Luận văn Xác định đặc điểm sinh hóa và khảnăng kháng thuốc của vi khuẩn gâybệnh mủ gan edwardsiella ictaluritrên cá tra (pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN PHẠM THỊ NGỌC XUÂN XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH MỦ GAN Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI THÂM CANH Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN Năm 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN PHẠM THỊ NGỌC XUÂN XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH MỦ GAN Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI THÂM CANH Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN NGUYỄN THỊ THU HẰNG ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH Năm 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version i LỜI CẢM TẠ Hôm nay, để có thể hoàn thành được luận văn này, tôi đã phải trải qua một quá trình dài học tập và rèn luyện tại trường. Tuy nhiên gia đình là nhân tố quan trọng nhất giúp tôi hoàn thành mọi việc. Bên cạnh đó, thầy cô và bạn bè cũng góp phần không nhỏ trong sự thành công của tôi. Vì vậy hôm nay tôi xin gửi lòng biết ơn đến: - Ba Mẹ và toàn thể gia đình tôi-những người luôn ở bên tôi, động viên và chăm sóc tôi từ vật chất đến tinh thần, giúp tôi có đủ sức mạnh vượt qua tất cả! - Lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi đến cô Nguyễn Thị Thu Hằng và cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt luận văn này! - Xin gửi lòng biết ơn chân thành đến cô Trần Thị Tuyết Hoa, cô Đặng Thụy Mai Thy và cô Bùi Thị Bích Hằng đã quan tâm, động viên tôi trong suốt thời gian làm cố vấn học tập! - Xin gửi lời cảm ơn đến chị Nguyễn Hà Giang, anh Lê Hữu Thôi cùng tất cả các thầy cô và các anh chị trong khoa Thủy Sản đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài! - Lòng chân thành biết ơn tôi xin gửi đến các cô chú và anh chị ở các địa phương đã nhiệt tình giúp tôi trong quá trình thu mẫu! - Lòng tri ân tôi xin gửi đến tất cả các Thầy Cô đã từng dạy dỗ tôi trong suốt thời gian tôi theo học tại trường tiểu học Trương Định, trường trung học cơ sở cấp II Thanh Đức A, trường trung học phổ thông Lưu Văn Liệt- tỉnh Vĩnh Long và trường Đại học Cần Thơ! - Đồng thời, tôi cũng xin gửi lòng biết ơn đến tập thể các bạn lớp Bệnh Học Thủy Sản khoá 31 và tất cả những người bạn đã luôn ở bên cạnh tôi với sự chia sẻ, những lời động viên và lời khuyên chân thành! Và một lần nữa tôi xin gửi đến tất cả những người thân yêu, thầy cô, bạn bè…những người đã góp phần mang đến cho tôi sự thành công cùng những hương vị của cuộc sống này lời cảm ơn chân thành nhất!!! Tác giả Xin chân thành cảm ơn!!! PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version ii TÓM TẮT Với mục tiêu nghiên cứu của đề tài là tìm hiểu mức độ xuất hiện và tính kháng thuốc của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá tra bệnh mủ gan nuôi thâm canh ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Kết quả cho thấy vi khuẩn E. ictaluri xuất hiện hầu hết ở các vùng nuôi. Kết quả phân lập từ mẫu cá đã xác định được 84 chủng thuộc nhóm vi khuẩn Edwardsiella. Qua kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản như nhuộm gram, tính di động, oxydase, catalase chọn ra 10 chủng để tiến hành định danh theo phương pháp truyền thống và kit API 20E được cả 10 chủng đều là E. ictaluri. Tuy nhiên kết quả kiểm tra API lại sai khác đối với một số chỉ tiêu (citrate, indole). Kết quả chạy PCR một lần nữa khẳng định cả 10 chủng vi khuẩn đều là E. ictaluri khi tất cả đều hiện vạch sáng ở 407 bp. Kháng sinh đồ được thực hiện trên cả 10 chủng vi khuẩn E. ictaluri với 8 loại thuốc kháng sinh. Kết quả là 100% vi khuẩn kháng hoàn toàn với S (streptomycin) và OA (oxolinic acid), 100% vi khuẩn kháng với FFC (florfenicol), vi khuẩn nhạy nhất với AMX (amoxycillin). Riêng với DO (doxycycline) có 80% số chủng nhạy, 10% số chủng trung bình nhạy và 10% số chủng kháng. Nhìn chung trong tất cả 10 chủng thì chỉ có chủng CA4.4G đa kháng với cả S, OA, FFC và DO. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên kháng sinh streptomycin đối với 2 chủng vi khuẩn đã phân lập ở trên, kết quả cho thấy vi khuẩn E. ictaluri kháng với streptomycin ở mức thấp (2-4 µg/ml). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version iii MỤC LỤC PHẦN I: GIỚI THIỆU ................................................................................... 1 PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .............................................................. 3 2.1 Tình hình nuôi cá tra ................................................................................ 3 2.2 Bệnh vi khuẩn trên cá .............................................................................. 3 2.3 Bệnh do vi khuẩn E. ictaluri .................................................................... 4 2.3.1 Tình hình bệnh do vi khuẩn E. ictaluri trên thế giới .............................. 4 2.3.2 Tình hình bệnh do vi khuẩn E. ictaluri ở Việt Nam ............................... 5 2.3.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn E. ictaluri ........... 6 2.3.4 Một số cơ quan thường bị E. ictaluri tấn công....................................... 6 2.4 Một số nghiên cứu khác trên vi khuẩn E. ictaluri .................................... 7 2.5 Tình hình sử dụng thuốc thú y thủy sản.................................................... 7 2.6 Phương pháp PCR ................................................................................... 9 2.6.1 Các nhân tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR ........................................... 9 2.6.2 Ưu và nhược điểm của phương pháp PCR........................................... 10 2.7 Các nghiên cứu về nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) ................................ 10 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 12 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................... 12 3.1.1 Thời gian nghiên cứu .......................................................................... 12 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 12 3.1.3 Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 12 3.2 Vật liệu nghiên cứu ................................................................................ 12 3.2.1 Dụng cụ thí nghiệm ............................................................................. 12 3.2.2 Hóa chất và môi trường ....................................................................... 12 3.2.2.1 Hóa chất ........................................................................................... 12 3.2.2.2 Môi trường ....................................................................................... 12 3.3 Phương pháp nghiên cứu........................................................................ 13 3.3.1 Phương pháp thu mẫu ......................................................................... 13 3.3.2 Phương pháp lấy mẫu vi sinh .............................................................. 13 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version iv 3.3.3 Tách ròng mẻ cấy ................................................................................ 14 3.3.4 Định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống ........................... 14 3.3.5 Định danh vi khuẩn bằng bộ Kit API 20E ........................................... 14 3.3.6 Phương pháp PCR ............................................................................... 14 3.3.7 Phương pháp lập kháng sinh đồ .......................................................... 16 3.3.8 Phương pháp xác định MIC ................................................................ 16 3.4 Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................... 17 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 18 4.1 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn ................................................. 18 4.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn ................................................................... 18 4.1.2 Kết quả định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống ............... 18 4.1.3 Kết quả định danh vi khuẩn bằng bộ Kit API 20E ............................... 20 4.2 Kết quả định danh vi khuẩn bằng phương pháp PCR ............................. 22 4.3 Kết quả kháng sinh đồ............................................................................ 23 4.4 Kết quả MIC .......................................................................................... 25 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................ 27 5.1 Kết luận ................................................................................................. 27 5.2 Đề xuất .................................................................................................. 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 28 PHỤ LỤC .................................................................................................... 33 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version v DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của qui trình phát hiện vi khuẩn E. ictaluri .............................................................. 15 Bảng 3.2: Giới hạn xác định mức độ kháng, trung bình nhạy và nhạy của các loại kháng sinh theo đường kính chuẩn trung bình của công ty Bio-rad ....... 16 Bảng 4.1 Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn E. ictaluri bằng phương pháp truyền thống ................................................................... 19 Bảng 4.2 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hoá của các chủng vi khuẩn bằng bộ Kit API 20E ........................................................... 21 Bảng 4.3 Hàm lượng DNA chiết tách ......................................................... 22 Bảng 4.4 Kết quả kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn E. ictaluri ........... 24 Bảng 4.5 Giá trị MIC của thuốc kháng sinh streptomycin trên 2 chủng vi khuẩn E. ictaluri ......................................................................................... 25 Bảng 3.3 Bảng kiểm tra kết quả test O/F ...................................................... 34 Bảng 3.4 Các chỉ tiêu định danh E. ictaluri bằng phương pháp sinh hóa truyền thống ........................................................................................................... 37 Bảng 3.5 Cách đọc kết quả bộ Kit API 20E ................................................. 39 Bảng 4.5 Dấu hiệu bên trong và bên ngoài của các mẫu cá .......................... 40 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version vi DANH SÁCH HÌNH Hình 4.1 Đĩa cấy thuần (A), Vi khuẩn E. ictaluri Gram âm, hình que ngắn (B) .................................................................................................................... 18 Hình 4.2 Khả năng sử dụng các loại đường (A), Các chỉ tiêu sinh hóa thuyền thống (B) ..................................................................................................... 19 Hình 4.3 Kết quả kiểm tra vi khuẩn E. ictaluri trên Kit API 20E ................. 20 Hình 4.4 Kết quả chạy PCR phát hiện E. ictaluri ........................................ 23 Hình 4.5 Kết quả kháng sinh đồ trên vi khuẩn E. ictaluri ............................ 24 Hình 4.6 Kết quả MIC của vi khuẩn E. ictaluri ........................................... 25 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 1 PHẦN I GIỚI THIỆU Đồng Bằng Sông Cửu Long là một trong 7 vùng kinh tế trọng điểm nằm ở phía Nam của đất nước, có diện tích gần 4 triệu ha, chiếm khoảng 12% tổng diện tích cả nước. Đây là vùng hạ lưu châu thổ sông Mekong, được xem là vùng trù phú nhất, không chỉ của Việt Nam mà của cả khu vực Đông Nam Á. Đồng thời đây cũng là vùng nuôi trồng thủy sản lớn nhất của cả nước, diện tích nuôi trồng thủy sản chiếm khoảng 60% với sản lượng chiếm khoảng 65% và giá trị xuất khẩu thủy sản chiếm 51% (Dương Nhựt Long, 2003). Mười tháng đầu năm 2008, xuất khẩu thủy sản của cả nước đạt 1.054.600 tấn, trị giá 3.828 tỷ USD, tăng 39,4% về lượng và 24,4% về giá trị so với cùng kỳ năm 2007. Trong đó mặt hàng chủ lực là cá tra và cá basa đạt mức tăng trưởng cao nhất ( Để đạt được những kết quả như thế đòi hỏi sự gia tăng cả về số lượng lẫn chất lượng của sản phẩm vì vậy diện tích cũng như mật độ nuôi ngày càng được nâng cao, kết quả là những năm gần đây, tình hình bệnh xuất hiện trên động vật thủy sản ngày càng nhiều đã đến mức báo động. Một trong số những bệnh đang được quan tâm hàng đầu đó là bệnh mủ gan đã gây thiệt hại không nhỏ về kinh tế cho nhiều hộ nuôi. Ngày nay bệnh mủ gan vẫn đang là mối quan tâm hàng đầu cho những ai đang và sẽ nuôi cá tra thâm canh ở khu vực ĐBSCL. Theo Hawke (1981), Từ Thanh Dung (2004) cho rằng vi khuẩn E. ictaluri thuộc họ Enterobacteriaceae, là vi khuẩn Gram âm, hình que, phản ứng âm tính với oxidase và dương tính với catalase, không có khả năng sinh H2S và Indole. Trên môi trường TSA ở 28oC sau 48 giờ vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc nhỏ, tròn, màu trắng, có rìa không đồng nhất. Nhiều nghiên cứu trước đây đã xác định tác nhân gây bệnh mủ gan là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra, bệnh thường xảy ra trên cá tra nuôi thâm canh ở tất cả các giai đoạn, tỉ lệ hao hụt từ 10% cao nhất có thể lên đến 90% (Nguyễn Quốc Thịnh và ctv, 2003; Crumlish, 2001; Từ Thanh Dung, 2004; Shotts et al., 1986). Cùng với sự xuất hiện vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan thì nhiều nghiên cứu về kháng sinh phòng trị bệnh do Edwardsiella ictaluri cũng được tiến hành để góp phần khắc phục tình hình dịch bệnh do vi khuẩn gây ra trên cá tra. Theo nghiên cứu của Từ Thanh Dung và ctv (2005) đã nghiên cứu và cho rằng bệnh này có thể khống chế bằng nhóm kháng sinh quinolon (flumequin, oxolinic acid, enrofloxacin) nhưng ngày nay nhóm kháng sinh này PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 2 đã bị cấm sử dụng. Mặc khác, theo kết quả điều tra của Nguyễn Quốc Thịnh (2006) đa số người dân nuôi cá thường sử dụng kháng sinh để phòng trị bệnh. Tuy nhiên, một bộ phận không nhỏ người nuôi chưa nắm bắt tốt kỹ thuật nuôi và việc quản lý sức khỏe của động vật thủy sản trong ao nuôi cũng như những hiểu biết về thuốc kháng sinh còn nhiều hạn chế, liều lượng và thời gian sử dụng không phù hợp dẫn đến sự gia tăng hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của một số giống loài vi khuẩn nên việc phòng trị kém hiệu quả gây nhiều tổn thất to lớn về kinh tế và ảnh hưởng không nhỏ đến môi trường sinh thái cũng như sức khỏe con người. Vì vậy, đề tài “Xác định đặc điểm sinh hoá và khả năng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh mủ gan Edwardsiella ictaluri trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long” được thực hiện nhằm đánh giá tình hình bệnh mủ gan ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long cũng như sự kháng thuốc của các chủng vi khuẩn này để có biện pháp hợp lý trong quá trình nuôi cũng như quản lý dịch bệnh trong khu vực góp phần bảo vệ môi trường sinh thái. Mục tiêu của đề tài: Tìm hiểu mức độ xuất hiện và tính kháng thuốc của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá tra bệnh mủ gan. Nội dung nghiên cứu của đề tài: Phân lập vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan trên cá tra. Định danh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bằng phương pháp truyền thống và phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction). Lập kháng sinh đồ và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri với một số loại thuốc kháng sinh. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 3 PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nuôi cá tra Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), trước đây còn có tên là Pangasius hypophthalmus, P. micronemus hay P. Sutchi (Nguyễn Văn Kiểm, 2004), là loài cá được nuôi hầu hết ở các nước Đông Nam Á và là loài cá nuôi quan trọng nhất trong khu vực này. Ở Campuchia, sản lượng nuôi cá tra chiếm bằng một nửa sản lượng các loài cá nuôi, trong đó tỷ lệ cá tra chiếm 98% trong 3 loài thuộc họ cá tra, chỉ có 2% là cá basa và cá vồ đém. Tại Thái Lan, nước đầu tiên thành công trong việc sinh sản nhân tạo cá tra vào năm 1966 có sản lượng cá tra nuôi chỉ đứng sau cá rô phi, đến năm 1970 đã chủ động cung cấp giống cho nghề nuôi cá tra trong nước. Cá tra là một loài cá nuôi truyền thống trong ao của nông dân các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL). Ngoài tự nhiên, cá tra phân bố ở lưu vực sông MeKong, có mặt ở cả 4 nước: Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan (Nguyễn Văn Kiểm, 2004). Cá sống đựơc ở mọi tầng nước, thường sống được ở các thủy vực nước tĩnh, nước chảy, chịu đựng được điều kiện khắc nghiệt của môi trường. Cá sống chủ yếu ở môi trường nước ngọt tuy nhiên cá vẫn có thể sống và phát triển ở môi trường nước lợ (ao nuôi tôm sú vào mùa mưa). ( Khi ngành nuôi trồng thủy sản đã phát triển, nhiều đối tượng có giá trị kinh tế được đưa vào nuôi, các hình thức nuôi công nghiệp như thâm canh, siêu thâm canh được áp dụng phổ biến. Sự đầu tư lớn về giống, thức ăn và năng suất cao luôn là điều kiện tiềm ẩn nguy cơ bùng nổ dịch bệnh. Do vậy, khi nuôi trồng thủy sản càng phát triển thì vấn đề dịch bệnh càng trở nên thường xuyên, đe dọa ngành nuôi trồng thủy sản, gây những thiệt hại lớn và đôi khi bệnh đã trở thành nhân tố quyết định thắng thua trong một đợt sản xuất (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004). 2.2 Bệnh vi khuẩn trên cá Bệnh là những biến đổi bất thường của cơ thể sinh vật với những biến đổi xấu của môi trường xung quanh, cơ thể nào thích ứng được thì tồn tại, không thích ứng được thì chết. Hay nói cách khác bất cứ một sự thay đổi trạng thái nào đó của cơ thể hoặc một cơ quan nào ảnh hưởng đến chức năng sinh lý của cơ thể sinh vật gọi là bệnh (Từ Thanh Dung, 2005). Bệnh cá luôn được xem là một trong những tác nhân gây hao hụt trong nghề nuôi thủy sản trên thế giới và Việt Nam. Tác nhân gây bệnh và mức độ gây thiệt hại cũng rất đa dạng và phụ thuộc vào đối tượng nuôi khác nhau. Bệnh nấm, ký sinh trùng, vi khuẩn,…là những tác nhân gây bệnh thường gặp trong nghề nuôi cá nước ngọt (Bùi Quang Tề, 1993). Theo Đỗ Thị Hòa và ctv (2004) thì khi động vật thủy sản bị bệnh thường có những biểu hiện như: trạng thái hoạt động không bình thường, không giữ PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 4 được thăng bằng, nổi đầu, dạt vào bờ, quay vòng trên mặt nước, kén hoặc bỏ ăn, có sự biến đổi màu sắc một bộ phận hay toàn bộ cơ thể kèm theo những dấu hiệu chậm lớn, yếu và chết. Nếu các hoạt động sống bị rối loạn phá hủy một hay nhiều cơ quan quan trọng như hô hấp, tiêu hóa, tuần hoàn, thần kinh…thì bệnh xảy ra nặng và động vật bị bệnh có thể chết. Qua thống kê của Lê Xuân Sinh (2006) cho thấy bệnh mủ gan trên cá tra xuất hiện nhiều nhất (82,1%), bệnh xuất huyết (63,4%), bệnh do ký sinh trùng (32,0%). Ngoài ra, còn có một số bệnh nguy hiểm khác nhưng xuất hiện với tần số thấp hơn như: bệnh vàng da (12,2%), bệnh đường ruột (11,5%), bệnh lồi mắt (11,4%), bệnh tuột nhớt (10,0%), bệnh lở loét (3,1%),… Gần đây, theo điều tra của Nguyễn Tấn Duy Phong (2008) cho thấy bệnh gan thận mủ xuất hiện với tần số cao nhất (93,8%), tiếp theo đó là bệnh xuất huyết (75%), bệnh trắng gan trắng mang (68,8%). Như vậy, thấy rằng bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra đang là mối đe dọa lớn nhất cho người nuôi cá tra hiện nay. 2.3 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 2.3.1 Tình hình bệnh do vi khuẩn E. ictaluri trên thế giới Vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh xuất huyết được phân lập lần đầ