Luận văn Tìm hiểu vai trò của auxin trong sự phát sinh hình thái chồi in vitro từ mô phân sinh ngọn của cây đậu vigna angularis (willd.) ohwi et ohashi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH PHẠM MỸ NGỌC TÌM HIỂU VAI TRÒ CỦA AUXIN TRONG SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI CHỒI IN VITRO TỪ MÔ PHÂN SINH NGỌN CỦA CÂY ĐẬU VIGNA ANGULARIS (WILLD.) OHWI ET OHASHI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS BÙI TRANG VIỆT TS. LÊ THỊ TRUNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2011 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS. TS. Bùi Trang Việt, Trưởng Bộ môn Sinh lý Thực vật Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG Tp. HCM, người đã giảng dạy, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu, tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình học tập và hoàn chỉnh bài luận văn. TS. Lê Thị Trung đã truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để em hoàn thành luận văn. TS. Trần Thanh Hương, Th.S Trần Thị Thanh Hiền, Th.S Phan Ngô Hoang, Th.S Trịnh Cẩm Tú đã tận tình giúp đỡ và đóng góp những ý kiến chân tình, những kinh nghiệm bổ ích cho luận văn của em. Quý thầy cô trong hội đồng đã dành thời gian đọc và đóng góp nhiều ý kiến cho luận văn của em. Ban chủ nhiệm và toàn thể quý thầy cô khoa Sinh Học trường ĐHSP thành phố Hồ Chí Minh. Các bạn cao học khoá 19, CN. Hồ Thị Mỹ Linh (Chuyên viên Phòng thí nghiệm khoa Sinh trường ĐHSP thành phố Hồ Chí Minh) đã động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Em Như (Cao học khoá 18 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh) và các em Huyên, Phước, Quỳnh sinh viên năm thứ IV đang thực hiện đề tài tại Bộ môn Sinh lý Thực vật Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, đã hỗ trợ tôi trong việc tìm kiếm sách và tài liệu tham khảo. MỤC LỤC 7TLỜI CẢM ƠN7T ...................................................................................................................... 1 7TMỤC LỤC7T ............................................................................................................................ 2 7TDANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT7T .................................................................................. 6 7TMỞ ĐẦU7T .............................................................................................................................. 7 7TCHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU7T ............................................................................. 8 7T1.1. Giới thiệu về cây Đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi7T ................................. 8 7T1.1.1. Phân loại học7T ........................................................................................................ 8 7T1.1.2. Mô tả đặc điểm hình thái cây Đậu7T ........................................................................ 8 7T1.2. Sự phát sinh hình thái thực vật7T .................................................................................... 8 7T1.2.1. Khái niệm7T ............................................................................................................. 8 7T1.2.2. Mô phân sinh ngọn chồi7T ....................................................................................... 9 7T1.2.2.1. Đặc điểm7T ....................................................................................................... 9 7T1.2.2.2. Cấu trúc của mô phân sinh ngọn chồi7T .......................................................... 10 7T1.2.2.3. Sự phân bào của mô phân sinh ngọn chồi7T .................................................... 11 7T1.2.3. Hoạt động của mô phân sinh ngọn chồi7T .............................................................. 11 7T1.2.3.1. Trong giai đoạn nảy mầm của hạt và tăng trưởng của cây mầm7T ................... 11 7T1.2.3.2. Trong giai đoạn sinh sản của cây trưởng thành7T ............................................ 12 7T1.2.4. Sự phát triển chồi7T ............................................................................................... 12 7T1.2.4.1. Sự phát triển chồi nách7T ................................................................................ 12 7T1.2.4.2. Sự hình thành và phát triển chồi bất định7T ..................................................... 13 7T1.3. Vai trò của auxin và các chất điều hoà tăng trưởng thực vật trong sự phát sinh hình thái ngọn chồi7T .................................................................................................................. 14 7T1.3.1. Vai trò của auxin7T ................................................................................................ 14 7T1.3.2. Vai trò của cytokinin7T .......................................................................................... 16 7T1.3.3. Sự phối hợp auxin và cytokinin trong phát sinh chồi7T .......................................... 17 7T1.3.3.1. Tăng sinh chồi bên7T ...................................................................................... 17 7T1.3.3.3. Sự hình thành rễ7T .......................................................................................... 18 7TCHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP7T .............................................................. 19 7T2.1.Vật liệu7T ...................................................................................................................... 19 7T2.2.Phương pháp7T .............................................................................................................. 19 7T2.2.1.Quan sát sự tăng trưởng cây Đậu đỏ Vigna angularis ở trong vườn7T ..................... 19 7T2.2.2.Khử trùng hạt7T ...................................................................................................... 19 7T2.2.3. Ảnh hưởng của AIA theo nồng độ lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu đỏ7T ......................................................................................................................... 19 7T2.2.4. Ảnh hưởng của AIA 2 mg/l theo thời gian lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu đỏ7T ........................................................................................................... 20 7T2.2.5. Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái chồi7T ..................... 21 7T2.2.5.1. Ảnh hưởng của BA riêng rẽ lên sự phát triển của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu đỏ in vitro 6 ngày tuổi7T .............................................................................................. 21 7T2.2.5.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa AIA 2 mg/l và BA theo thời gian lên sự tăng sinh và tăng trưởng chồi7T ........................................................................................... 21 7T2.2.6. Quan sát hình thái giải phẫu7T ............................................................................... 22 7T2.2.7. Đo cường độ quang hợp và cường độ hô hấp7T ..................................................... 23 7T2.2.8. Đo hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng thực vật7T ........................................... 23 7T2.2.9.Xử lý số liệu7T ........................................................................................................ 23 7TCHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN7T .................................................................... 24 7T3.1. Kết quả7T ...................................................................................................................... 24 7T3.1.1. Quan sát sự tăng trưởng của cây trong vườn7T ....................................................... 24 7T3.1.2. Nuôi cấy hạt để tạo cây in vitro trên môi trường MS7T .......................................... 26 7T3.1.3. Sự phát triển chồi mầm7T ...................................................................................... 26 7T3.1.3.1. Trong giai đoạn hạt nảy mầm7T ...................................................................... 26 7T3.1.3.2. Sự thay đổi trọng lượng tươi và trọng lượng khô theo thời gian từ giai đoạn hạt đến cây mầm 5 ngày tuổi7T .................................................................................... 27 7T3.1.3.3. Ảnh hưởng của các chất điều hoà tăng trưởng thực vật lên sự phát triển chồi mầm7T ......................................................................................................................... 28 7T3.1.4. Các biến đổi hình thái của mô phân sinh ngọn chồi trong quá trình phát sinh chồi7T ..................................................................................................................................... 30 7T3.1.5. Sự phát triển chồi nách từ cây in vitro và cây trong vườn7T ................................... 33 7T3.1.5.1. Sự phát triển chồi nách từ nách tử diệp của cây in vitro7T ............................... 33 7T3.1.5.2. Sự phát triển chồi nách từ nách lá của cây in vitro và cây trong vườn7T .......... 33 7T3.1.6. Quan sát hình thái giải phẫu của chồi nách7T ......................................................... 36 7T3.1.7. Ảnh hưởng của AIA theo nồng độ lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu đỏ7T ......................................................................................................................... 45 7T3.1.8. Ảnh hưởng của AIA 2 mg/l theo thời gian lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu đỏ7T ........................................................................................................... 47 7T3.1.8.1. Khảo sát sự tăng trưởng chồi trên môi trường AIA 2 mg/l và sau đó chuyển sang môi trưòng MS theo thời gian7T .......................................................................... 47 7T3.1.8.2. Khảo sát sự tăng trưởng chồi trên môi trường MS và sau đó chuyển sang môi trưòng AIA 2 mg/l theo thời gian7T ............................................................................ 51 7T3.1.9. Sự thay đổi cường độ quang hợp và hô hấp của chồi ngọn sau khi xử lý AIA 2 mg/l theo thời gian7T ....................................................................................................... 54 7T3.1.10. Hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng thực vật nội sinh trong quá trình tăng trưởng chồi7T ................................................................................................................... 55 7T3.1.11. Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái chồi7T ................... 57 7T3.1.11.1. Ảnh hưởng của BA riêng rẽ lên sự phát triển của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu đỏ in vitro 6 ngày tuổi7T ....................................................................................... 57 7T3.1.11.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa AIA 2 mg/l với BA theo thời gian lên sự tăng sinh và tăng trưởng chồi7T ................................................................................... 62 7T3.2. Thảo luận7T .................................................................................................................... 1 7TCHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ7T ......................................................................... 12 7T4.1. Kết luận7T..................................................................................................................... 12 7T4.2. Đề nghị7T ..................................................................................................................... 12 7T ÀI LIỆU THAM KHẢO7T ................................................................................................. 14 7TPHỤ LỤC7T ........................................................................................................................... 18 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA : Abcisic acid AIA : Acetic indol acid BA : Benzyl Adenin CĐHTTTV : Chất điều hoà tăng trưởng thực vật GR1 R : ( G : gap, khoảng gián đoạn) - Tế bào ở trạng thái trưởng thành GAR3R : Giberelic acid IBA : Indol Butyric acid MS : Murashige và Skoog TLT : Trọng lượng tươi TLK : Trọng lượng khô cs : cộng sự MỞ ĐẦU Phát sinh hình thái là cơ sở cho việc vi nhân giống thực vật mà hiện nay đang rất được quan tâm. Sự phát sinh hình thái thực vật liên quan tới sự phát sinh liên tục mô và cơ quan mới ở thực vật nhờ hoạt động của các nhóm tế bào gốc không phân hóa (undifferentiated stem cells) được gọi là mô phân sinh. Hơn nữa, kiểm soát hoạt động của mô phân sinh ngọn chồi ở mức phân tử dưới tác động của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật, đặc biệt là auxin và cytokinin, gần đây được nghiên cứu bởi nhiều tác giả. Do đó, đề tài tập trung nghiên cứu trên cây Đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi, rất thông dụng ở Việt Nam, để hiểu về hoạt động của mô phân sinh ngọn chồi dưới tác động của auxin riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin. Việc khảo sát ảnh hưởng của auxin lên sự phát sinh hình thái chồi ở cây Đậu được thực hiện dưới các khía cạnh hình thái học và sinh lý học, qua đó bổ sung thêm kiến thức phục vụ cho công tác nghiên cứu, ứng dụng trong sự vi nhân giống và giảng dạy. Ảnh 1.1. Cây Đậu đỏ Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi ( sp?param=news&newsid=934) CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây Đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi 1.1.1. Phân loại học Cây Đậu được dùng trong đề tài này là cây Đậu đỏ, được phân loại như sau: Ngành : 7TMagnoliophyta7T Lớp : 7TMagnoliopsida7T Bộ : 7TFabales7T Họ : 7TFabaceae7T Chi : 5TVigna 5TLoài : 5TVigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi (Phạm Hoàng Hộ, 1999) 1.1.2. Mô tả đặc điểm hình thái cây Đậu Cây Đậu đỏ (adzuki bean) là loại cỏ nhất niên, đứng hay leo. Cây có chiều cao trung bình 50-80 cm, có cạnh và lông dài. Cuống lá dài 10-12 cm, có lông. Lá thường có hình xoan, đầu tròn, có thùy, dài 6-8 cm và có lông. Mỗi lá gồm 4-5 cặp gân phụ. Hoa mọc thành chùm ở nách lá, dài 3-10 cm, có màu vàng nhạt. Đài hoa có 5 răng ngắn. Trái dài 6-10 cm và rộng 0,7 cm, có chót nhọn. Hột dài 6-10 mm, có màu nâu. Bộ nhiễm sắc thể của Đậu đỏ 2n = 22. Cây Đậu đỏ được trồng nhiều ở Nha Trang, Sài Gòn, và được trồng để lấy hạt. Công dụng của cây Đậu đỏ : rễ dùng để đắp trị sưng; hột giúp lợi tiểu, trị kiết (Phạm Hoàng Hộ, 1999). 1.2. Sự phát sinh hình thái thực vật 1.2.1. Khái niệm Sự phát sinh hình thái thực vật là sự phát triển cơ thể thực vật theo thời gian để hoàn tất chu trình phát triển. Phát triển chỉ những thay đổi của tế bào, mô hay cơ quan từ lúc khởi đầu cho đến lúc trưởng thành. Phát sinh hình thái thực vật bao gồm phát sinh mô (histogenesis), phát sinh cơ quan (organogenesis) và phát sinh phôi (embryogenesis) (Bùi Trang Việt, 2000). Trong sự phát sinh cơ quan in vitro, có thể tạo các cơ quan theo con đường phát sinh cơ quan trực tiếp (các cơ quan tạo ra trực tiếp từ mẫu cấy) hay gián tiếp (mẫu cấy tạo mô sẹo, sau đó các cơ quan tạo ra từ mô sẹo này) (Bùi Trang Việt, 2000). Sự phát sinh hình thái thực vật tùy thuộc hai quá trình căn bản sau: - Sự điều hoà hướng kéo dài tế bào. - Sự kiểm soát vị trí và hướng của mặt phẳng phân chia của tế bào. Chính kiểu tăng trưởng của mọi tế bào riêng rẽ quyết định hình thái của cơ quan và cơ thể thực vật (Bùi Trang Việt, 2000). Sự phát triển ở mức tế bào thể hiện qua hai chuỗi thay đổi: tăng trưởng (phân chia và kéo dài tế bào) và phân hóa tế bào. Ở thực vật, sự phân chia và kéo dài tế bào tách biệt nhau theo không gian và thời gian (Bùi Trang Việt, 2000). Môn phát sinh hình thái là môn học nhằm mô tả các biến đổi hình thái và cấu trúc, phân tích các yếu tố nội sinh và ngoại sinh, và nghiên cứu sự điều hòa hình thái thực vật. Sự phát sinh hình thái liên quan một cách toàn diện đến nguồn gốc và sự phát triển hình thái thực vật. Do đó, không có một kỹ thuật hay phương pháp riêng rẽ nào có thể chứng minh được tất cả mọi khía cạnh của nó. Những kỹ thuật của nhiều lĩnh vực khác nhau như mô học, giải phẫu học, sinh lý học, tế bào học và di truyền học đều có thể giúp tìm hiểu hiện tượng phát sinh hình thái. Trong số các phương pháp thực nghiệm, hai phương pháp được dùng nhiều nhất là: - Cắt bỏ một vùng lân cận của mô phân sinh và theo dõi các biến đổi phát triển sau đó. - Nuôi cấy in vitro trong điều kiện vô trùng và có kiểm soát các phần tách rời của một cơ thể thực vật. Trong các thí nghiệm in vitro, các nghiên cứu sinh lý học thường khó tiến hành do kích thước quá nhỏ bé của các loại mô cấy, nên sự áp dụng các chất điều hoà sinh trưởng thực vật ngoại sinh là cách hữu hiệu để tìm hiểu về sự phát sinh hình thái thực vật (Bùi Trang Việt, 2000). Sự phát sinh hình thái thực vật liên quan tới sự phát sinh liên tục mô và cơ quan mới ở thực vật nhờ hoạt động của các nhóm tế bào gốc không phân hóa (undifferentiated stem cells) được gọi là mô phân sinh (Vernoux và cs, 2010). 1.2.2. Mô phân sinh ngọn chồi 1.2.2.1. Đặc điểm Các mô phân sinh là những vùng riêng biệt luôn hiện diện trong đời sống thực vật. Các tế bào ở vùng mô phân sinh có khả năng phân chia không ngừng, tế bào nhỏ, xếp sát nhau và không có khoảng gian bào. Tế bào chất của tế bào mô phân sinh có độ nhớt cao, có nhiều không bào nhỏ li ti, số lượng các bào quan (ribosome, ty thể, lạp thể) nhiều. Nhân lớn chiếm vị trí trung tâm. Như vậy, cấu tạo của tế bào mô phân sinh nói lên hoạt tính sinh lý cao của chúng (Bùi Trang Việt, 2000). Mô phân sinh là cơ sở hình thành các mô vĩnh viễn. Nhờ hoạt động của mô phân sinh mà cây sinh trưởng và phát triển. Trong quá trình sinh phôi, mô phân sinh ngọn chồi phát triển ở vùng giữa hai sơ khởi lá mầm (đối với cây hai lá mầm) hay ở gốc của thuẫn (đối với cây một lá mầm). Mô phân sinh ngọn chồi có đường kính 100 – 200 mµ (Bùi Trang Việt, 2000). Khi cây trưởng thành, mô phân sinh ngọn nằm ở ngọn của chồi chính, chồi bên của thân và ở ngọn rễ. Các mô phân sinh ngọn hoạt động phân chia suốt cả đời sống của cây, giúp cây dài ra (Nguyễn Như Khanh, 2009). 1.2.2.2. Cấu trúc của mô phân sinh ngọn chồi Có nhiều quan điểm về tổ chức của mô phân sinh ngọn chồi, trong đó quan điểm thường gặp nhất là sự tổ chức của mô phân sinh ngọn chồi thành các vùng hay lớp phân biệt (Esau, 1967). Mô phân sinh ngọn chồi Arabidopsis có ba lớp: L1, L2, và L3. L1 là lớp ngoài cùng (lớp ngoại vi), L2 là lớp bên trong lớp ngoại vi. L1 và L2 tạo nên vỏ. L3 là lớp thể và ở giữa là vùng đỉnh. Vỏ cho các lớp biểu bì và dưới biểu bì của thân và lá. Một số ít tế bào từ các phân chia trong vỏ và thể cho sơ khởi lá, thân, nụ nách và các bộ phận của hoa (nếu là nụ hoa) (Bùi Trang Việt, 2000). Nếu chia mô phân sinh ngọn chồi theo vùng thì mô phân sinh ngọn chồi được chia thành ba vùng chính: - Vùng đỉnh (vùng mô phân sinh chờ) chứa các tế bào có không bào lớn, tế bào chất chứa ít rRNA, chu kì tế bào rất dài, hoạt tính phân chia thấp, tế bào chủ yếu ở pha GR1R. Vùng này còn được gọi là mô phân sinh chờ vì chúng chỉ hoạt động khi mô phân sinh ngọn chuyển sang trạng thái sinh sản. - Vùng bên (vùng khởi sinh, hay vùng phát sinh cơ quan) chứa các tế bào nhỏ hơn với không bào nhỏ, giàu rRNA, có hoạt tính phân chia cao. Chu kì tế bào (pha GR1R) ngắn. Đây là vùng phát sinh lá và các mô của thân (bao gồm các mô dẫn). - Vùng lõi (vùng phát sinh mô) nằm dưới vùng đỉnh, chứa các tế bào có không bào lớn, hàm lượng rRNA ít hơn so với vùng đỉnh, hoạt tính phân chia và chu kì phân chia tế bào của vùng này ở mức trung gian so với vùng đỉnh và vùng bên (Bùi Trang Việt, 2000; Taiz và Zeiger, 2002). Vùng lõi là vùng phát sinh mô lõi của thân trong khi các cơ quan khác đều xuất phát từ vùng bên (Esau, 1967). Theo một cách phân chia khác, tổ chức mô phân sinh ngọn chồi gồm tunica (vỏ) và corpus (thể). Ở Arabidopsis và hầu hết cây hai lá mầm, tunica gồm lớp L1 bao phủ phía ngoài mô phân sinh ngọn chồi và lớp L2 nằm ngay dưới lớp L1. Corpus (được gọi là L3) không phải là một lớp tế bào đơn lẻ mà là nhóm các tế bào ngay dưới tunica (Evert, 2006). 1.2.2.3. Sự phân bào của mô phân sinh ngọn chồi Các tế bào ở lớp áo bọc ngoài hay tunica (hai hay ba lớp) xếp đều dặn, bao quanh các tế bào trung tâm, và phân