Luận văn Ứng dụng HPLC ghép đầu dò điện hóa và diode array (hplc-Ecd-dad) để xác định hệ số hấp thu phân tử và định lượng anthocyanin trong dịch trích thực vật

1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 VAI TRÒ CỦA CHẤT CHỐNG OXI HÓA1: Trong cơ thể con người thường xuyên diễn ra nhiều hoạt động hoặc xây dựng hoặc huỷ hoại. Có những chất tưởng như là thực phẩm chính của tế bào nhưng đồng thời cũng lại làm hại tế bào. Có những phân tử gây ra tổn thương thì cũng có những chất đề kháng lại hành động phá phách này. Gốc tự do, oxygen và chất chống oxy hóa là một thí dụ. Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh. Chúng tấn công lên các phân tử protein, lipid, DNA… dẫn đến các căn bệnh nan y như thoái hóa thần kinh, ung thư, tim mạch, tiểu đường, gút… Vì vậy chế độ ăn nhiều rau quả và ít cholesterol sẽ làm giảm ung thư, kìm hãm và giảm các gốc tự do. Các chất chống oxi hóa từ trái cây giúp bảo vệ, ngăn cản quá trình oxi hóa. Để chống lại tác hại lớn do các gốc tự do gây ra, cơ thể con người được trang bị một hệ thống các chất chống oxi hóa. Chất chống oxi hóa là các chất có khả năng ngăn ngừa, chống lại và loại bỏ tác dụng độc hại của các gốc tự do trực tiếp hoặc gián tiếp. Chất chống oxi hóa có thể phản ứng trực tiếp với gốc tự do hoạt động, tạo ra những gốc mới kém hoạt động hơn, ngăn cản các chuỗi phản ứng dây chuyền do gốc tự do khơi mào. . . 2 . . HO Anthocyanin H H O Anthocyanin ROO Anthocyanin H ROOH Anthocyanin         Chất chống oxi hóa cũng có thể tạo phức gián tiếp với ion kim loại chuyển tiếp, ức chế enzyme xúc tác trong phản ứng sinh gốc tự do nhằm ngăn sự hình thành gốc tự do trong cơ thể. Để trở thành 1 chất chống oxi hóa cần thỏa 2 điều kiện:  Khi hiện diện ở nồng độ thấp (bằng chất nền) nó có thể trì hoãn hoặc ngăn chặn sự tự oxi hóa hoặc sự oxi hóa các gốc tự do trung gian.  Các gốc tự do hình thành sau khi lọc bỏ phải ổn định, qua liên kết hidro nội phân tử ở quá trình oxi hóa tiếp theo. Chất chống oxi hóa giữ các gốc tự do ở một nồng độ thấp, cho phép chúng thực hiện các chức năng sinh học hữu ích mà không gây ra tổn hại nào2,3. 2 Nghiên cứu gần đây cho rằng flavonoid và polyphenol có trong trái cây, hoa quả đóng góp đáng kể vào khả năng chống oxi hóa. Tiêu thụ thường xuyên các polyphenol làm tăng tuổi thọ vì giúp làm giảm sự kích động và giảm bệnh tim mạch. Ước tính mỗi ngày chúng ta tiêu thụ từ vài trăm miligram tới một gram flavonoid. Anthocyanin là những polyphenol thuộc nhóm flavonoid, có hoạt tính chống oxi hóa do có các nhóm OH trên vòng thơm. Tính chất hóa học của polyphenol, hay khả năng của hydrogen phenolic, chính là hoạt động chống oxi hóa, chúng làm sạch các gốc tự do bằng phản ứng cho nguyên tử hydrogen phenolic trên vòng thơm, khi đó phenol trở thành gốc phenoxyl. 1.2 GIỚI THIỆU VỀ NHÓM ANTHOCYANIN2,4,5 1.2.1 Cấu trúc của nhóm anthocyanin Anthocyanidin là cấu trúc cơ bản của anthocyanin. Anthocyanidin (aglycon) gồm vòng A liên kết với nhân dị vòng C chứa oxi, vòng C liên kết C-C với vòng thơm B. Khi anthocyanidin ở dạng glycoside (liên kết với đường), chúng được gọi là anthocyanin. O+ R1 OH OH OH R3 O O HO HO OH CH2OH B A C Anthocyanin R1 R2 Cyanidin-3-glu -OH -H Delphinidin-3-glu -OH -OH Pelargonidin-3-glu -H -H Malvidin-3-glu -OCH3 -OCH3 Peonidin-3-glu -OCH3 -H Petunidin-3-glu -OH -OCH3 Hình 1: Cấu trúc các anthocyanin thường gặp. 3 Sự phân bố các anthocyanidin trong rau quả như sau: Cy 50%, Dp 12%, Pg 12%, Pn 12%, Pt 7% và Mv 7%. Các dẫn xuất glycoside hiện diện ở dạng 3- monoside, 3- bioside, 3,5- và 3,7-diglucoside. 3-glucoside có nhiều hơn 2.5 lần so với 3,5-diglucoside, cyanidin-3-glucoside là loại anthocyanin phổ biến nhất 6. 1.2.2 Tính chất của các anthocyanin6,7  Độ ổn định: Các anthocyanin dễ bị phân hủy. Độ ổn định của anthocyanin phụ thuộc pH, nhiệt độ lưu trữ, cấu trúc hóa học, nồng độ, ánh sáng, oxygen, dung môi, sự hiện diện các enzyme, flavonoid, protein và các ion kim loại. Tùy vào pH mà anthocyanin có thể tồn tại ở 4 dạng cấu trúc: dạng cation flavylium, baz quinodial, baz carbinol và chalcone. Khi dung dịch ở pH < 3.2, anthocyanin tồn tại chủ yếu ở 2 dạng: cation flavylium và baz quinodial màu đỏ/vàng. Cấu trúc của các anthocyanin thay đổi tùy thuộc vào pH. Hầu như 100% ở dạng cation flavylium khi pH = 1.5, còn khi pH = 2.5 chỉ có khoảng 67% dạng cation. pH tăng làm tăng việc mất proton, chuyển về dạng quinol màu đỏ/xanh. Vòng B cũng ảnh hưởng tới độ ổn định của anthocyanin, các nhóm thế -OH hoặc - OMe làm giảm độ ổn định các aglycon (anthocyanidin) ở môi trường trung tính, vì vậy Pelargonidin có duy nhất một nhóm OH nên ổn định nhất. Trái với aglycon, monoglycoside và hầu hết diglycoside ổn định hơn ở điều kiện pH trung tính. Điều này được giải thích do phân tử đường tránh được sự thoái hóa của các dạng trung gian kém bền thành acid phenolic và aldehyde. O+ R1 R2 OH OH R3 OH B A C 4 Anthocyanidin M (g/mol) Công thức R1 R2 R3 Cyanidin 287.2 C15H11O6+ -OH -OH -H Delphinidin 303.2 C15H11O7+ -OH -OH -OH Pelargonidin 271.2 C15H11O5+ -H -OH -H Malvidin 331.2 C17H15O7+ -OCH3 -OH -OCH3 Peonidin 301.2 C16H13O6+ -OCH3 -OH -H Petunidin 317.2 C16H13O7+ -OH -OH -OCH3 Hình 2: Cấu trúc tổng quát của ion flavilium.  Màu sắc Màu sắc của các anthocyanin thay đổi theo pH môi trường.  pH = 1: màu đỏ của cation flavynium (hình A).  pH = 2 ÷ 4: màu xanh của quinoidal (B và D)  pH = 5 ÷ 6: hai dạng không màu carbinol pseudo baz (E) và chalcone (F)  pH > 7: anthocyanin bị thoái hóa tùy vào các nhóm thế (phản ứng thoái hóa).  pH = 4 ÷ 6: có 4 dạng cấu trúc anthocyanin cùng tồn tại: ion dương flavylium, quinoidal khan (cấu trúc không có nước), carbinol baz không màu và chalcone màu vàng nhạt. Cân bằng giữa các dạng quinoidal baz và carbinol thông qua cation flavylium (cấu trúc D, A và E). Khi pH tăng, dạng baz khan tăng, trong điều kiện acid, dạng ion flavynium màu đỏ là chủ yếu. 5 Hình 3: Các dạng tồn tại của anthocyanin ở các pH khác nhau và phản ứng biến đổi của anthocyanin. R1= H hay saccharide, R2 và R3 = H hoặc methyl8. 1.2.3 Các phương pháp xác định anthocyanin 9 Do số lượng và độ phức tạp của anthocyanin, các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) không thể phân tách tất cả hợp chất phenolic từ hỗn hợp ban đầu và đòi hỏi quá trình chuẩn bị mẫu phức tạp để có thể nghiên cứu được một hợp chất tinh khiết. Hơn nữa số lượng chất chuẩn đáng tin cậy của họ flavonoid rất ít. Tuy nhiên may mắn là thành phần chính của các flavonoid ở lượng đáng kể trong khẩu phần ăn cũng như rau quả ít hơn tổng lượng anthocyanin tồn tại. Anthocyanin thường hiện diện trong mẫu ban đầu dưới dạng hỗn hợp các chất. Do đó cần một bước tách trước khi định danh. Phương pháp được dùng nhiều nhất để tách và xác định anthocyanin trong trái cây là phương pháp sắc ký lỏng pha đảo. Anthocyanin có thể hấp thu ánh sáng tử ngoại và khả kiến nên phương pháp HPLC kết hợp với đầu dò UV/Vis giúp phân tách hiệu quả các nhóm mang màu, cung cấp thông tin về bản chất các aglycone. Đầu dò này giúp thu phổ của 6 anthocyanin trong quá trình phân tích sắc ký. Phổ hấp thu có thể giúp nhận danh 1 hợp chất nếu chúng được phân giải tốt và nếu có sẵn chuẩn để so sánh. Tuy nhiên, có rất nhiều anthocyanin trong tự nhiên và một số có thời gian lưu giống nhau và phổ hấp thu phức tạp, điều này gây khó khăn trong việc nhận danh nếu chỉ dùng phương pháp HPLC đầu dò DAD. Do đó khi sử dụng phương pháp này ghép với một số kĩ thuật khác sẽ làm tăng độ chính xác. Một trong các kỹ thuật này là sử dụng khối phổ MSn ghép với HPLC- DAD để định danh anthocyanin trong mẫu ban đầu (hoa, quả, lá cây…). Khối phổ ứng với mỗi peak cho thấy tỉ lệ m/z của ion phân tử và MSn chỉ ra các mảnh vỡ, giúp cung cấp chính xác các thông tin về aglycone cũng như các nhóm thế. Ngoài ra do anthocyanin có hoạt tính điện hóa nên có thể sử dụng đầu dò điện hóa ECD thay cho đầu dò DAD để làm tăng độ nhạy và độ chọn lọc, giới hạn phát hiện thấp. Các anthocyanin được tách bởi HPLC tới bề mặt điện cực, tại đây phản ứng trao đổi điện tử sẽ xảy ra, dòng sinh ra tỉ lệ với nồng độ của chúng. Bên cạnh đó, ta có thể sử dụng thêm phương pháp vol-ampe để định rõ đặc điểm của các chất chống oxi hóa hoạt động như một tác nhân khử trên bề mặt điện cực trơ. Với mong muốn nghiên cứu về cấu trúc, màu sắc và sự phân bố của các anthocyanin trong rau quả, trong đề tài này, bước đầu chúng tôi tiến hành thiết lập phương pháp xác định hệ số hấp thu phân tử  và nồng độ của các anthocyanin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp đầu dò UV/Vis ghép đầu dò điện hóa ECD, từ đó áp dụng xác định cấu trúc cơ bản của aglycone trong dịch trích các cây Lobelia Cardinalis, Hygrophila Polysperma, Oxalis Natans (có nguồn gốc từ Đan Mạch) bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ LC-UV/Vis-MS3. 7 CHƯƠNG 2: NGUỒN GỐC CÁC LOẠI CÂY10 2.1 LOBELIA CARDINALIS Họ: Lobeliaceae. Nguồn gốc: Lobelia được đặt tên sau tên nhà sinh vật học M. de l’ Obel (1538- 1616), cardinalis: là màu đỏ thắm sáng, tức là màu của bông hoa. Phân bố: ở trung tâm và phía tây của Nam Mỹ. Mô tả: Lobelia thuộc loại cây vùng đầm lầy, cao hơn 1m, cuống thẳng đứng, mập, dầy 0.2 - 3 cm, màu xanh oliu hoặc màu đỏ rượu. Lá dạng so le, đuôi lá dài 1 - 4cm. Phiến lá hình elip rất hẹp, dài 18cm, rộng 4cm, rũ xuống phía dưới và bén ở phần đỉnh lá. Rìa lá khía tai bèo răng cưa. Phiến lá chìm dưới nước có hình chữ nhật hoặc giọt nước hẹp, dài 11cm rộng 4.5cm, nhưng thường nhỏ hơn, có đỉnh tròn hơi xanh. Phần rìa hơi khía tai bèo. Cụm hoa là 1 chùm dài tới 20cm với nhiều hoa sáng đỏ chụm lại về 1 bên; 5 lá đài dài 1cm. Tràng hoa có 2 môi dài 2cm, môi dưới có 3 thùy con, môi trên 2 thùy lá. 5 nhị hoa hợp sinh để tạo ống, nhô ra khoải tràng hoa. Không có trái. Cách trồng: do khả năng tồn tại tốt, Lobelia Cardinalis được xem là loại thực vật thủy sinh phổ biến. Loại phát triển chậm ít thỏa mãn được các điều kiện về nhiệt độ dưới nước (thường 22-26oC). Tùy cường độ ánh sáng, các loại thực vật yếu hoặc mạnh hơn sẽ phát triển. Trong những hồ rộng, nó dùng để trang trí nếu cành giâm được trồng thành hàng chéo từ trước đến sau. Cũng có thể trồng ở rìa hồ để trang trí. Loại này không chịu được rét. Sinh thái học: Lobelia cardinalis sống trên sông hồ đầm lầy. Cây ra hoa trong môi trường tự nhiên từ tháng 7 tới tháng 9. 8 Hình 4: Lobelia L. dortmanna (a) (1cm), hoa nhìn từ 1 phía (b) (5mm), L. alsinoides (c) (1cm), L.concolor (d) (1cm), trái (e). Hình 5: Lobelia cardinalis. 9 Hình 6: Lobelia cardinalis có màu sắc gây chú ý. 2.2 HYGROPHILA POLYSPERMA Họ: Acanthaceae. Tên khác: Justicia polysperma Roxburgh (1832), Ruellia polysperma Wallich, Heliadeplhis polysperma Nees. Phân bố: Ấn độ, Bhutan, Mexico. Mô tả: thuộc loại thực vật đầm lầy quanh năm có rễ sát mặt đất hoặc thẳng đứng, sâu xuống nước 15-20cm, cọng lá không có lông dày 1-2mm. Lá đồng hình một khối cơ bản hoặc dị hình với dạng lông chim hoặc lá dưới nước hình chỉ, hình tuyến tính, nhiều đoạn tòe ra có lá nổi bật và cuống phát triển tốt. Cánh hoa màu trắng hoặc tím, có 5 thùy bằng nhau hoặc 2 môi, môi ngoài lõm đứng thẳng có 2 răng (2 thùy), môi trong 3 thùy. 4 nhị hoa thường là 2 nhị không được sử dụng, chỉ nhị liên kết theo đôi bằng 1 màng mỏng, bao phấn có 2 ngăn, túi phấn không có cựa. Lá chéo chữ thập không có cuống hoặc cuống ngắn. Phiến lá hình elip rất hẹp, dài 7cm và rộng 1.5cm, mềm có màu xanh nhẹ, xanh vàng hoặc hơi nâu. Chồi đâm ra với các đốt giữa ngắn, lá thấp dài khoảng 1cm rộng 0.5cm có lông tơ, nhỏ dần khi lên trên đỉnh. Cụm hoa dài 5 - 10cm với nhiều hoa bé có trục đơn; 2 lá bắc 5  1mm, lông tơ; 5 lá đài lông tơ dài 5 - 6mm rộng không lớn hơn 0,5mm. Tràng hoa có hình thuôn ít hơn đài hoa, 2 môi, màu trắng hoặc tím xanh nhạt, môi trên có 2 thùy con, môi dưới 3 thùy, 2 nhị. Không thấy có hạt. 10 Cách trồng: Hygrophila Polysperma là thực vật thủy sinh điển hình nhất thích hợp với những điều kiện dưới nước mà các loại thực vật khác không thể thích hợp. Chúng phát triển trong vùng nước mềm (ít Ca Mg) nhiệt độ khoảng 22 tới 28oC. Dưới ánh sáng cường độ cao, phần đỉnh chồi sẽ phát triển. Khi ánh sáng yếu thực vật cũng vẫn phát triển bình thường nhưng chậm hơn, chồi nhỏ hơn nên ít đẹp. Bề mặt hồ chỉ có vai trò phụ trong việc cung cấp chất dinh dưỡng cho cây. Việc thêm CO2 vào hồ làm màu mỡ và giúp phát triển hệ sinh thái nhưng không cần thiết cho Hygrophila Polysperma. Đây là loại cây sống gần hoặc vùng giữa hồ. Rễ cần tỉa gọn gàng mỗi 2-4 tuần vì chúng phát triển rất nhanh. Hygrophila Polysperma thích hợp trồng trong loại hồ mới. Hoa nở rất hiếm khi có chồi. Sinh thái học: Hầu như không có tài liệu nào đề cập tới sinh thái học của Hygrophila Polysperma. Ở phía bắc Mexico, kênh đào Laguna Media Luna là nơi Hygrophilia Polysperma được tìm thấy với các điều kiện rất khắc nghiệt: nhiệt độ của nước 29oC, pH 7.9, GH 55odH, KH 12odH. Chúng phát triển dưới nước và ra hoa. Hình 7: Hygrophila Polysperma a, cụm hoa, b, đỉnh chồi, c, đỉnh chồi thể hiện sự thay đổi ở dạng lá. 11 Hình 8: Hygrophilia Polysperma. 2.3 OXALIS NATANS Hình 9: Oxalis Natans (a) ống dạng nhị (1mm), (b) bầu nhụy hoa, (c) thân và hoa Họ: thuộc họ Oxalisdaceae, có xấp xỉ 900 loài trong họ Oxalidaceae. 12 Phân bố: xuất hiện ở vùng nhiệt đới và những vùng khí hậu ôn hòa, thường là có khắp nơi trên thế giới trừ những vùng thuộc các cực của trái đất. Có 800 loại, 2 loại sống dưới nước: Oxalis Disticha và Oxalix Natans ở nam mỹ, khoảng 270 loài ở Nam Phi, chúng rất đa dạng ở Brazil, Mexico. Mô tả: phiến lá hình tim gắn ở đầu của cuống dài, những loại cây này thường sống khoảng 1 đến 2 năm. Lá chia ra 3 đến 10 lá hình bầu dục, sắp xếp theo hình chân vịt cùng kích cỡ. Các chủng loại chính có 3 lá chét, một số loài có thể thay đổi nhanh về hình dạng lá khi ánh sáng cường độ quá mạnh. Hoa có 5 cánh và 10 nhị, màu sắc thay đổi từ trắng, hồng, đỏ hoặc vàng. Màu sắc của cây cùng với việc sử dụng lá cây như một thực phẩm giàu dinh dưỡng, Oxalis Natans hứa hẹn là loại phẩm màu tự nhiên thay thế cho màu nhân tạo. Cách trồng: Oxalis Natans không sống ở nhiệt độ quá thấp, chúng không là cây quanh năm, khi trồng từ hạt hoặc rễ thường trồng vào mùa xuân, nếu trồng bên ngoài thì dùng đất chua, tưới nhiều nước. Chúng phát triển dễ dàng và ra hoa nhiều năm. Khi có bóng râm lá sẽ phát triển cao hơn, hoa xòe lớn hơn. Sinh thái học: chủng loại Oxalis Natans xuất hiện ở Savanna và Grassland Bione, ở đây vào mùa hè thường có mưa. Môi trường sống biến đổi từ vùng đồng cỏ, rừng, đất ẩm đến những vùng có đất đá sỏi. 13 CHƯƠNG 3: TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG11 3.1 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) HPLC là một phương pháp tách và phân tích các hợp chất được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất hiện nay vì nhiều lí do: có độ nhạy tương đối cao, có khả năng định lượng tốt, thích hợp cho việc tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ bị phân hủy nhiệt, có phạm vi ứng dụng trải rộng trong nhiều lĩnh vực từ nghiên cứu khoa học trong các phòng thí nghiệm đến công nghiệp và một số lĩnh vực khác. Hợp chất có thể phân tích bằng sắc ký lỏng như acid amin, protein, acid nucleic, hydrocacbon, carbohydrate, thuốc kháng sinh, thuốc trừ sâu, các hợp chất vô cơ… Dựa vào sự khác nhau về cơ chế chiết tách sử dụng trong sắc ký lỏng hiệu năng cao mà người ta có thể phân chia nó ra làm các loại: sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký ion, sắc ký rây phân tử… trong đó sắc ký phân bố được ứng dụng rộng rãi và phổ biến. Tùy theo độ phân cực pha tĩnh và dung môi pha động, người ta phân biệt: sắc ký lỏng pha thường và sắc ký lỏng pha đảo.  Sắc ký lỏng pha thường: pha tĩnh có độ phân cực cao hơn độ phân cực của dung môi pha động, dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm.  Sắc ký lỏng pha đảo: ngược với sắc ký pha thường, pha tĩnh có độ phân cực thấp, pha động có độ phân cực cao hơn. Phương pháp này dùng để phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực vừa. Dung môi sử dụng là dung môi phân cực, trong đó nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền, do đó sắc ký lỏng pha đảo được sử dụng nhiều nhất. 3.2 CÁC THÔNG SỐ CỦA PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG 12 3.2.1 Hệ số phân bố Cân bằng của một cấu tử trong hệ sắc ký có thể được mô tả bằng phương trình đơn giản sau: A pha động  A pha tĩnh 14 Hệ số cân bằng K cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố và được tính như sau: Cs: nồng độ cấu tử trong pha tĩnh Cm: nồng độ cấu tử trong pha động S: Pha tĩnh M: Pha động K tùy thuộc bản chất pha tĩnh, pha động và chất hòa tan. K nhỏ: chất di chuyển nhanh; K lớn: chất di chuyển chậm. Thông thường K  1 để chất có ái lực với pha tĩnh nếu không thì nó sẽ di chuyển nhanh quá làm cho khó tách. Hai chất muốn tách ra khỏi nhau thì phải có K khác nhau. 3.2.2 Thời gian lưu tR Là thời gian để chất phân tích sau khi tiêm vào cột đến đầu dò được tính theo công thức: tR = t’R + tM tM: thời gian lưu chết của cấu tử không bị giữ lại trên cột, được tính gần đúng theo công thức: 2 M 0,5 ( )t L dc V   trong đó: L: chiều dài cột, cm time M S C CK  15 dc: đường kính cột, cm V: tốc độ dòng pha động, mL/phút Có thể nhận danh chất thông qua thời gian lưu vì trong điều kiện thí nghiệm trên cột thiết bị sắc ký lỏng nhất định, thời gian lưu của chất đó là một đại lượng xác định. Thời gian lưu càng lớn thì hệ số phân bố càng lớn. 3.2.3 Hệ số dung lượng Để mô tả tốc độ lưu của cấu tử phân tích trong cột người ta sử dụng một hệ số quan trọng gọi là hệ số dung lượng k’. Cs.Vs' C .VM M M Vsk K V    Vs: thể tích pha tĩnh Vm: thể tích pha động k' có thể tính theo công thức k’ phải > 1 để peak của chất tan tách khỏi peak của dung môi nhưng không quá lớn vì lúc đó thời gian phân tích sẽ kéo dài và mũi bị tù do chất ở trong cột quá lâu. Khoảng k’ lý tưởng là từ 2 đến 5 nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp chúng ta có thể chấp nhận k’ trong khoảng từ 0,5 đến 20. k’ tăng hoặc giảm tùy thuộc độ mạnh của dung môi pha động. Trong sắc ký phân bố pha đảo ngược, độ mạnh của dung môi tăng theo phần trăm chất hữu cơ. Thông thường trong sắc ký phân bố pha đảo ngược, khi giảm dung môi hữu cơ trong pha động 10% thì k’ sẽ tăng lên gấp 2 đến 3 lần. 3.2.4 Hiệu năng Khi nói đến hiệu năng của cột là nói đến khả năng tách mũi sắc ký của một cấu tử trên cột. Độ hiệu năng N được biểu diễn như số đĩa lý thuyết của cột. N càng lớn hiệu năng tách của cột càng lớn. M MR' t ttk  2 2 1 R 2 R w t5,55 w t16 H LN       16 Với W: bề rộng mũi sắc ký W1/2: bề rộng của mũi ở phân nửa chiều cao Số đĩa lý thuyết càng lớn, bề rộng W càng nhỏ, mũi càng nhọn. 3.2.5 Độ chọn lọc  2 2 2 1 1 1 'α ' R M R R M R K t t t K t t t    Độ chọn lọc  là một thông số rất quan trọng, liên quan tới khả năng tách của các cấu tử cần phân tích, nó tùy thuộc bản chất của pha tĩnh, pha động. Hai chất tách được khi  # 1 và  càng lớn, khả năng tách càng cao. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến độ chọn lọc như thành phần dung môi pha động, pH của môi trường, bản chất của pha tĩnh, nhiệt độ. Trong đó sự thay đổi pha động từ dung môi này sang dung môi khác sẽ làm  thay đổi đáng kể. 3.2.6 Độ phân giải Độ phân giải (Rs) tùy thuộc vào điều kiện pha động, pha tĩnh và đặc tính của hợp chất cần phân tích mà ta có được sắc ký đồ với những mũi phủ lên nhau hoặc tách hẳn nhau. Độ phân giải Rs là một thông số dùng để đánh giá mức độ tách phổ, khả năng tách của các mũi sắc ký sẽ có ý nghĩa quan trọng trong việc phân tích một cách định lượng. Phương trình trên thích hợp cho việc tính Rs khi 2 mũi tách hẳn nhau (Rs  1,5). Trong trường hợp Rs nhỏ hơn, tức mũi bị trùng lấp thì việc xác định W1 và W2 sẽ khó khăn hơn là W1/2(1) và W1/2(2) lúc này Rs sẽ được tính theo: 2 1 1/2(1) 1/2(2) 1,18