để định danh A. hydrophila nhằm khẳng định kết quả định danh bằng phương pháp sinh hóa. Đề tài “Tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn Aeromonas hydrophila” được thực hiện tại Khoa Thủy sản nhằm mục đích tìm hiểu những chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa sai khác từ phương pháp truyền thống và sử dụng kít API 20E. Đồng thời cũng so sánh với những kết quả định danh của các nghiên cứu trước đây tại bộ môn. Mục đích cuối cùng của đề tài là đề xuất các chủng vi khuẩn A. hydrophila tham khảo cùng với phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa dùng định danh vi khuẩn trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Trang 2 Đề tài được thực hiện với các nội dung sau: - Kiểm tra các chỉ tiêu về sinh lý và sinh hóa vi khuẩn A. hydrophila bằng phương pháp truyền thống; - Kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa vi khuẩn A. hydrophila sử dụng bộ kít API 20E; - Dùng phương pháp PCR phát hiện các chủng vi khuẩn A. hydrophila được định danh bằng phương pháp sinh hóa. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Trang 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bệnh trên động vật thủy sản Khác với các hình thức nuôi và thu hoạch khác cây trồng và vật nuôi đều nhìn thấy được, các động vật thủy sản cần được chú ý nhiều hơn để theo dõi sức khỏe của chúng. Chúng không dễ quan sát thấy được, trừ khi nuôi ở trong bể, và chúng lại sống trong một môi trường phức tạp và biến động. Ngoài ra, việc tiêu thụ thức ăn và tử vong có thể đều ẩn náu kỹ ở dưới nước. Mặt khác, nuôi trồng thủy sản có một lượng loài nuôi và môi trường nuôi đa dạng. Hiện nay bệnh cho là một trong những thách thức quan trọng nhất mà ngành nuôi trồng thủy sản đang phải đang đối mặt. Số lượng các bệnh tìm thấy trong nuôi trồng thủy sản cũng thay đổi, một số đặc điểm bệnh của vật chủ khó nhận ra hoặc không nhận ra, và nhiều bệnh lại có các triệu chứng không đặc trưng. Điều này là do tác nhân gây bệnh trên động vật thủy sản không chỉ một mà có thể có nhiều tác nhân (môi trường, tác nhân chính, tác nhân cơ hội,…) cùng tác động. Theo Từ Thanh Dung và ctv (2005) tác nhân gây bệnh trên động vật thủy sản chủ yếu là vi khuẩn, virút, nấm và nguyên sinh động vật. Ở Đài Loan 80% sản lượng tôm của quốc gia này đã bị thất thoát vào những năm 1987-1988, gần đây vào các năm 1990-1991 dịch bệnh liên tiếp gây thiệt hại cho nghề nuôi tôm ở Philippin, cụ thể với sản lượng tôm nuôi giảm từ 90.000 tấn năm 1994 xuống còn 340.527 tấn năm 1999. Thái Lan việc xuất khẩu thủy sản cũng gặp khó khăn do dịch bệnh đốm trắng đã làm giảm sản lượng tôm nuôi từ 225.000 tấn năm 1995 xuống chỉ còn 16.000 tấn năm 1996 và đã làm thiệt hại khoảng 500 triệu USD đến năm 1997 tình trạng này vẫn chưa được cải thiện (trích dẫn bởi Triệu Thanh Tuấn, 2006). Gần đây, ở Việt Nam vào khoảng tháng 4 và tháng 8 năm 2007 có hiện tượng tôm chết rải rác do bệnh đốm trắng và phân trắng. Bên cạnh đó, từ đầu năm 2007 xuất hiện bệnh lạ “bệnh sữa” trên tôm hùm, đến đầu quý 2/2007 dịch bệnh bùng phát, gây chết hàng loạt tôm nuôi tại các tỉnh miền Trung (đặc biệt tại Phú Yên, Khánh Hoà) gây thiệt hại trên 161 tỷ đồng cho người nuôi ( Trong khi đó, trong khảo sát của Nguyễn Chính (2005) ở các vùng nuôi cá tra thâm canh ơ An Giang và Cần Thơ thì cá tra bị mắc nhiều loại bệnh với các tần suất bắt gặp khác nhau. Bệnh thường gặp và gây thiệt hại lớn là bệnh gan thận có mủ, xuất hiện trên 82% ao và 100% bè nuôi cá, đồng thời tỉ lệ cá chết có thể lên Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Trang 4 đến 80-90% nếu không chữa trị kịp thời. Trong khi đó, bệnh xuất huyết dưới da (bệnh đốm đỏ) cũng xuất hiện ở tất cả các ao và bè nuôi khảo sát nhưng thiệt hại chỉ khoảng từ 20-30%. Tuy tần số suất hiện của bệnh phù đầu không cao bằng 2 bệnh (78% ở ao nuôi và 22% ở bè nuôi ) trên nhưng tỉ lệ chết ở bệnh này lại ở mức cao 60-70%. Bên cạnh đó, các bệnh như trắng mang, trắng đuôi; lồi mắt, nổ mắt; vàng da; nấm thủy mi; xuất huyết đường ruột, ký sinh trùng;…. cũng được ghi nhận trong khảo sát này. Ngoài ra, trong Báo cáo dịch bệnh của Sở thủy sản An Giang 9 tháng đầu năm 2007 bệnh xuất hiện rải rác ở tất cả các tháng và tập trung nhiếu nhất vào đầu mùa nước đổ (khoảng cuối tháng 6 đến đầu tháng 8). Cũng từ báo cáo này ghi nhận được một số bệnh trên các đối tượng nuôi chính ở tỉnh (cá tra, cá lóc, cá điêu hồng,…) như: bệnh đốm trắng ở gan thận (do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri); bệnh xuất huyết, lở loét, đốm đỏ (do vi khuẩn: Aeromonas hydrophila, Pseudomonas sp., Streptococus sp. ); bệnh trắng gan-trắng mang; bệnh do ký sinh trùng (trùng bánh xe, trùng quả dưa, sán lá 16 móc, sán dây, sán lá song chủ,…). Đặc biệt, trong các bệnh trên thì bệnh đốm trắng ở gan, thận và bệnh trắng gan- trắng mang có tỷ lệ chết ở cá nhỏ vào mùa nước đổ có thể đến 50%. 2.2 Bệnh do vi khuẩn trên động vật thủy sản Vi khuẩn là một trong những nhóm tác nhân gây bệnh trên động vật thủy sản mà chủ yếu thường gặp nhất là nhóm vi khuẩn gram âm. Tác nhân vi khuẩn có thể được coi là tác nhân sơ cấp hoặc là tác nhân thứ cấp gây bệnh cho các loài thủy sản (Inglish et al, 1993). Theo tài liệu của G. Post vi khuẩn gây bệnh trên cá được phát hiện đầu tiên vào năm 1894. Vi khuẩn ở động vật thủy sản đã phân lập được vài trăm loài gây bệnh thuộc 9 họ, nhóm vi khuẩn điển hình là nhóm vi khuẩn Aeromonas sp., Pseudomonas sp. gây bệnh ở vùng nuôi nước ngọt (Bùi Quang Tề và Phạm Thị Yên, 2002). Theo Từ Thanh Dung và ctv (2004), đã phân lập từ 181 mẫu cá tra bệnh mủ gan thu được 108 dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Mẫu thu từ các vùng nuôi cá tra phát triển mạnh như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ (huyện Thốt Nốt và huyện Phụng Hiệp). Từ năm 1998 bệnh mủ gan phát hiện đầu tiên trên cá tra nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long và gọi là bệnh BNP (bacillary necrosis of Pagasius) (Ferguson et al, 2001). Ngoài ra, vi khuẩn này cũng là nguyên nhân gây bệnh Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Trang 5 nhiễm trùng máu cấp tính trên cá nheo Mỹ với tỉ lệ hao hụt rất cao (Autin và Autin, 1993). Mặt khác vi khuẩn không chỉ tồn tại trên vật chủ mà còn tồn tại ngay trong môi trường nước với mật độ tùy theo chất lượng nước (Buler, 2004). Trong nghiên cứu về thành phần loài của nhóm vi khuẩn gây bệnh Vibrio của Trần Thị Tuyết Hoa và ctv (2004), phân lập được 50 chủng Vibrio spp. từ ấu trùng và nước ương tôm càng xanh giống ở Trại sản xuất giống Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ và ở Long Mỹ-Cần Thơ. Một nhóm vi khuẩn thuộc loài Vibrio gây thiệt hại kinh tế trong nuôi tôm công nghiệp ở Philippin, Ấn Độ và Indonesia là nhóm vi khuẩn phát sáng. Bệnh phát sáng do một số vi khuẩn có khả năng phát sáng gây ra như Vibrio harveyi, V. splendida, V. orientalis, V. fischeri, V. vulnificus. Ở Việt Nam, những dạng nhiễm vi khuẩn phát sáng thường thấy ở trại sản xuất hoặc ương tôm giống. Khi vi khuẩn phát sáng hiện trong cơ thể tôm với số lượng lớn có thể làm tôm nhiễm bệnh phát sáng trong bóng tối. Vibrio phát sáng có thể phát thành dịch và gây chết đến 100% ấu trùng tôm, tôm giống và kể cả tôm trưởng thành (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv, 2006). Ngoài các dòng vi khuẩn gram âm thường gặp trên, bệnh do vi khuẩn gram dương cũng gây nguy hiểm không kém. Loài vi khuẩn Srteptococcus sp. có khả năng gây bệnh chủ yếu trên cá nước lợ và mặn, đồng thời trên một số loài cá nước ngọt. Trong khi đó, loài vi khuẩn Mycobacterium spp. gây bệnh ở nhiều loài cá nước ngọt và cá ở vùng biển nhiệt đới, nguy hiểm hơn chúng còn có khả năng gây bệnh cho người (Từ Thanh Dung, 2006). 2.3 Vi khuẩn Aeromonas sp. Do có các đặc điểm tương tự nhau nên lúc đầu giống Aeromonas và Vibrio nằm chung họ Vibrionaceae. Giữa thập niên 80 Aeromonas lại được tách ra một họ riêng là Aeromonadaceae (Horneman và Moris, 2007) do có các chỉ tiêu sinh hóa, sinh lý khác biệt như không mẫn cảm với phản ứng O/129 (150 µg) (ngoại trừ A. caviae ). Theo Barrow và Feltham (1993) Aeromonas được chia ra thành 2 nhóm dựa trên khả năng di động và ngưỡng nhiệt độ phát triển của chúng. Nhóm vi khuẩn A. hydrophila, A. sobria và A. caviae có các đặc điểm là có khả năng di động, 2 đầu hơi tròn, gram âm, hình que ngắn, hiếu khí không bắt buộc, phát triển được ở 370C.... Nhóm thứ hai là A. salmonicida (3 loài phụ gồm: A. salmonicida, A. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Trang 6 achromogenes và A. nova) có đặc điểm tương tự nhưng chúng chỉ phát triển tốt nhất ở 220C hoặc thấp hơn và không có tiêm mao cũng như chúng không có khả năng di động. Bệnh do nhóm vi khuẩn Aeromonas sp. đã gây thiệt hại không kém nghiêm trọng cho nghề nuôi thủy sản nước ngọt ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung. Bệnh nhiễm trùng máu (bệnh đốm đỏ, xuất huyết…) do nhóm vi khuẩn này gây ra và thường gặp ở các động vật thủy sản nước ngọt như: trắm cỏ, ba sa, chép, tai tượng,... Mặt khác, chúng còn có thể gây bệnh ở ba ba, cá sấu, bệnh đỏ chân ở ếch, đốm nâu ở tôm càng xanh. Tỷ lệ tử vong thường từ 30-70% (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004). Ngoài ra, Bộ môn bệnh động vật thủy sản Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I cũng phân lập vi khuẩn gây bệnh chủ yếu trên nhiều loài nuôi thủy sản là A. hydrophila 57,5%, A. caviae 25% và Pseudomonas flourescens 17,5% (Bùi Quang Tề và Phạm Thị Yên, 2002). Nhóm gây bệnh thường gặp là A. hydrophila, A. caviae, A. sobria được phát hiện đầu tiên trên cá chình trong báo cáo dịch bùng phát bệnh của Sanarelli (1891). Kế đến trong các nghiên cứu sau trên cá chép của Schaperclaus (1930), phân lập được vi khuẩn A. hydrophila và cho đây là tác nhân gây bệnh cho cá (trích dẫn của Inglis et al, 1993). Gần đây, thiệt hại do nhóm vi khuẩn này lại được phát hiện trong ghi nhận của Phan Anh (09/01/2006), Đồng Tháp là tỉnh bị thiệt hại lớn nhất do trong hơn 1 tuần có lượng cá chết nhiều với tỷ lệ 5-10% cá trong ao, ước tính khoảng 75 tấn. Các tỉnh Tiền Giang, An Giang, Vĩnh Long... cá chết nằm trong mức cho phép 2- 3%. Bộ Thủy sản cùng thời gian này cho biết, theo kết luận chính thức từ Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, nguyên nhân cá chết là do môi trường nước trong ao bị nhiễm vi khuẩn