Luận văn Xác định tính nhạy của một số loài thuốc kháng sinh đối với Edwardsiella sp và Aeromonas sp gây bệnh trên cá Tra tại Cần Thơ và An Giang

1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG
 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: 304 XÁC ĐỊNH TÍNH NHẠY CỦA MỘT SỐ LOẠI THUỐC KHÁNG SINH ĐỐI VỚI Edwardsiella sp VÀ Aeromonas sp GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA TẠI CẦN THƠ VÀ AN GIANG Sinh viên thực hiện NGUYỄN THỊ MINH TRANG MSSV: 06803052 LỚP: NTTS K1 Cần Thơ, 2010 2 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: 304 XÁC ĐỊNH TÍNH NHẠY CỦA MỘT SỐ LOẠI THUỐC KHÁNG SINH ĐỐI VỚI Edwardsiella sp VÀ Aeromonas sp GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA TẠI CẦN THƠ VÀ AN GIANG Cán bộ hướng dẫn Sinh viên thực hiện Ths. LÂM PHÚC NHÂN NGUYỄN THỊ MINH TRANG KS. PHẠM THANH HƯƠNG MSSV: 06803052 LỚP: NTTS_K1 Cần Thơ, 2010 3 LỜI CẢM TẠ Sau 3 tháng thực tập từ tháng 03-06 năm 2010 tại Chi Cục Thủy Sản thành phố Cần Thơ, 168 Hai Bà Trưng, Phường Tân An-Quận Ninh Kiều-TP. Cần Thơ, áp dụng những kiến thức đã học kết hợp với kinh nghiệm thực tế, nay luận văn đã được chỉnh sửa và hoàn thành. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với thầy Lâm Phúc Nhân và cô Phạm Thanh Hương phòng thí nghiệm Chi Cục Thủy Sản TP. Cần Thơ đã tận tình hướng dẫn và chỉ dạy cho em suốt thời gian làm đề tài. Em xin chân thành cám ơn quý thầy cô – Khoa Sinh Học Ứng Dụng – Trường Đại Học Tây Đô đã tận tình dạy bảo, truyền đạt cho em những kiến thức qúy báu trong những năm học vừa qua, tạo dựng hành trang để em bước vào cuộc sống sau này. Chân thành cám ơn cha mẹ và người thân luôn bên cạnh ủng hộ, động viên và đóng góp ý kiến trong suốt thời gian qua. Xin cám ơn tất cả cô chú, anh chị trong Chi Cục Thủy Sản đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ và đóng góp ý kiến bổ ích để em hoàn thành thực tập tốt nghiệp. Chân thành cám ơn tất cả các bạn trong lớp NTTS K1 trong thời gian qua luôn ủng hộ, động viên để hoàn thành thực tập tốt nghiệp. Cuối cùng em xin chúc quý thầy cô – Khoa Sinh Học Ứng Dụng – Trường Đại Học Tây Đô vui, khỏe, công tác tốt và không ngừng con đường cống hiến cho sự nghiệp giáo dục. Với sự hiểu biết còn hạn hẹp và thu thập tài liệu còn hạn chế nên báo cáo tốt nghiệp không tránh khỏi sự sai sót. Kính mong được sự đóng góp ý kiến của quý thầy cô và các bạn. Em xin chân thành cám ơn và ghi nhớ! 4 TÓM TẮT Vi khuẩn Edwardsiella sp và Aeromonas sp là hai dòng vi khuẩn gây bệnh phổ biến trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) hiện nay. Nên việc sử dụng kháng sinh thường xuyên để điều trị bệnh dẫn đến tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn. Mục tiêu của đề tài là “Xác định được loại kháng sinh còn nhạy với vi khuẩn Edwardsiella sp và Aeromonas sp để việc điều trị đạt hiệu quả cao”. Đề tài thực hiện kháng sinh đồ lên 2 vi khuẩn trên, với 13 loại kháng sinh trên 10 chủng mỗi dòng vi khuẩn. Vi khuẩn được phân lập từ cá tra bệnh mủ gan và xuất huyết tại Cần Thơ và An Giang quý 2 năm 2010. Kết quả đã phân lập được vi khuẩn Edwardsiella sp và Aeromonas sp. Kết quả kháng sinh đồ cho thấy: các kháng sinh có tỉ lệ % nhạy với vi khuẩn Edwardsiella sp trên 75% là: ampicillin, amoxicillin, ciprofloxacin. Các kháng sinh có tỉ lệ % nhạy với vi khuẩn Aeromonas sp trên 75% là: enrofloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin, ofloxacin. Ngoài ra, đề tài đã xác định được các loại kháng sinh nhạy đồng thời với cả 2 vi khuẩn Edwardsiella sp và Aeromonas sp, ở Cần Thơ là: ciprofloxacin, ở An Giang là: ofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin và florfenicol. Các kháng sinh kháng với Edwardsiella sp với tỉ lệ % kháng >50% là: colistin, doxycyclin, tetracyclin, enrofloxacin, florfenicol, kanmycin và rifamycin. Các kháng sinh kháng với Aeromonas sp với tỉ lệ % kháng >50% là: ampicillin, amoxicillin, cefalexin, colistin, tetracyclin, kanamycin và rifamycin. Từ khóa: Edwardsiella, Aeromonas , kháng sinh. 5 LỜI CAM KẾT Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác. Cần Thơ, ngày 3 tháng 08 năm 2010 Nguyễn Thị Minh Trang 6 MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ...........................................................................................................i TÓM TẮT............................................................................................................... ii MỤC LỤC...............................................................................................................iv DANH SÁCH BẢNG .............................................................................................vi DANH SÁCH HÌNH ............................................................................................ vii DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT.............................................................................. ix CHƯƠNG I..............................................................................................................1 ĐẶT VẤN ĐỀ ..........................................................................................................1 1.1 Giới thiệu..........................................................................................................1 1.2 Mục tiêu đề tài..................................................................................................2 1.3 Nội dung đề tài .................................................................................................2 CHƯƠNG II ............................................................................................................3 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ......................................................................................3 2.1 Đặc điểm sinh học cá tra .................................................................................3 2.1.1 Hệ thống phân loại...................................................................................3 2.1.2 Đặc điểm hình thái...................................................................................3 2.1.3 Phân bố ....................................................................................................3 2.1.4 Đặc điểm dinh dưỡng .............................................................................3 2.1.5 Đặc điểm sinh trưởng .............................................................................4 2.1.6 Đặc điểm sinh sản ...................................................................................4 2.2 Tổng quan về vi khuẩn Edwardsiella sp và Aeromonas sp .............................4 2.2.1 Vi khuẩn Edwardsiella sp.......................................................................4 2.2.2 Vi khuẩn Aeromonas sp...........................................................................5 2.3 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn Edwardsiella sp và Aeromonas sp…6 2.3.1 Nghiên cứu trên thế giới ..........................................................................6 2.3.2 Nghiên cứu ở Việt Nam...........................................................................6 2.4 Tổng quan về các loại kháng sinh ....................................................................7 2.4.1 Định nghĩa ..............................................................................................7 2.4.2 Nguyên tắc sử dụng kháng sinh...............................................................7 2.4.3 Các loại kháng sinh phổ biến hiện nay....................................................7 7 2.5 Các nghiên cứu về thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản ..............18 CHƯƠNG III.........................................................................................................20 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............................................20 3.1 Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................20 3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................20 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu ...............................................................................20 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất.................................................................20 3.2 Phương pháp nghiên cứu................................................................................20 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu ............................................................................20 3.2.2 Phương pháp thu mẫu ............................................................................20 3.2.3 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn.......................…………21 3.2.4 Phương pháp làm kháng sinh đồ… ...................................................... 22 CHƯƠNG IV.........................................................................................................24 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..............................................................................24 4.1 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn Edwardsiella sp và Aeromonas sp..................................................................................................24 4.2 Kết quả kháng sinh đồ ....................................................................................26 4.2.1 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn Edwardsiella sp tại 2 tỉnh Cần Thơ và An Giang ....................................................................................27 4.2.2 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn Aeromonas sp tại 2 tỉnh Cần Thơ và An Giang ...................................................................................31 4.2.3 Khảo sát tính nhạy của vi khuẩn Edwardsiella sp và Aeromonas sp ở 2 tỉnh Cần Thơ và An Giang ...............................................................34 CHƯƠNG V ..........................................................................................................37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ..................................................................................37 5.1 Kết luận .........................................................................................................37 5.2 Đề xuất ...........................................................................................................37 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................38 PHỤ LỤC ...............................................................................................................A 8 DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 4.1: Kết quả kiểm tra các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Edwardsiella sp và Aeromonas sp .....................................................25 Bảng 4.2: Tỉ lệ tính nhạy của 10 chủng vi khuẩn Edwardsiella sp với 13 loại kháng sinh ...................................................................................28 Bảng 4.3: Tỉ lệ tính nhạy của 10 chủng vi khuẩn Aeromonas sp với 13 loại kháng sinh ..........................................................................................32 9 DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1: Hình dạng bên ngoài của cá tra ............................................................3 Hình 2.2: Vi khuẩn Aeromonas hydrophila có một tiêm mao .............................5 Hình 2.3: Công thức cấu tạo ampicillin ................................................................8 Hình 2.4: Mô hình phân tử ampicillin .................................................................8 Hình 2.5: Công thức cấu tạo amoxcillin................................................................9 Hình 2.6: Mô hình phân tử amoxcillin..................................................................9 Hình 2.7: Công thức cấu tạo cefalexin ................................................................10 Hình 2.8: Công thức cấu tạo colistin ...................................................................10 Hình 2.9: Công thức cấu tạo doxycyclin .............................................................11 Hình 2.10: Mô hình phân tử doxycyclin .............................................................11 Hình 2.11: Công thức cấu tạo tetracylin ............................................................12 Hình 2.12: Công thức cấu tạo enrofloxacin ........................................................13 Hình 2.13: Công thức cấu tạo ciprofloxacin.......................................................14 Hình 2.14: Mô hình phân tử ciprofloxacin .........................................................14 Hình 2.15: Công thức cấu tạo norfoxacin...........................................................15 Hình 2.16: Công thức cấu tạo ofloxacin..............................................................15 Hình 2.17: Công thức cấo tạo florfenicol ...........................................................16 Hình 2.18: Công thức hóa học kanamycin..........................................................17 Hình 2.19: Công thức cấu tạo rifamycin.............................................................18 Hình 3.1: Quy trình phân lập vi khuẩn Edwardsiella sp và Aeromonas sp .....21 Hình 4.1: Nội tạng cá tra bị bệnh mủ gan...........................................................24 Hình 4.2: Cá tra bị bệnh xuất huyết....................................................................24 Hình 4.3: Nội tạng cá tra bị xuất huyết...............................................................24 Hình 4.4: Kết quả tách ròng vi khuẩn Edwardsiella sp .....................................25 Hình 4.5: Kết quả tách ròng vi khuẩn Aeromonas sp........................................25 Hình 4.6: Hình nhuộm Gram của vi khuẩn Edwardsiella sp (100X)................25 Hình 4.7: Hình nhuộm Gram của vi khuẩn Aeromonas sp (100X) ..................25 10 Hình 4.8: Vi khuẩn Aeromonas sp mới thực hiện test O/F ...............................26 Hình 4.9: Vi khuẩn Aeromonas sp cho phản ứng lên men sau 24 giờ ..............26 Hình 4.10: Kết quả kháng sinh đồ chủng Edwardsiella sp sau 48 giờ ..............27 Hình 4.11: Đường kính trung bình vô trùng của thuốc kháng sinh đối với Edwardsiella sp tại Cần Thơ và An Giang ......................................30 Hình 4.12: Kết quả kháng sinh đồ của chủng Aeromonas sp sau 24 giờ .........31 Hình 4.13: Đường kính trung bình vô trùng của thuốc kháng sinh đối với Edwardsiella sp tại Cần Thơ và An Giang ................................33 Hình 4.14: Phần trăm nhạy của vi khuẩn Edwardsiella sp và Aeromonas sp..34 Hình 4.15: Đường kính trung bình vô trùng của thuốc kháng sinh đối với Aeromonas sp và Edwardsiella sp tại An Giang........................35 11 DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT 1. ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long 2. MHA: Mueller hinton agar 3. TSA: Trypic soy agar 4. Ampicillin (AM) 5. Amoxicillin (AMX) 6. Cefalexin (CN) 7. Colistin (CS) 8. Doxycyclin (DO) 9. Tetracyclin (TE) 10. Enrofloxacin (ENR) 11. Ciprofloxacin (CIP) 12. Norfloxacin (NOR) 13. Ofloxacin (OF) 14. Florfenicol (FFC) 15. Kanamycin (K) 16. Rifamycin (RA) 17. EIA: Edwardsiell ictaluri agar 12 CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là loài cá trơn nước ngọt được nuôi phổ biến ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, đặc biệt ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ… Trong vài năm trở lại đây, phong trào nuôi cá tra xuất khẩu ở Đồng Bằng Sông Cửu Long tăng rất nhanh, đem về cho đất nước nguồn ngoại tệ rất lớn. Tính đến ngày 14/08/2009, diện tích thả nuôi cá tra của các tỉnh ĐBSCL là 5.154 ha tăng 2,7 lần so với đầu năm 2009; tập trung nhiều nhất ở 3 tỉnh là: Đồng Tháp 1.489 ha, Cần Thơ 1.110 ha và An Giang 1.023 ha, chiếm khoảng 70,3% diện tích thả nuôi toàn vùng. Cũng đến giữa tháng 08/2009, sản lượng cá tra thu hoạch toàn vùng là 457.000 tấn, gấp 8,2 lần so với đầu năm, sản lượng cá thu hoạch trong 8 tháng đầu năm tăng liên tục với mức tăng bình quân là 13,5%/tháng. Tổng sản lượng cá tra xuất khẩu 8 tháng qua là 325.920 tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt hơn 737 triệu USD. Khi những lợi ích do nghề nuôi thủy sản mang lại ngày càng cao, thì nghề nuôi ngày càng được thâm canh hóa. Tuy nhiên, khi nghề nuôi được thâm canh hóa với mật độ cao thì vấn đề dịch bệnh xảy ra thường xuyên hơn và thiệt hại cũng nhiều hơn (Đặng Thị Hoàng Oanh và csv, 2004). Trong số các bệnh thường gặp trên cá tra như: đốm đỏ, trắng da, phù đầu phù mắt, xuất huyết, bệnh do ký sinh trùng ngoại ký sinh… thì bệnh xuất huyết và bệnh đốm trắng trên gan gây thiệt hại nghiêm trọng trong nuôi cá tra thâm canh. Theo Ferguson và csv (2001) thì bệnh gan thận mủ được phát hiện lần đầu tiên tại Việt Nam 1998, khi cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết tăng cao 10-90% tùy thuộc vào cách quản lý và cỡ cá nuôi (trích dẫn bởi Từ Thanh Dung và csv, 2004). Tương tự đối với bệnh xuất huyết trên cá tra cũng gây ra tỉ lệ chết rất cao từ 60-70% nếu điều trị không kịp thời (Nguyễn Chính, 2005). Hiện nay, việc sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh vi khuẩn trên động vật thủy sản ở một số nước là khá lớn như: Trung Quốc 1.500 tấn, Nhật Bản 1.100 tấn, Thái Lan 420 tấn, Ấn Độ 400 tấn… Việt Nam 50 tấn/năm (Mudd, T., 2003. Trích dẫn bởi Tangtrongpiros, J., 2005). Hiện nay trên thị trường có nhiều loại kháng sinh để trị bệnh vi khuẩn trên cá tra, nên người dân sử dụng tràn lan các loại kháng sinh và không tuân thủ nghiêm các quy định, dẫn đến tình trạng lạm dụng thuốc, giảm sức đề kháng của vật nuôi và tạo ra những dòng vi khuẩn kháng thuốc. Hậu quả đã gây thiệt hại về kinh tế, tốn kém nhiều chi phí cho người nuôi do việc điều trị bệnh kém hiệu quả. Vì thế, cần xác định lại các loại kháng sinh còn nhạy với vi khuẩn, để giúp người dân lựa chọn đúng loại kháng sinh, góp phần hạn chế thiệt hại do vi khuẩn 13 Edwardsiella sp và Aeromonas sp trên cá tra gây ra, giảm bớt rủi ro cho người nuôi là rất cần thiết. Chính vì vậy, đề tài: “Xác định tính nhạy của một số loại thuốc kháng sinh đối với Edwardsiella sp và Aeromonas sp gây bệnh trên cá tra tại Cần Thơ và An Giang” được thực hiện. 1.2 Mục tiêu đề tài Dùng phương pháp kháng sinh đồ nhằm xác định được các loại kháng sinh còn nhạy với vi khuẩn để việc điều trị đạt hiệu quả cao. Đề tài góp phần giảm chi phí hóa chất, giảm ô nhiễm môi trường do ít dùng thuốc kháng sinh, cá được điều trị sớm làm giảm tỉ lệ hao hụt trên cá, ổn định năng suất và chất lượng. 1.3 Nội dung đề tài Phân lập vi khuẩn Edwardsiella sp và Aeromonas sp từ gan, thận và tỳ tạng trên cá tra bệnh. Lập kháng sinh đồ của hai loại vi khuẩn trên đối với 13 loại thuốc kháng sinh. 14 CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm sinh học cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) 2.1.1 Hệ thống Phân loại Theo hệ thống phân loại của Rainboth, W.J, 1996 Bộ Siluriformes Họ Pangasiidae (Bleeker, 1858) Giống Pangasianodon (Rainboth, 1996) Loài Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878) (trích dẫn bởi Nguyễn Văn Thường, 2008) Hình 2.1: Hình dạng bên ngoài của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) 2.1.2 Đặc điểm hình thái Cá tra là cá da trơn, thân dài, dẹp ngang, lưng xám đen, bụng hơi bạc, miệng rộng có hai đôi râu dài, đầu nhỏ vừa phải, mắt tương đối to. Vây lưng cao, có một gai cứng có răng cưa. Vây ngực có ngạnh, bụng có 8 tia phân nhánh, trong khi các loài khác có 6 tia (Phạm Văn Khánh, 1996). 2.1.3 Phân Bố Cá tra có tên khoa học Pangasianodon hypophthalmus trước đây có tên là P. micronemus hay P. sutchi, phân bố ở lưu vực sông Mekong, có mặt ở cả 4 nước Lào, Việt Nam, Campuchia và Thái Lan. Cá có khả năng sống tốt trong điều kiện ao tù nước đọng, nhiều chất hữu cơ, oxy hòa tan thấp và có thể nuôi với mật độ cao (Nguyễn Văn Kiểm, 2004). 2.1.4 Đặc điểm dinh dưỡng Cá tra là loài cá ăn tạp. Trong tự nhiên, cá ăn được mùn bã hữu cơ, rễ cây thủy sinh, rau quả, tôm, tép, cua, côn trùng, ốc và cá... Cá nuôi trong ao sử dụng nhiều loại thức 15 ăn khác nhau như: Thức ăn tự chế, thứ