Luận văn Tìm hiểu sự khác nhau về các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa giữa các dòng vi khuẩn edwardsiella ictalurixác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thông và API 20F

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG TÌM HIỂU SỰ KHÁC NHAU VỀ CÁC CHỈ TIÊU SINH LÝ VÀ SINH HÓA GIỮA CÁC DÒNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri XÁC ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA TRUYỀN HỐNG VÀ API 20E LUẬN VĂN TỐT NGHIIỆP ĐẠII HỌC NGÀNH NUÔII TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2008 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG TÌM HIỂU SỰ KHÁC NHAU VỀ CÁC CHỈ TIÊU SINH LÝ VÀ SINH HÓA GIỮA CÁC DÒNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri XÁC ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA TRUYỀN THỐNG VÀ API 20E LUẬN VĂN TỐT NGHIIỆP ĐẠII HỌC NGÀNH NUÔII TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH NGUYỄN THỊ TIÊN 2008 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu i LỜI CẢM ƠN Được làm luận văn tốt nghiệp là mong muốn của rất nhiều sinh viên, trong đó có bản thân tôi. Tuy nhiên để có thể hoàn thành luận văn này là cả một quá trình phấn đấu, phải mất nhiều thời gian và công sức để nghiên cứu, đồng thời phải được sự hướng dẫn nhiệt tình của thầy cô. Lời đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa thủy sản trường Đại Học Cần Thơ, đặc biệt là các thầy cô bộ môn sinh học và bệnh thủy sản đã truyền đạt những kiến thức, những kinh nghiệm quý báo trong thời gian tôi theo học và nghiên cứu tại trường. Xin cám ơn gia đình đã động viên giúp đỡ không chỉ về vật chất mà cả về tinh thần từ khi tôi bước chân vào trường. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh và chị Nguyễn Thị Tiên đã tận tình giúp đỡ trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Xin gởi lời cám ơn đến cô Nguyễn Thị Thu Hằng và thầy Đoàn Nhật Phương đã nhiệt tình quan tâm động viên trong suốt thời gian làm cố vấn học tập. Đồng thời xin gởi lời cám ơn đến tập thể lớp nuôi trồng và bệnh học thủy sản K30 đã động viên, hỗ trợ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu ii TÓM TẮT Chủng vi khuẩn tham khảo E223 cùng với 2 chủng C1, C2 phân lập trực tiếp từ cá bệnh và 4 chủng trong tủ âm của khoa thủy sản CAF258, CAF255, 2B1, 3B3 được sử dụng cho việc dịnh danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và kiểm tra API 20E. Sau khi phục hồi trên TSA tiến hành test các chỉ tiêu cơ bản gồm. Tất cả các chủng đều có đặc điểm của vi khuẩn E. ictaluri như dạng hình que, gram âm, cho phản ứng oxidase âm tính, có khả năng lên men và oxi hóa đường glucose, không có khả năng sinh khí H2S và không tạo sản phẩm indole. Hầu hết các chỉ tiêu đều giống nhau ở cả 2 phương pháp. Đề tài cũng tiến hành điện di, kết quả sản phẩm PCR có sự hiện diện của vi khuẩn E. ictaluri tất cả đều hện vạch tại vị trí 407pb. Chọn ngẫu nhiên 5 chủng CAF258, E223, 3B3, C1 và C2 tiến hành gây cảm nhiễm. Kết quả 3 bể CAF28, C1 và C2 cá có xuất hiện dấu hiệu bệnh lý. Sau khi tái phân lập và tái định danh tất cả các chủng đều có đặc điểm giống chủng ban đầu, cho kết quả PCR giống nhau (hiện vạch 407 bp). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i TÓM TẮT.............................................................................................................ii MỤC LỤC ...........................................................................................................iii DANH SÁCH BẢNG .......................................................................................... iv DANH SÁCH HÌNH............................................................................................. v Chương I : Giới thiệu ............................................................................................ 1 Chương II: Lược khảo tài liệu ............................................................................... 3 2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh cá ......................................................................... 3 2.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh trên cá tra ở ĐBSCL ........................................... 3 2.3 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá da trơn ................................. 4 2.31. Bệnh xuất huyết............................................................................................ 4 2.3.2 Bệnh mủ gan trên cá tra ................................................................................ 5 2.4 Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp.................................................................. 8 Chương III: Nội dung và phương pháp nghiên cứu.............................................. 11 3.1 Thời gian và địa điểm .................................................................................... 11 3.1.1 Thời gian .................................................................................................... 11 3.1.2 Địa điểm..................................................................................................... 11 3.2 Nội dung thực hiện ........................................................................................ 11 3.3 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ....................................................................... 11 3.3.1 Vật liệu....................................................................................................... 11 3.3.2 Thiết bị ....................................................................................................... 11 3.4 Thuốc thử, môi trường dùng cho nghiên cứu ................................................. 12 3.3.4 Số chủng vi khuẩn cần thiết ........................................................................ 12 3.5 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 13 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu iv 3.5.1 Số chủng vi khuẩn cần thiết ........................................................................ 13 3.5.2 Nguồn vi khuẩn .......................................................................................... 13 3.5.3 Phương pháp phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn ...................................... 14 3.5.4 Định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống. .................................. 14 3.5.5 Định danh vi khuẩn bằng bộ kit API20E..................................................... 15 3.5.6 Phương pháp PCR ...................................................................................... 16 3.5.7 Thí nghiệm gây cảm nhiễm......................................................................... 17 Chương IV: Kết quả- thảo luận ........................................................................... 19 4.1 Phương pháp sinh hóa truyền thống............................................................... 19 4.2 Kết quả test API ............................................................................................ 21 4.3 Kết quả định danh vi khuẩn bằng PCR .......................................................... 23 4.4 Kết quả gây cảm nhiễm và tái định danh vi khuẩn ......................................... 24 4.5 Thảo luận ...................................................................................................... 28 Chương V: Kết luận – Đề xuất ............................................................................ 32 5.1 Kết luận......................................................................................................... 32 5.2 Đề xuất.......................................................................................................... 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 33 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu v DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 3.1: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn sử dụng cho đề tài ............................. 13 Bảng 3.2: Bảng test các chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn ..................................... 14 Bảng 3.3: Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn được xác định bằng bộ kít API 20E ......................................................................................... 15 Bảng 3.4: Thành phần hóa chất thực hiện phản ứng PCR ................................. 16 Bảng 4.5: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng vi bằng phương pháp sinh hóa truyền thống ..................................................... 19 Bảng 4.6: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng vi bằng bộ kit API 20E ..................................................................................... 22 Bảng 4.7: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng vi khuẩn tái phân lập từ thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp sinh hóa truyền thống .................................................................................................... 26 Bảng 4.8: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng vi khuẩn tái phân lập từ thí nghiệm cảm nhiễm bằng bộ kít API 20E ................ 27 Bảng 4.9: Các đặc điểm khác nhau giữa loài E. ictaluri với các loài khác thuộc nhóm Enterobacteriaceace (OIE, 2003) ............................................................ 29 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu vi DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 3.1: Các bước chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm ............................................... 18 Hình 4.2: Hình nhuộm gram vi khuẩn E. ictaluri................................................. 20 Hình 4.3: Khả năng lên men và oxi hóa đường glucose của E. ictaluri ................ 20 Hình 4.4: Kết quả âm tính với indole cua vi khuẩn E. ictaluri ............................. 21 Hình 4.5: Khả năng thủy phân ornithine và lysine của E. ictaluri ........................ 21 Hình 4.6: Kết quả test API của vi khuẩn E. ictaluri ............................................. 23 Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm PCR các chủng vi khuẩn E. ictaluri ............. 23 Hình 4.8: Thận cá tra nhiễm dòng vi khuẩn CAF258........................................... 25 Hình 4.9: Dấu hiệu bên ngoài của cá tra gây cảm nhiễm dòng E. ictaluri ............ 25 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 1 CHƯƠNG I GIỚI THIỆU Một trong bảy vùng kinh tế quan trọng của cả nước Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có nhiều điều kiện tự nhiên thuận lợi cho nuôi trồng thủy sản phát triển. Trong những năm gần đây nuôi trồng thủy sản đã đóng góp đáng kể vào kim ngạch xuất khẩu ở Việt Nam, tạo công ăn, việc làm, tăng thu nhập, xóa đói giảm nghèo cho các vùng nông thôn. Nổi bật là nghề nuôi cá tra do đây là đối tượng dễ nuôi, mau lớn, chất lượng thịt ngon, có khả năng thích ứng cao với điều kiện môi trường khắc nghiệt. Năm 2006, sản lượng cá tra nuôi ở ĐBSCL đạt 800.000 tấn, xuất khẩu được 292.800 tấn, thu về kim ngạch xuất khẩu 773,64 triệu USD, chiếm 23,4% so với xuất khẩu thủy sản của cả nước (www.fistenet.gov.vn) Tuy nhiên khi diện tích nuôi được mở rộng, nghề nuôi được thâm canh hóa nhất là nuôi với mật độ cao thì vấn đề dịch bệnh xảy ra thường xuyên hơn và gây thiệt hại cũng nhiều hơn. Có thể nói trong những năm gần đây nghề nuôi thủy sản đang phải đương đầu với tình trạng dịch bệnh bùng nổ do sự suy thoái về môi trường và lây lan của mầm bệnh. Trong đó bệnh truyền nhiễm mà nhất là bệnh vi khuẩn đã và đang gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất và sản lượng cá nuôi với sự nổi bật là bệnh mủ gan đã gây thiệt hại không nhỏ về kinh tế cho nhiều hộ nuôi. Các kết quả nghiên cứu gần đây xác định bệnh mủ gan là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra, bệnh xảy ra trên cá tra nuôi ở tất cả các giai đoạn, tỉ lệ hao hụt có thể lên đến 90% (Nguyễn Quốc Thịnh và ctv, 2003). Hiện nay phương pháp xác định vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra phổ biến là phương pháp sinh hóa sử dụng phương pháp kiểm tra xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng bộ kit API 20E. Tuy nhiên, chưa có những thông tin về sự đồng nhất hay sai khác khi xác định đặc tính sinh lý và sinh hóa của hai phương pháp này khi định danh vi khuẩn E. ictaluri. Đề tài “Tìm hiểu sự khác nhau về các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa giữa các dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri được xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và sử dụng bộ kít API 20E” được thực hiện nhằm tìm ra những chỉ tiêu sinh hóa giống và khác nhau khi sử dụng hai phương pháp nêu trên, góp phần vào việc chuẩn hóa phương pháp nghiên cứu bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra trên cá tra. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 2 Mục tiêu nghiên cứu So sánh các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa giữa các dòng vi khuẩn E. ictaluri được xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và sử dụng bộ kit API 20E. Nội dung nghiên cứu  Xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa các dòng vi khuẩn E. ictaluri xác định bằng phương pháp truyền thống.  Xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa các dòng vi khuẩn E. ictaluri bằng bộ kit API 20E.  Xác định kết quả định danh bằng phương pháp PCR Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 3 CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh cá Bệnh cá được bắt đầu nghiên cứu từ cuối thế kỷ XIX nhưng cơ bản vẫn mô tả các dấu hiệu lâm sàng. Sang đầu thế ký XX các nhà khoa học thế giới đã bắt đầu nghiên cứu các triệu chứng cũng như tác nhân gây bệnh trên cá. Năm 1904, Bruno Hofer người Đức đã viết cuốn sách “Father of fish Pathology” (Bùi Quang Tề, 2006). Viện sĩ V.A. Dogiel thuộc viện hàn lâm khoa học Liên Xô cũ là người có công lớn khi viết phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng trên cá (1929), mở đầu cho việc nghiên cứu ký sinh trùng trên cá. Năm 1939 ông cũng cho xuất bản quyển “Bacterial Disease of Fish”. Những năm 1930 bệnh truyền nhiễm của cá đã được nghiên cứu trong các phòng thí nghiệm. Năm 1949 nhà khoa học người Liên Xô E. M. Lyaiman cho xuất bản sách giáo khoa về bệnh cá (Bùi Quang Tề, 2006). Kết quả nghiên cứu các tác nhân gây bệnh trên động vật thủy sản đến nay rất phong phú, bệnh virút của cá đến nay đã phân loại được hơn 60 loại virút thuộc 5 họ có cấu trúc ADN hoặc ARN (Bù Quang Tề, 2006). Ở Việt Nam bộ môn bệnh cá được Hà Ký thành lập năm 1960. Sau đó được đưa vào giảng dạy trong các trường đại học. Từ cuối năm 1960 trở lại đây hàng loạt nghiên cứu về bệnh của động vật thủy sản được tiến hành: Nghiên cứu ký sinh trùng và bệnh của các loài cá nước ngọt miền Bắc Việt Nam của tiến sĩ Hà Ký, 1961- 1967 (Bùi Quang Tề, 2006). Công trình nghiên cứu khu hệ ký sinh trùng của một số loài cá nước ngọt Đồng Bằng Sông Cửu Long của Bùi Quang Tề và ctv,1984-1990 (Trích lược bởi Trần Thị Ngọc Hân, 2006) Nghiên cứu khu hệ ký sinh trùng cá nước ngọt miền Trung và Tây Nguyên của Nguyễn Thị Muội và ctv, 1981- 1985 (Trích lược bởi Trần Thị Ngọc Hân, 2006)…. 2.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh xảy ra trên cá tra ở ĐBSCL Tính từ năm 2006, sản lượng cá tra nuôi ở ĐBSCL đạt 800.000 tấn, xuất khẩu được 292.800 tấn, thu về kim ngạch xuất khẩu 773,64 triệu USD, chiếm 23,4% so với xuất khẩu thủy sản của cả nước. Trong 6 tháng đầu năm 2007, diện tích nuôi cá tra toàn vùng ĐBSCL đã lên đến 3.642 ha, tăng 1.256 ha so Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 4 với năm trước. Từ đó, sản lượng cá tra đạt 380.489 tấn, số lượng cá tra xuất khẩu được 173.100 tấn, đạt kim ngạch xuất khẩu 462,4 triệu USD, tăng 32% về lượng và 38,9% kim ngạch so với năm 2006 (www.fistenet.gov.vn) Tuy nhiên khi mật độ nuôi quá dày nhưng lại không đồng đều về kỹ thuật, môi trường nuôi sẽ bị ô nhiễm tạo điều kiện cho dịch bệnh xảy ra. Dịch bệnh trên cá tra xảy ra quanh năm kể cả mùa khô, mùa mưa, nhưng nặng nhất vào lúc giao mùa, mùa nước đổ, thời tiết thay đổi đột ngột sẽ làm tăng tần số xuất hiện bệnh. Theo Từ Thanh Dung và ctv (2004) thì tần số xuất hiện bệnh trên động vật thủy sản là vi khuẩn (50,9%), virút (24,6%), ký sinh trùng (21,1%), nấm (3,4%) (trích dẫn bởi Lê Phú Khởi, 2006). Cũng theo điều tra của Lê Phú Khởi (2006) tại An Giang đã ghi nhận được một số bệnh xuất hiện trên cá tra với tần suất khác nhau từ năm 2004 trở lại đây là: bệnh đốm đỏ, mủ gan, ký sinh trùng, thối đuôi, vàng da, đường ruột, nổ mắt, tuột nhớt, rong bè (bỏ ăn), sưng thận, nấm, thối mang. Trong đó 3 bệnh là gan có mủ, đốm đỏ và ký sinh trùng xảy ra với tần suất cao nhất. Kết quả này cũng phù hợp với điều tra của Nguyễn Chính (2005) là tình hình bệnh trên cá tra nhìn chung chưa thấy phát sinh bệnh mới mặc dù tỉ lệ cảm nhiễm và cường độ cảm nhiễm ngày càng cao hơn. 2.3 Vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trên cá da trơn 2.3.1 Bệnh xuất huyết Vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh xuất huyết được phân lập đầu tiên trên cá nheo Mỹ bởi Hawke (1979). Năm 1999, Austin đã phát hiện ra vi khuẩn này gây bệnh nhiễm trùng máu cấp tính (enteric septicemia of catfish - ESC) trên cá nheo mỹ, gây thiệt hại lớn cho ngành công nghiệp nuôi cá nheo (Hawke và ctv,1998). Plumb, 1999 cho biết bệnh do vi khuẩn E. ictaluri xảy ra trên cá trơn vào mùa có nhiệt độ thấp. Trên cá nheo, bệnh ESC thường xảy ra vào cuối mùa xuân đến đầu mùa hè và trong suốt mùa thu khi nhiệt độ nước khoảng 18 - 28C. Theo mô tả của Inglis và ctv (1993), khi cá bị bệnh trên đầu xuất hiện những vết loét, cá bơi lờ đờ trên mặt nước, bơi xoay tròn với tư thế đầu trên đuôi dưới, sưng tấy ở da, miệng, nắp mang và bụng, phù mắt. Bên trong xoang bụng có chất dịch màu vàng, thận và tỳ tạng sưng to, quan sát mô và các cơ quan có hiện tượng xuất huyết, đặc biệt là có những đốm trắng ở gan. Bệnh này bên cạnh xuất hiện trên cá nheo nuôi ở miền Đông Nam Mỹ, thì bệnh cũng được tìm thấy ở Indiana, Idaho, California, Arizona và New Mexico. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 5 Ngoài cá nheo, các loài blue catfish (Ictalurus furcatus), white catfish (Ictalurus melas) cũng nhạy cảm với E. ictaluri (Plumb và Sanchez, 1983) và theo ghi nhận của Kasornchandra và ctv (1987) thì vi khuẩn này cũng được tìm thấy trên cá trê trắng (Clarias batrachus) ở Thái Lan. Hawke và ctv (1998) mô tả đặc điểm của vi khuẩn E. ictaluri là loài vi khuẩn thuộc nhóm Enterobacteriaceace, vi khuẩn Gram âm, di động yếu ở 25-30 C, ở nhiệt độ cao hơn không di động, H2S và indole âm tính, có khả năng lên men O/F, phát triển chậm trên môi trường thạch, trên môi trường BHI (brain heart infusion) sau 36 - 48 giờ ở 28 - 30C hình thành khuẩn lạc nhỏ, không phát triển ở 37C (Plumb, 1999). Năm 1986, Shotts và ctv tiếp tục nghiên cứu về đặc điểm sinh hoá của vi khuẩn E. ictaluri, ngoài các đặc điểm trên thì vi khuẩn này còn cho phản ứng cytochrome oxidase, có khả năng lên men glucose và sinh sản phẩm NO3- từ NO2- (trích dẫn bởi Lê Minh Đương, 2007) Vi khuẩn này tồn tại trong môi trường nước thời gian ngắn hay dài còn tuỳ theo nhiệt độ. Nếu nhiệt độ nước là 5C thì vi khuẩn có thể tồn tại trong ao 15 ngày nhưng khi nhiệt độ nước tăng lên 25C thì thời gian sống của chúng rút ngắn chỉ còn khoảng 10 ngày. Tuy nhiên trong lớp bùn đáy ao vi khuẩn này có thể tồn tại khoảng 15 ngày ở 5C, 45 ngày ở 18C và 95 ngày ở 25C (Plumb 1999) 2.3.2 Bệnh mủ gan trên cá tra Năm 2001, Ferguson và ctv phát hiện đầu tiên bệnh mủ gan trên cá tra nuôi ở ĐBSCL vào cuối năm 1998 và gọi là bệnh BNP (bacillary necrosis of Pangasius). Theo Từ Thanh Dung và ctv (2005) ở Việt Nam, vùng ĐBSCL bệnh mủ gan xuất hiện đầu tiên ở các tỉnh nuôi cá tra thâm canh phát triển mạnh như A