Luận văn Tìm hiểu sự biến đổi của vùng lặp lại thuộc orf94, orf125 của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú (penaeus monodon) tại Cà Mau

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TÔ VŨ AN TÌM HIỂU SỰ BIẾN ĐỔI CỦA VÙNG LẶP LẠI THUỘC ORF94, ORF125 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) TẠI CÀ MAU LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2008 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TÔ VŨ AN TÌM HIỂU SỰ BIẾN ĐỔI CỦA VÙNG LẶP LẠI THUỘC ORF94, ORF125 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) TẠI CÀ MAU LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Th.s TRẦN THỊ TUYẾT HOA 2008 MỤC LỤC Phần I: Giới thiệu ................................................................................................. 1 Mục tiêu của đề tài ...................................................................................... 2 Nội dung nghiên cứu................................................................................... 2 Phần II: Tổng quan tài liệu................................................................................... 3 2.1 Tình hình nuôi tôm biển............................................................................. 3 2.1.1Trên thế giới ........................................................................................ 3 2.1.2 Việt Nam............................................................................................ 4 2.1.3 Đồng bằng sông Cửu Long ................................................................ 4 2.1.4 Cà Mau............................................................................................... 5 2.2 Tình hình dịch bệnh trong nuôi tôm .......................................................... 6 2.2.1 Trên thế giới ................................................................................................ 6 2.2.2 Trong nước và khu vực Đồng bằng sông Cửu Long ......................... 6 2.3 Ảnh hưởng của bệnh đốm trắng đến nghề nuôi tôm.................................. 7 2.4 Đặc điểm của tác nhân gây bệnh đốm trắng .............................................. 8 2.4.1 Tác nhân gây bệnh ............................................................................. 8 2.4.2 Triệu chứng…… ............................................................................... 8 2.4.3 Phương thức lây truyền và loài cảm nhiễm ....................................... 8 2.4.4 Chẩn đoán…………………………….. ............................................9 24.5 Phòng ngừa và xử lý bệnh .................................................................. 9 2.4 Một số nghiên cứu bệnh đốm trắng .......................................................... 10 2.6 Kỹ thuật PCR và các ứng dụng................................................................. 14 2.6.1 Quy trình ............................................................................................ 14 2.6.2 Những ứng dụng của PCR ................................................................. 15 2.6.3 Hạn chế ............................................................................................. 15 Phần III: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu .................................................... 16 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................. 16 3.2 Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 17 3.2.1 Mẫu vật .............................................................................................. 17 3.2.2 Dụng cụ ............................................................................................. 17 3.2.2.1 Dụng cụ thu mẫu.......................................................................... 17 3.2.2.2 Dụng cụ phân tích PCR................................................................ 17 3.2.3 Hóa chất ............................................................................................ 17 3.2.3.1 Phân tích PCR ............................................................................. 17 3.4 Phương pháp Nested-PCR ......................................................................... 17 3.4.1 Qui trình ly trích DNA....................................................................... 18 3.4.2 Qui trình khuếch đại........................................................................... 18 3.4.3 Cách chuẩn bị phản ứng..................................................................... 18 3.4.4 Chạy điện di ....................................................................................... 18 3.4.5 Đọc kết quả ........................................................................................ 19 3.5 PCR-genotyping......................................................................................... 19 3.5.1 PCR-Genotyping khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94................... 19 3.5.1.1 Điều kiện phản ứng ...................................................................... 19 3.5.1.2 Thành phần hóa chất tham gia phản ứng PCR-genotyping ......... 19 3.5.1.3 Đọc kết quả .................................................................................. 20 3.5.2 PCR-Genotyping khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125.................. 21 3.5.2.1 Điều kiện phản ứng ........................................... ..........................21 3.5.2.2 Thành phần hoá chất tham gia phản ứng PCR-genotyping ........21 3.5.2.3 Đọc kết quả ..................................................................................22 Phần IV: Kết quả và thảo luận .............................................................................23 4.1 Kết quả xác định sự hiện diện của WSSV trong các mẫu tôm ..............23 4.2 Kết quả phân tích PCR-genotyping .......................................................27 4.2.1 Kết quả PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94.27 4.2.1.1 Phản ứng PCR-genotyping (ORF94) thực hiện theo qui trình của Trần Thị Mỹ Duyên, (2006).................................................................................27 4.2.1.2 Kết quả phân tích các mẫu WSSV thu tại Cà Mau (PCR-genotyping-ORF94) ......................................................29 4.2.2 Kết quả PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125................................................................................32 4.2.3 Mối liên hệ giữa số vùng lặp lại thuộc ORF94 và ORF125 ..........35 Phần V: Kết luận và đề xuất ...............................................................................37 5.1 Kết Luận.............................................................................................37 5.2 Đề xuất ...............................................................................................37 Phần VI: Tài liệu tham khảo ................................................................................38 Phần VII: Phụ lục.................................................................................................42 DANH SÁCH HÌNH Hình 4.1: Thể hiện tỉ lệ cảm nhiễm WSSV .........................................................25 Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR của mẫu tôm trong các ao có dấu hiệu đốm trắng tại Cà Mau bằng gel 1%.......................................................25 Hình 4.3: Kết quả điện di kiểm tra 10 mẫu sau khi giảm thể tích .......................28 Hình 4.4: Kết quả điện di khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 trên mẫu WSSV thu ở Cà Mau....................................................................................30 Hình 4.5: Kết quả điện di khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 trên mẫu thu ở Cà Mau................................................................................................32 Hình 4.6: Kết quả điện di khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125 trên mẫu WSSV thu ở Cà Mau....................................................................................34 i DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Thành phần và nồng độ hoá chất thực hiện phản ứng PCR- genotyping (ORF94) ............................................................................................20 Bảng 3.2: Thành phần và nồng độ hoá chất thực hiện phản ứng PCR- genotyping (ORF125) ..........................................................................................21 Bảng 4.1: Một vài thông tin về ao nuôi nhiễm WSSV trong các mẫu tôm tại Cà Mau............................................................................................................26 Bảng 4.2: Cường độ nhiễm của 10 mẫu kiểm tra ................................................28 Bảng 4.3: Kết quả phân tích các nhóm vùng lặp lại thuộc ORF94 trong các ao tôm thu ở Cà Mau .....................................................................................29 Bảng 4.4: Kết qủa phân tích các nhóm vùng lặp lại thuộc ORF125 trong các ao tôm thu tại Cà Mau ...................................................................................33 Bảng 4.5: Kết quả PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 ..................................................................................................35 ii LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Tuyết Hoa đã tận tình chỉ dẫn trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Thủy Sản, các bạn lớp BHTS và NTTS K30 đã tận tình giúp đở trong suốt quá trình học tập và làm luận văn này. Xin cảm ơn cha, mẹ, chị, em là một chổ dựa vững chắc cho sự nghiệp và tương lai của bản thân. Tác giả Tô Vũ An TÓM TẮT Cà Mau là tỉnh có diện tích và sản lượng tôm nuôi cao nhất cả nước. Nhưng trong những năm gần đây thì tình hình dịch bệnh bùng phát ở nhiều nơi nó gây trở ngại đối với người nuôi tôm nhất là bệnh đốm trắng do tác nhân White Spot Syndrome Virus (WSSV). Theo những nghiên cứu gần đây cho thấy WSSV đã có nhiều biến đổi về mặt cấu trúc di truyền. Nghiên cứu được thực hiện để tìm hiểu về đặc điểm gen của virut gây bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi tại Cà Mau và khả năng ứng dụng của vùng lặp lại thuộc ORF94 và ORF125 trong nghiên cứu dịch tể học của Virut gây bệnh đốm trắng. Kết quả phân tích 60 mẫu tôm dương tính với WSSV của 12 ao trong tổng số 24 ao thu tại Cà Mau sử dụng phương pháp PCR- genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 và ORF125 cho thấy có sự biến động về cấu trúc di truyền của WSSV trên tôm sú tại Cà Mau. Kết quả cho thấy số vùng lặp lại trên bộ gen của WSSV giữa các ao thì khác nhau. Trong cùng một ao nhiễm WSSV thì số vùng lặp lại thường giống nhau 9/12 ao đối với ORF94 và 10/12 ao đối với ORF125. Đối với ORF94 đã xác định được 7 nhóm vùng lặp lại (4 đến 10 vùng lặp lại) trong đó kiểu gen có 6, 8 vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao nhất 24,6%. Còn ORF125 thì có 5 nhóm vùng lặp lại (từ 4 đến 8 vùng lặp lại) trong đó kiểu gen có 6 vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao nhất 47%. Sự khác biệt giữa các vùng lặp lại thuộc ORF94, và ORF125 trên bộ gen WSSV trong các ao tôm bệnh đốm trắng cho thấy đang tồn tại nhiều kiểu gen WSSV khác nhau có khả năng gây bệnh đốm trắng trên tôm. Kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng trong nghiên cứu về sự lan truyền và phân bố WSSV, làm cơ sở cho việc phòng ngừa và kiểm soát sự bùng phát của bệnh đốm trắng do WSSV gây ra. 1 PHẦN I GIỚI THIỆU Cà Mau là tỉnh nằm ở tận cùng cực nam của tổ quốc có ba mặt giáp biển và hệ thống sông ngòi chằng chịt nên rất thuận lợi cho nghề nuôi trồng thủy sản phát triển. Từ những đầu thập niên 80 nghề nuôi trồng thủy sản ở Cà Mau (đặc biệt là nghề nuôi tôm sú) đã dần dần phát triển với hình thức nuôi quãng canh truyền thống nhưng năng suất nuôi thấp. Để tăng năng suất thì việc chuyển đổi từ hình thức nuôi quãng canh truyền thống sang bán thâm canh và thâm canh là rất cần thiết. Do hiệu quả kinh tế mà nghề nuôi tôm đem lại nên diện tích và sản lượng tôm nuôi ở Cà Mau không ngừng tăng trong những năm gần đây. Xuất khẩu thủy sản được xem là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của tỉnh và trong khu vực. Việc thâm canh hóa trong nuôi tôm sú không những tăng năng suất mà còn làm tăng nguy cơ bùng phát dịch bệnh. Theo thống kê của Bộ Thủy sản mỗi năm có hàng nghìn hecta ao nuôi tôm thương phẩm phải thu hoạch sớm do bệnh trong đó 80% là bệnh đốm trắng. Đây là bệnh nguy hiểm chúng có khả năng lây lan nhanh trong ao và gây thiệt hại lớn (có thể gây chết đến 100% sau 3 - 10 ngày nhiễm bệnh) mà còn có khả năng lây lan qua các khu vực lân cận qua nguồn nước hay các loài giáp xác. Nhưng mức độ gây hại của chúng rất khác nhau ở các vùng và các vụ trong năm (có những ao tôm bị nhiễm đốm trắng thì tôm chết rất nhanh nhưng cũng có ao nuôi bị nhiễm đốm trắng tôm vẫn phát triển bình thường đến khi thu hoạch). Vấn đề này cũng có nhiều giả thiết được đặt ra như: điều kiện môi trường, quản lý và chăm sóc sức khỏe tôm nuôi, tác nhân gây bệnh: sự biến đổi kiểu gen WSSV. Do vậy, Đề tài: "Tìm hiểu sự biến đổi của vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú (Penaeus monodon) tại Cà Mau" được thực hiện. 2 Mục tiêu của đề tài Tìm hiểu về đặc điểm gen của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi tại Cà Mau và khả năng ứng dụng của vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 trong nghiên cứu dịch tể học của virus gây bệnh đốm trắng. Nội dung nghiên cứu * Xác định sự hiện diện của WSSV trong các mẫu tôm sú thu được tại Cà Mau bằng phương pháp Nested-PCR. * Phân tích các dòng WSSV thu được với phương pháp PCR-genotyping khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125. 3 PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nuôi tôm biển 2.1.1 Trên thế giới Trên thế giới nghề nuôi trồng thủy sản đặc biệt là nghề nuôi tôm biển đã xuất hiện rất lâu nhưng nuôi tôm công nghiệp chỉ mới xuất hiện ở những năm 30 của thế kỷ XX ( Nguyễn Văn Hảo, 2003). Nuôi tôm công nghiệp cung cấp hơn 1/3 sản lượng tôm nuôi, nhưng diện tích chỉ chiếm khoảng 5% tổng diện tích. Từ đó, nuôi tôm công nghiệp phát triển mạnh và mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nhiều nước. Nghề nuôi tôm thương phẩm đã nổi lên như một trong các hệ thống sản xuất thực phẩm có tốc độ phát triển nhanh nhất trên Thế giới và các nước Đông Nam Á và là nguồn thu ngoại tệ chủ yếu. Đến năm 1980 qui mô và diện tích nuôi tôm biển gia tăng và phát triển theo hướng ngày càng thâm canh hóa. Thái Lan là nước có sản lượng tôm đứng đầu thế giới kế đến là Indonesia, Trung Quốc, Ấn Độ, Bangladesh, Việt Nam (Nguyễn Văn Hảo, 2003). Nuôi trồng thủy sản trên Thế giới tăng nhanh trong những năm qua với tốc độ 7,6%, đạt 37,5 triệu tấn vào năm 2001, chiếm 29,1% tổng sản lượng thủy sản (Lê Xuân Sinh, 2005), đến năm 2003 sản lượng nuôi trồng thủy sản ước đạt 41,9 triệu tấn. Sản lượng tôm biển tăng rất nhanh, năm 2000 thì sản lượng tôm biển đạt được 1.087.900 tấn (Lê Xuân Sinh, 2003), đến năm 2002 sản lượng này tăng lên 1.292.000 tấn. Nhưng trước đó sản lượng nuôi tôm trên Thế giới có xu hướng giảm. Cụ thể, năm 1994 sản lượng tôm biển trên thế giới là 733.000 đến năm 1995 giảm còn 712.000 và tiếp tục giảm còn 693.000 tấn vào năm 1996 đến năm 1997 còn 660.000 tấn (World Shrimp Farming,1997 trích dẫn bởi Lê Xuân Sinh, 2003). Sản lượng tôm giảm trong những năm này là do dịch bệnh bùng phát và gây thiệt 4 hại ở nhiều nước như Thái lan, Việt Nam (1994- 1996), Peru (1997), các quốc gia dọc bờ biển Đông và Tây Ấn Độ (1994-1995), Indonesia, Philippines (1996). 2.1.2 Việt Nam Việt Nam với bờ biển trải dài 3.260 km từ Quảng Ninh đến Cà Mau vòng qua Kiên Giang nên rất có tiềm năng cho nuôi trồng thủy sản nước lợ phát triển. Diện tích nuôi tôm gia tăng nhanh chóng từ 50.000 ha (1985) lên đến 295.000 ha (1998) với 30 tỉnh nuôi tôm sú và tăng lên 449.275 ha (2001). Đến năm 2004 diện tích nuôi tôm nước lợ cả nước khoảng 600.000 ha, với mô hình nuôi quãng canh cải tiến là chủ yếu, ngoài ra còn có các mô hình bán thâm canh, thâm canh chiếm diện tích nhỏ trong đó nuôi thâm canh đạt được năng suất cao khoảng 5 -7 tấn/ ha. Đồng bằng sông Cửu Long là vùng có diện tích nuôi lớn nhất cả nước có khoảng 680.000 ha (2005). Sản lượng tôm cùng tăng theo từ 65.282 tấn (1999), tăng lên 103.845 (2000) đến năm 2001 sản lượng tôm nuôi là 162.713 tấn (Lê Xuân Sinh, 2003), và sản lượng tiếp tục tăng đến 210.000 tấn (2003) (Nguyễn Văn Hảo, 2004). Kim ngạch xuất khẩu các mặt hàng thủy sản năm 2005 là 2,65 tỷ USD (Tạp chí khuyến ngư Việt Nam số 45), Năm 2007, xuất khẩu thủy sản của cả nước đã đạt khoảng 925 nghìn tấn trị giá 3,756 tỷ USD, tăng 12,2% về khối lượng và 14% về giá trị so với cùng kỳ năm ngoái. Tuy nhiên, trị giá xuất khẩu trên khi được bổ sung đầy đủ số liệu luỹ kế của cả năm, rất có thể đạt đến mức 3,8 tỷ USD. (Báo thương mại, 2008). Việc xuất khẩu thủy sản được xem là một trong các ngành kinh tế mũi nhọn ở Việt Nam. 2.1.3 Đồng bằng sông Cửu Long Đồng bằng sông Cửu long là vùng nuôi trồng thủy sản lớn nhất cả nước và cũng là một trong các ngành kinh tế mũi nhọn của vùng. Tổng diện tích nuôi tôm của khu vực ở năm 2003 chiếm 88% diện tích nuôi tôm của cả nước, sản lượng 146.000 tấn, chiếm 69.5% sản lượng tôm của cả nước, với hình thức nuôi quãng canh cải tiến là chủ yếu như tôm rừng tập trung chủ yếu ở Cà Mau, Bạc Liêu, Trà Vinh, tôm lúa ở Cà Mau, Kiên Giang, Sóc Trăng, bán thâm canh ở Sóc Trăng, Thâm 5 Canh ở Sóc Trăng, Bạc Liêu. Sóc Trăng là tỉnh có nghề nuôi tôm với tốc độ thâm canh hóa cao, năng suất bình quân cao nhất vùng. Năm 2005, tổng diện tích nuôi tôm của Sóc Trăng là 43.211 ha, sản lượng 42.817 tấn, trong đó diện tích nuôi thâm canh và bán thâm canh là 17.481 ha, sản lượng tôm nuôi thâm canh là 13.400 tấn, bán thâm canh là 17.850 tấn, quãng canh cải tiến là 11.567 tấn (Sở Thủy Sản Sóc Trăng, 2005). Năm 2005, Bạc Liêu có diện tích nuôi tôm là 116.473 ha, trong đó có 10.929 ha nuôi thâm canh và bán thâm canh, sản lượng đạt 63.616 tấn (Sở Thủy Sản Bạc Liêu, 2005) 2.1.4 Cà Mau Cà Mau là tỉnh có diện tích và sản lượng nuôi trồng thủy sản lớn nhất cả nước mà chủ yếu là thủy sản nước lợ. Do Cà Mau có ba mặt giáp biển, hệ thống sông ngòi chằng chịt, nguồn tài nguyên và nguồn lao động dồi dào nên rất thuận lợi cho thủy sản phát triển. Diện tích và sản lượng nuôi tôm trong những năm 1981 có 14.000 ha đạt 4.500 tấn, năm 1991 tăng lên 60.000 ha, 28.600 tấn, và năm 2000 có tới 153.373 ha với 35.700 tấn (Phùng Văn, 2005) Năm 2001 có 217.898 ha; năm 2002 có 239.398 ha; năm 2003 có 245.338 ha; năm 2004 có 248.174 ha. Trong diện tích nuôi năm 2004 có các loại hình nuôi chủ yếu là: tôm-rừng 46.300 ha, tôm-lúa 43.600 ha, tôm-vườn 22.000 ha, nuôi tôm công nghiệp 580 ha, còn lại là nuôi tôm dạng sinh thái (Phùng Văn, 2005) Năm 2008, Cà Mau có diện tích nuôi tôm 249.000 ha, gồm 35.000 ha rừng - tôm, 40.000 ha lúa - tôm, 1.000 ha tôm - vườn, 900 ha tôm công nghiệp, còn lại là diện tích chuyên tôm dạng sinh thái (Nguyễn Tiến Hưng, 2008). 2.2 Tình hình dịch bệnh trong nuôi tôm 2.2.1 Trên thế giới Phong trào nuôi trồng thủy sản trên thế giới ngày càng phát triển mạnh mẽ nhất là nghề nuôi tôm châu Á - Thái Bình Dương vào những năm của thập kỷ 80 và lịch sử bệnh tôm cũng gắn liền với phong trào nuôi đó. Công nghệ nuôi tôm ở các 6 nước châu Á tuy phát triển mạnh nhưng phải đối phó với vấn đề dịch bệnh và sự suy thoái của môi trường, đã gây ra nhiều thiệt hại cho người nuôi. Ở Trung Quốc sản lượng tôm nuôi giảm mạnh khoảng 120.000 tấn trong năm 1993, trong khi đó ở Đài Loan sản lượng liên tục giảm từ đỉnh cao 88.000 tấn vào năm 1987 xuống còn 12.000 tấn ở năm 1993. Trong khoảng thời gian từ 1993 - 1995 sản lượng tôm ở Indonesia và philippines giảm tương ứng 48% và 58% (Nguyễn Văn Hảo, 2003). Ở nhiều quốc gia do phát triển quá mức nghề nuôi nên phải chịu những hậu quả: tài nguyên môi trường bị cạn kiệt, sử dụng nhiều nông dược, hóa chất, phá rừng, lấn đất nông nghiệp làm cho đấ