Luận văn Ứng dụng phương pháp PRC phát hiện edwardsiella ictaluri trực tiếp từ mô cá bệnh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN MAI THỊ LOAN ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN Edwardsiella ictaluri TRỰC TIẾP TỪ MÔ CÁ BỆNH LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN MAI THỊ LOAN ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN Edwardsiella ictaluri TRỰC TIẾP TỪ MÔ CÁ BỆNH LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH KS. NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - i - LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp ngoài sự nỗ lực, cố gắng của bản thân có phần đóng góp rất lớn của Cha Mẹ đã có công sinh thành và nuôi dưỡng; Thầy Cô đã có công dạy bảo và tất cả bạn bè luôn bên cạnh tôi giúp đỡ và động viên tôi. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh và chị Nguyễn Trúc Phương đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ tôi về mọi mặt trong quá trình tôi thực hiện đề tài. Chân thành cảm ơn cô Đặng Thụy Mai Thy và cô Trần Thị Tuyết Hoa cũng như toàn thể quý thầy cô Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản đã giúp đỡ tôi và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Chân thành cảm ơn chị Trần Việt Tiên, anh Lê Hữu Thôi và các anh chị Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài. Cảm ơn những người bạn thân của tôi cũng như tất cả các bạn lớp Bệnh Học Thủy Sản 31 đã luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trong suốt quãng thời gian học tập tại Giảng đường Đại học cũng như trong quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng là lời cảm ơn sâu sắc đến Cha, Mẹ và Em trai tôi đã luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống. Mai Thị Loan PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - ii - TÓM TẮT Đề tài thực hiện nhằm chuẩn hóa phương pháp ly trích ADN từ mô thận của cá tra theo phương pháp của Taggart et al. (1992) và tối ưu hóa phương pháp PCR phát hiện E. ictaluri. Qui trình ly trích ADN được chuẩn hóa có thời gian thực hiện bằng 1/8 lần qui trình gốc (Taggart et al, 1992) với hàm lượng Proteinase K sử dụng là 2.5ml (40mg/ml), thời gian ủ ở bước 1 là 15 phút; hàm lượng RNase là 2.5ml (2mg/ml), thời gian ủ bước 2 là 30 phút. Qua thí nghiệm xác định được độ nhạy đối với ADN chiết tách trực tiếp từ thận có hàm lượng là 50ng, với ADN chiết tách từ vi khuẩn có hàm lượng 0.2 ng. Hai đoạn mồi EiFd-1 và EiRs-1 được xác định là đặc hiệu với vi khuẩn E. ictaluri. Ngoài ra trong quá trình chuẩn hóa thay đổi hàm lượng Tag DNA polymerase từ 5U/ml xuống còn 3U/ml. Thực hiện phản ứng PCR với ADN được chiết tách trực tiếp từ thận với qui trình đã được tối ưu, phương pháp PCR đã chuẩn hóa phát hiện E. ictaluri ở vị trí 407bp. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - iii - MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ ........................................................................................ i TÓM TẮT ............................................................................................. ii MỤC LỤC ............................................................................................. iii DANH SÁCH BẢNG ............................................................................ vi DANH SÁCH HÌNH ............................................................................. vii PHẦN I: GIỚI THIỆU ........................................................................... 1 PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ...................................................... 3 2.1 Sơ lược tình hình nuôi và bệnh trên cá tra ở ĐBSCL........................ 3 2.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri........................................................ 4 2.2.1 Tình hình bệnh do vi khuẩn E. ictaluri trên thế giới và Việt Nam .. 4 2.2.1.1 Trên thế giới ............................................................................... 4 2.2.1.2 Ở Việt Nam ................................................................................ 4 2.2.2 Đặc điểm sinh hóa của loài vi khuẩn E. ictaluri ............................ 5 2.2.3 Độc lực và một số thí nghiệm gây cảm nhiễm ............................... 6 2.3 Chiết tách acid nucleic ..................................................................... 6 2.4 Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) ....................................... 7 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 13 3.1 Thời gian và địa điểm ...................................................................... 13 3.2 Dụng cụ và hoa chất......................................................................... 13 3.2.1 Dụng cụ ........................................................................................ 13 3.2.1.1 Dụng cụ phân tích mẫu vi khuẩn ................................................ 13 3.2.1.2 Dụng cụ dùng trong phản ứng PCR ............................................ 13 3.2.2 Hóa chất ........................................................................................ 14 3.2.2.1 Hóa chất dùng phân tích mẫu vi khuẩn ....................................... 14 3.2.2.2 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR ........................................... 14 3.3 Phương pháp nghiên cứu.................................................................. 15 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - iv - 3.3.1 Thí nghiệm gây cảm nhiễm ........................................................... 15 3.3.1.1 Chuẩn bị hệ thống bể ................................................................. 15 3.3.1.2 Cá thí nghiệm ............................................................................. 15 3.3.1.3 Vi khuẩn gây cảm nhiễm ............................................................ 15 3.3.1.4 Bố trí thí nghiệm ........................................................................ 16 3.3.2 Phương pháp phân tích mẫu vi khuẩn............................................ 17 3.3.3 Phương pháp PCR ......................................................................... 19 3.3.3.1 Vật liệu cho phản ứng PCR ........................................................ 19 3.3.3.2 Chiết tách acid nucleic: phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992) ..................................................................................................... 19 3.3.3.3 Thí nghiệm xác định độ nhạy ..................................................... 20 3.3.3.2.1 Chiết tách acid nuleic (Bartie và ctv, 2006) ............................. 20 3.3.3.2.2 Khuếch đại ADN: (Panangala và ctv (2007) có chỉnh sửa) ...... 21 3.3.3.2.3 Điện di .................................................................................... 22 3.3.3.4 Thí nghiệm xác định tính đặc hiệu.............................................. 22 PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................... 24 4.1 Kết quả phân tích vi sinh.................................................................. 24 4.1.1 Dấu hiệu bệnh lý ........................................................................... 24 4.1.2 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa.............. 24 4.2 Kết quả chuẩn hóa qui trình chiết tách acid nucleic – phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992) (chỉnh sửa bởi Đặng Thị Hoàng Oanh)25 4.2.1 Thực hiện qui trình chiết tách acid nucleic bằng phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992) ............................................................ 25 4.2.2 Tăng hàm lượng Proteinase K, giảm thời gian ủ bước 1 ................ 26 4.2.3 Điều chỉnh hàm lượng Proteinase K, thời gian ủ và hàm lượng RNase .............................................................................................................. 27 4.2.4 Tối ưu qui trình chiết tách với hàm lượng Proteinase K 2.5ml, thời gian ủ bước 1 là 15 phút; hàm lượng RNase 2.5ml, thời gian ủ bước 2 là 30 phút. .............................................................................................................. 27 4.3 Kết quả chuẩn hóa phương pháp PCR .............................................. 28 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - v - 4.3.1 Kết quả thí nghiệm xác định độ nhạy ............................................ 28 4.3.2 Kết quả xác định tính đặc hiệu ...................................................... 30 4.3.3 Kết quả chuẩn hóa qui trình khuếch đại phát hiện E. ictaluri (Panangala và ctv, 2007) .......................................................................................... 31 4.4 Kết quả phản ứng PCR .................................................................... 33 4.4.1 Kết quả phản ứng PCR với ADN mẫu thực hiện qui trình chiết tách acid nucleic bằng phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992) ...... 33 4.4.2 Kết quả phản ứng PCR với ADN mẫu thực hiện bằng qui trình chiết tách được tối ưu ............................................................................................ 35 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................... 36 5.1 Kết luận ........................................................................................... 36 5.2 Đề xuất ............................................................................................ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................... 37 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - vi - DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1 Thành phần tham gia phản ứng PCR ........................................ 20 Bảng 4.1 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa ........ 25 Bảng 4.2 Hàm lượng DNA chiết tách (theo Taggart et al., 1992) ............ 25 Bảng 4.3 Hàm lượng DNA chiết tách theo phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992), tăng hàm lượng Proteinase K, giảm thời gian ủ bước 1 ............................................................................................................... 26 Bảng 4.4 Hàm lượng ADN chiết tách theo phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992), chỉnh hàm lượng Proteinase K, thời gian ủ và hàm lượng RNase ..................................................................................................... 27 Bảng 4.5 Hàm lượng ADN chiết tách theo phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992), hàm lượng Proteinase K 2.5ml, thời gian ủ bước 1 là 15 phút; hàm lượng RNase 2.5ml, thời gian ủ bước 2 là 30 phút .................. 28 Bảng 4.6 Thành phần tham gia phản ứng PCR (hàm lượng Tag DNA polymerase 5U/ml) .................................................................................. 31 Bảng 4.7 Thành phần tham gia phản ứng PCR (hàm lượng Tag DNA polymerase 4U/ml) .................................................................................. 31 Bảng 4.8 Thành phần tham gia phản ứng PCR (hàm lượng Tag DNA polymerase 3U/ml) .................................................................................. 32 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - vii - DANH SÁCH HÌNH Hình 4.1 Cá bệnh mủ gan ....................................................................... 24 Hình 4.2 Kết quả điện di thí nghiệm xác định độ nhạy với ADN chiết tách từ thận ........................................................................................................ 29 Hình 4.3 Kết quả điện di thí nghiệm xác định độ nhạy với ADN chiết tách từ vi khuẩn .................................................................................................. 29 Hình 4.4 Kết quả điện di thí nghiệm xác định tính đặc hiệu. ................... 30 Hình 4.5 Kết quả điện di kiểm tra hiệu quả của các hàm lượng Tag DNA polymerase khác nhau............................................................................. 32 Hình 4.6 Kết quả chạy PCR phát hiện E. ictaluri, qui trình chiết tách acid nucleic theo phương pháp Phenol-chloroform (Taggart et al, 1992) ........ 33 Hình 4.7 Kết quả chạy PCR, chuẩn hóa qui trình chiết tách lần 1............ 34 Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR với qui trình tối ưu ................... 35 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 1 - PHẦN I GIỚI THIỆU Trong những năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản ở nước ta nói chung và Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) nói riêng đang phát triển không ngừng mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nước nhà đặc biệt là cá tra do đây là đối tượng dễ nuôi, mau lớn, chất lượng thịt ngon. Cá tra được nuôi nhiều ở An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ với nhiều mô hình khác nhau cả trong lồng bè, ao đất. Mặc dù năm 2008 ngành thủy sản nước ta gặp nhiều khó khăn nhưng giá trị xuất khẩu vẫn không ngừng gia tăng. Theo số liệu của Hải quan, tính đến ngày 14/11/2008, tổng kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản của cả nước đã đạt 4 tỷ USD. 10 tháng đầu năm, xuất khẩu thuỷ sản đạt 1.054.600 tấn, trị giá 3,828 tỷ USD, tăng 39,4% về lượng và 24,4% về giá trị so với cùng kỳ năm ngoái. Xuất khẩu trong tháng 10 đạt 124.328 tấn, trị giá 478,23 triệu USD, tăng 30% về khối lượng và giá trị so với tháng 10/2007. Trong đó, cá tra, basa chiếm 32,4%, với 550.070 tấn, đạt mức tăng trưởng cao nhất, tăng 74,5% về lượng và 53,3% về giá trị so với cùng kỳ ( Để có sản lượng cao như thế, bên cạnh việc tăng diện tích nuôi trồng người nuôi còn tăng cả mật độ làm xuất hiện nhiều loại bệnh như mủ gan, bệnh đốm đỏ, bệnh nhiễm huyết và một số bệnh do nấm, ký sinh trùng gây ra.v.v. Theo thống kê của Lý Thị Thanh Loan (2008) thì tần suất xuất hiện bệnh năm 2007 ở các tỉnh ĐBSCL gồm đốm trắng trên gan, thận (52,80%), xuất huyết (42,50%), phù mắt (20,70%) và vàng da (21,60%). Như vậy tần số xuất hiện của bệnh đốm trắng nội tạng là cao nhất (Nguyễn Trọng Bình, 2008). Bệnh này xuất hiện lần đầu tiên trên cá tra nuôi ở ĐBSCL vào cuối năm 1998 (Ferguson và ctv, 2001) và trở nên trầm trọng vào 1999. Bệnh xuất hiện suốt chu kỳ nuôi, thường vào mùa lũ và cao điểm là vào tháng 7 và 8. Cá bị bệnh có biểu hiện bơi lờ đờ, tuy nhiên đa số cá bệnh không có những biểu hiện bất thường bên ngoài. Ở giai đoạn mới chớm bệnh cá vẫn còn bắt mồi, trong giai đoạn này nếu không áp dụng các phương pháp điều trị và môi trường nuôi quá bẩn bệnh sẽ trở nên trầm trọng và rất khó khăn trong việc điều trị. Khi cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết tăng cao 10-90% có thể lên tới 100% tùy thuộc vào cách quản lý và cỡ cá nuôi (Từ Thanh Dung, 2004). Từ thực tế tình hình dịch bệnh đòi hỏi phải có một phương pháp giúp sớm tìm ra tác nhân gây bệnh từ đó có hướng xử lý và điều trị kịp thời. Hiện nay PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 2 - phương pháp xác định vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra phổ biến là phương pháp sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng bộ kit API20E. Tuy nhiên cả 2 phương pháp này cho kết quả chậm, mất nhiều thời gian nên chưa đáp ứng được nhu cầu chẩn đoán bệnh trong tình hình hiện nay. Gần đây Nguyễn Trúc Phương (2009) đã ứng dụng phương pháp PCR để chẩn đoán nhanh vi khuẩn E.ictaluri, thời gian được rút ngắn ¼ lần so với phương pháp định danh truyền thống. Tuy nhiên phương pháp này vẫn phải trải qua một bước nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường tổng hợp để được chủng vi khuẩn thuần. Nếu phương pháp này được thực hiện trực tiếp từ mô cá bệnh thì thời gian chẩn đoán sẽ được rút ngắn hơn nữa (chỉ mất khoảng 1 ngày). Do đó đề tài “Phát triển phương pháp PCR phát hiện Edwardsiella ictaluri trực tiếp từ mô cá bệnh” được thực hiện nhằm chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện E. ictaluri nhanh, nhạy làm cơ sở cho việc điều trị có hiệu quả sau này. Mục tiêu Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện E. ictaluri từ mô cá bệnh Nội dung 1. Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp ly trích ADN từ mô cá bệnh 2. Tối ưu phương pháp PCR phát hiện E. ictaluri 3. Xác định độ nhạy và tính đặc hiệu của phương pháp PCR phát hiện E. ictaluri PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 3 - PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược tình hình nuôi và bệnh trên cá tra ở ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long gồm 12 tỉnh và 1 thành phố trực thuộc Trung ương với tổng diện tích chiếm 3.960.000 ha chiếm 12% tổng diện tích tự nhiên của cả nước. Tiềm năng diện tích mặt nước nuôi trồng thủy sản của vùng được xác định là khoảng 963.700 ha chiếm 57,61% tổng diện tích tiềm năng của cả nước. Năm 2002, đã có khoảng 73,9% diện tích tiềm năng này được sử dụng cho nuôi trồng thủy sản (Lê Xuân Sinh, 2005). Theo báo cáo của ngành Thủy sản năm 2006, cá tra basa đạt sản lượng 800.000 tấn và kim ngạch xuất khẩu đạt 773 triệu USD (tăng 50% so với năm 2005), và đến năm 2007 với sản lượng hơn 1,5 triệu tấn kim ngạch xuất khẩu cá tra đạt 974 triệu USD, chiếm 26% kim ngạch xuất khẩu toàn ngành thủy sản (kim ngạch xuất khẩu toàn ngành ước đạt 3,75 tỷ USD) (Trần Thanh Hoan 2008, trích dẫn bởi Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008). Theo Nguyễn Phú Son (2007), năm 2002 diện tích nuôi cá tra ao là 2.720 ha, đến năm 2005 tăng lên 3.548 ha, tăng bình quân hằng năm 18,6% trong 3 năm 2003 – 2005. Khi ngành nuôi trồng đã phát triển, nhiều đối tượng có giá trị kinh tế được đưa vào nuôi, các hình thức nuôi công nghiệp như thâm canh, siêu thâm canh được áp dụng phổ biến, sự đầu tư lớn về giống, thức ăn và năng suất cao luôn là điều kiện tiềm ẩn nguy cơ bùng nổ dịch bệnh. Do vậy, khi nuôi trồng thủy sản càng phát triển thì vấn đề dịch bệnh càng trở nên thường xuyên, đe dọa ngành nuôi trồng thủy sản, gây những thiệt hại lớn và đôi khi bệnh đã trở thành nhân tố quyết định thắng thua trong một đợt sản xuất (Bùi Quang Tề, 2004). Ngoài ra, theo Lê Xuân Sinh và Lê Lệ Hiền (2008), trong tổng chi phí nuôi cá tra, thức ăn chiếm khoảng ¾, điều này có tác động lớn tới môi trường nước - một trong những nguyên nhân quan trọng nhất đối với việc bệnh xuất hiện ngày càng nhiều trên cá tra nuôi. Có nhiều loại tác nhân gây bệnh trên cá tra nuôi, tuy nhiên vi khuẩn là một tác nhân gây bệnh quan trọng, là trở lực chủ yếu kìm hãm phát triển và gây hạn chế mở rộng sản xuất trong nuôi trồng thủy sản (Từ Thanh Dung, 2008) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 4 - Theo Trần Anh Dũng (2005), khi nghiên cứu khảo sát tác nhân gây bệnh trên cá tra nuôi thâm canh ở An Giang cho thấy, bệnh trên cá tra nuôi sự xuất hiện có tính mùa vụ rõ rệt, bệnh do ký sinh trùng hầu như xuất hiện quanh năm nhưng nhiều nhất là vào mùa mưa và mùa lũ rút, mùa khô thường ít hơn mùa lũ. Bệnh do vi khuẩn xuất hiện quanh năm, bệnh mủ gan xuất hiện nhiều vào mùa lũ, bệnh xuất huyết xuất hiện nhiều vào mùa lũ rút. Theo đó, tỉ lệ nhiễm các bệnh do vi khuẩn như bệnh đỏ mỏ đỏ kỳ chiếm 68,3%, mủ gan chiếm 61,0%, phù đầu 51,2% và bệnh vàng da chiếm 24,4%. Kết quả điều tra tại An Giang và Cần Thơ cho thấy các loại bệnh phổ biến trong nuôi cá tra thâm canh ở hai địa phương này là bệnh gan thận mủ, bệnh đốm đỏ, bệnh phù đầu, bệnh lở loét, trắng mang – trắng đuôi, lồi mắt-nổ mắt, nấm thủy mi, xuất huyết đường ruột, ký sinh trùng. Trong đó bệnh thường gặp và gây thiệt hại lớn là bệnh gan thận mủ với tỷ lệ chết là 80 – 90% nếu không có biện pháp điều trị kịp thời (Nguyễn Chính, 2005; Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008). 2.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 2.2.1 Tình hình bệnh do vi khuẩn E. ictaluri trên thế giới và Việt Nam 2.2.1.1 Trên thế giới Hawke (1979) lần đầu tiên phân lập được vi khuẩn gây bệnh nhiễm trùng máu trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus), với tên gọi là ESC (Enteric septicaemia of catfish). Bệnh gây thiệt hại lớn cho ngành công nghiệp nuôi cá nheo (Hawke và ctv,1998). Bên cạnh xuất hiện ở miền Nam nước Mỹ bệnh còn được tìm thấy ở Indiana, Idaho, California, Arizona, và N