Luận văn Xây dựng quy trình khuếch đại hệ gen ty thể chó có xoáy lưng thái lan bằng kĩ thuật long-Pcr và so sánh quan hệ di truyền giữa chó có xoáy lưng thái lan và Phú Quốc

Thành phố Hồ Chí Minh – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Huỳnh Thị Bích Liễu XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHUẾCH ĐẠI HỆ GEN TY THỂ CHÓ CÓ XOÁY LƯNG THÁI LAN BẰNG KĨ THUẬT LONG-PCR VÀ SO SÁNH QUAN HỆ DI TRUYỀN GIỮA CHÓ CÓ XOÁY LƯNG THÁI LAN VÀ PHÚ QUỐC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Huỳnh Thị Bích Liễu XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHUẾCH ĐẠI HỆ GEN TY THỂ CHÓ CÓ XOÁY LƯNG THÁI LAN BẰNG KĨ THUẬT LONG-PCR VÀ SO SÁNH QUAN HỆ DI TRUYỀN GIỮA CHÓ CÓ XOÁY LƯNG THÁI LAN VÀ PHÚ QUỐC Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.Các số liệu và các kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Huỳnh Thị Bích Liễu LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, đầu tiên tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Trần Hoàng Dũng – người Thầy đã tận tụy, hết lòng quan tâm, hướng dẫn và hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong những lúc khó khăn nhất. Trong suốt quá trình làm đề tài Thầy luôn nhắc nhở, sửa chữa những sai sót, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Thầy TS. Chung Anh Dũng thuộc phòng Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp Miền Nam đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này. Xin trân trọng biết ơn quý Thầy, Cô thuộc Khoa Sinh học và Phòng Đào tạo Sau Đại học – Trường Đại học Sư phạm Tp. HCM đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập. Xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp Miền Nam và Viện Kĩ thuật Công nghệ cao NTT – Trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu tại Viện. Cảm ơn các anh, chị, em, bạn bè thuộc phòng Genome & Bioinformatics - Viện Kĩ thuật Công nghệ cao - Trường ĐH Nguyễn Tất Thành và Phòng Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp Miền Nam đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Cuối cùng tôi xin gởi đến ba mẹ - người luôn ở bên cạnh tôi trong những lúc khó khăn nhất - lòng biết ơn sâu sắc. Ba mẹ cho con niềm tin, nghị lực trong cuộc sống cũng như động viên và hỗ trợ cho con mọi mặt cả về vật chất lẫn tinh thần. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2014 Tác giả Huỳnh Thị Bích Liễu MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các từ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục hình ảnh MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ................................................................................................ 1 2. Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 2 3.1. Nội dung 1: Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA tổng số của mẫu chó Thái Lan. ........................................................................................................................ 2 3.2. Nội dung 2: Xây dựng quy trình khuếch đại các mảnh của hệ gen ty thể chó Thái Lan bằng kĩ thuật Long-PCR............................................................................ 2 3.3. Nội dung 3: Giải và hiệu chỉnh trình tự năm gen của hệ gen ty thể chó có xoáy Thái Lan ........................................................................................................... 2 3.4. Nội dung 4: Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền và xác định mối quan hệ di truyền chó Phú Quốc và chó Thái Lan dựa trên phân tích phát sinh chủng loài dựa vào trình tự các gen. ........................................................................................... 2 4. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................ 3 Chương 1. TỔNG QUAN .............................................................................................. 5 1.1.Giới thiệu về giống chó Phú Quốc-Nguồn gốc giống chó Phú Quốc Việt Nam ... 5 1.1.1. Phân loại ...................................................................................................... 5 1.1.2. Đặc điểm chung của chó có xoáy Phú Quốc ............................................... 6 1.1.3. Nghi vấn về nguồn gốc của giống chó Phú Quốc Việt Nam ...................... 6 1.2. Đặc điểm chung của chó có xoáy Thái Lan ................................................... 8 1.3. Các nghiên cứu đa dạng di truyền và tiến hóa phát sinh chủng loài dựa trên trình tự hệ gen ty thể .................................................................................................. 10 1.3.1. Đặc điểm và cơ chế di truyền của hệ gen ty thể động vật hữu nhũ .......... 10 1.3.2. Ứng dụng của hệ gen ty thể trong nghiên cứu tiến hóa và phát sinh chủng loài ................................................................................................................... 11 1.3.3. Các nghiên cứu đa dạng di truyền và tiến hóa phát sinh chủng loài chó dựa trên toàn bộ trình tự hệ gen ty thể .................................................................... 12 Chương 2. VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP .................................................................. 20 2.1. Vật liệu, hóa chất và địa điểm nghiên cứu ....................................................... 20 2.1.1. Vật liệu và hóa chất ................................................................................... 20 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu .............................................................................. 23 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 23 2.2.1. Phương pháp thu mẫu và tách DNA tổng số ............................................. 23 2.2.2. Phương pháp điện di trên gel agarose ....................................................... 27 2.2.3. Khuếch đại các mảnh gen ty thể bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................................................................................................. 27 2.2.4. Phương pháp giải trình tự .......................................................................... 33 2.2.5. Hiệu chỉnh trình tự .................................................................................... 33 2.2.6. So sánh với cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen ........................................... 35 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 37 3.1. Thu thập mẫu ...................................................................................................... 37 3.2. Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA tổng số .................................................... 37 3.3. Định loại kiểu đơn bội chó có xoáy Thái Lan bằng trình tự vùng kiểm soát .. 41 3.3.1. Thiết lập phản ứng PCR khuếch đại vùng kiểm soát ................................ 41 3.3.2. Kết quả giải và phân tích trình tự DNA vùng kiểm soát ........................... 42 3.3.3. Định loại kiểu đơn bội cho chó có xoáy lưng Thái Lan ............................ 45 3.4. Xây dựng quy trình phản ứng khuếch đại các mảnh gen ty thể bằng kĩ thuật Long-PCR .................................................................................................................. 48 3.4.1. Xây dựng quy trình phản ứng PCR khuếch đại mảnh 1 ........................... 49 3.4.2. Xây dựng quy trình phản ứng khuếch đại mảnh 2 và mảnh 3 hệ gen ty thể chó có xoáy lưng Thái Lan ..................................................................................... 51 3.5. Giải và phân tích trình tự hệ gen ty thể chó Thái Lan mang kiểu đơn bội A11 .. .......................................................................................................................... 54 3.5.1. Thu nhận và hiệu chỉnh kết quả giải trình tự ............................................... 56 3.5.2. Lắp ráp các trình tự đã hiệu chỉnh ............................................................... 58 3.5.3. Phân tích phát sinh loài ................................................................................ 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 64 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Phương pháp hiệu chỉnh và lắp ráp trình tự các gen của hệ gen ty thể Phụ lục 2. Phương pháp sơ bộ xác định tên loài của các trình tự DNA vùng D-loop bằng thuật toán BLAST DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT µg Microgram µL Microlit BLAST Local Alignment Search Tool Bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid DNAse Deoxyribonuclease dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylenediamine tetraacetate Ep Eppendorf F Forward FCI Federation Cynologique International IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry Kb Kilo base mtDNA Mitochondrial DNA NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction R Reverse RNA Ribonuclease RNAse Ribonuclease rRNA Ribosomal RNA tRNA Transport RNA SDS Sodium dodecyl sulfate SSC buffer Sodium clorua NaCl, Sodium Citrate C6H5Na TBE Tris Borate EDTA TE Tris EDTA Tm Melting Temperature U Unit UV Ultraviolet V Volume DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Hóa chất tách chiết DNA .............................................................................. 20 Bảng 2.2. Hóa chất sử dụng trong kĩ thuật PCR ........................................................... 21 Bảng 2.3. Hóa chất điện di ............................................................................................ 21 Bảng 2.4. Dụng cụ và thiết bị ........................................................................................ 22 Bảng 2.5. Cặp mồi đặc hiệu sử dụng trong phản ứng khuếch đại vùng kiểm soát (D- loop) ............................................................................................................................... 28 Bảng 2.6. Các thành phần có trong phản ứng khuếch đại vùng kiểm soát (D-loop) .... 29 Bảng 2.7. Chu trình nhiệt khuếch đại vùng kiểm soát (D-loop) ................................... 29 Bảng 2.8. Các cặp mồi khuếch đại cho phản ứng PCR ................................................. 30 Bảng 2.9. Các thành phần phản ứng PCR khuếch đại hệ gen ty thể chó có xoáy lưng Thái Lan sử dụng MasterAmp Extra-Long PCR 2X PreMixes .................................... 30 Bảng 2.10. Các thành phần phản ứng PCR khuếch đại mảnh 1, 2, 3 lần 1 hệ gen ty thể chó có xoáy lưng Thái Lan sử dụng MasterAmp Extra-Long PCR 2X PreMixes ....... 31 Bảng 2.11. Chu trình nhiệt khuếch đại mảnh 1 lần 1 .................................................... 31 Bảng 2.12. Chu trình nhiệt khuếch đại mảnh 2, mảnh 3 lần 1 ...................................... 31 Bảng 2.13. Các thành phần phản ứng PCR khuếch đại mảnh 1, 2, 3 lần 2 hệ gen ty thể chó có xoáy lưng Thái Lan sử dụng MasterAmp Extra-Long PCR 2X PreMixes ....... 32 Bảng 2.14. Chu trình nhiệt khuếch đại mảnh 1 lần 2 .................................................... 32 Bảng 2.15. Chu trình nhiệt khuếch đại mảnh 2 lần 2 .................................................... 32 Bảng 2.16. Chu trình nhiệt khuếch đại mảnh 3 lần 2 .................................................... 33 Bảng 3.1. Kết quả đo quang DNA tổng số được tách chiết theo quy trình FBI ............ 38 Bảng 3.2. Kết quả đo quang DNA tổng số được tách chiết theo quy trình có hiệu chỉnh ....................................................................................................................................... 38 Bảng 3.3. Kết quả đo quang của 11 mẫu chó Phú Quốc và một mẫu cho Thái Lan ..... 40 Bảng 3.4 Ba cặp mồi để khuếch đại hệ gen ty thể chó có xoáy Thái Lan ..................... 49 Bảng 3.5. Thông tin về năm gen mã hóa protein trong nghiên cứu .............................. 55 Bảng 3.6. Chín cặp mồi dành để giải trình tự các vùng gen trong nghiên cứu ............. 55 DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1. Chó có xoáy lưng Phú Quốc ............................................................................ 5 Hình 1.2. Các dạng xoáy lông trên sống lưng chó Phú Quốc ......................................... 6 Hình 1.3. Chó có xoáy lưng Thái Lan ............................................................................. 9 Hình 1.4. Cấu trúc ty thể ............................................................................................... 11 Hình 1.5 Các trình tự hệ gen ty thể chó được đăng ký trên NCBI ................................ 14 Hình 2.1. Vị trí bắt cặp của mồi 15412F và 16625R trên vùng kiểm soát (D-loop) ..... 28 Hình 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của 14 mẫu chó Phú Quốc và một mẫu chó Thái Lan ......................................................................................................................... 40 Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng D-loop của chó có xoáy lưng Thái Lan ....................................................................................................................................... 42 Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng D-loop của 8 mẫu chó có xoáy lưng Phú Quốc ....................................................................................................................... 42 Hình 3.4. Biểu đồ huỳnh quang của trình tự vùng kiểm soát chó Thái Lan trên mồi 15412F ........................................................................................................................... 43 Hình 3.5. Biểu đồ huỳnh quang của trình tự vùng kiểm soát chó Thái Lan trên mồi 16625R ........................................................................................................................... 43 Hình 3.6. Đoạn trình tự đồng nhất vùng kiểm soát chó có xoáy lưng Thái Lan ........... 44 Hình 3.7. Đại diện một đoạn trình tự đồng nhất vùng kiểm soát của 3/8 mẫu khảo sát ....................................................................................................................................... 44 Hình 3.8. Kết quả BLAST của mẫu Thái Lan trên NCBI ............................................. 45 Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loài sử dụng phương pháp Neighbor-Joining. Mô hình tiến hóa là Kimura hai thông số với phân bố Gamma là 4. Phép phân tích dựa trên 181 trình tự bao gồm 531 nucleotides .................................................................................. 47 Hình 3.10. Sơ đồ hệ thống các cặp mồi khuếch đại các mảnh gen ty thể chó Thái Lan và vị trí các gen cần giải trình tự ................................................................................... 49 Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 1 lần 1 hệ gen ty thể chó Thái Lan .. 50 Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 1lần 2 hệ gen ty thể chó Thái Lan ... 51 Hình 3.13. Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 2 lần 1 .............................................. 52 Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 3 lần 1 .............................................. 52 Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 2 lần 2 ............................................. 53 Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR mảnh 3 lần 2 .............................................. 54 Hình 3.17. Dữ liệu DNA ty thể chó thuộc kiểu đơn bội A11 ........................................ 55 Hình 3.18. Biểu đồ huỳnh quang với các đỉnh huỳnh quang nền ................................. 57 Hình 3.19. Biểu đồ huỳnh quang có base không rõ ràng .............................................. 58 Hình 3.20. Biểu đồ huỳnh quang có cường độ tín hiệu thấp ......................................... 58 Hình 3.21. Trình tự đồng nhất của chó có xoáy lưng Thái Lan trên phần mềm SeaView ....................................................................................................................................... 59 Hình 3.22. Cây tiến hóa dựng bằng thuật toán Maximum-Likehood từ trình tự 5 gen ND1, ND2, ATP8, ND4 và CYTB có tổng chiều dài 4832 bp của 77 trình tự. ............ 61 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Trên thế giới hiện nay có khoảng hơn 400 loài chó, trong đó có ba giống chó có xoáy lưng là: chó lông xoáy Rhodesia ở Nam Phi, chó lông xoáy Thái Lan và chó lông xoáy Phú Quốc Việt Nam. Chó Phú Quốc là giống chó đặc hữu của vùng biển Phú Quốc tỉnh Kiên Giang, Việt Nam, là giống chó đẹp, thông minh, trung thành và dũng mãnh. Nó từ xa xưa đã giúp đỡ con người trong việc đi săn và canh gác. Tuy nhiên, chó xoáy Phú Quốc vẫn chưa có nguồn gốc rõ ràng, có rất nhiều tranh cãi xung quanh nguồn gốc của chó Phú Quốc Các nhà khoa học nước ta có đưa ra những bằng chứng lịch sử để chứng minh chó lông xoáy Phú Quốc là loài chó đặc hữu của Việt Nam, nhưng điều này không có tính thuyết phục cao. Vì các bằng chứng được đưa ra chỉ dựa vào những đặc điểm hình thái bên ngoài. Do đó, việc xác định nguồn gốc chó xoáy Phú Quốc được các nhà khoa học rất quan tâm. Với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử đã trở thành công cụ hữu hiệu trong việc xác định nguồn gốc và mối quan hệ di truyền của các sinh vật. Từ năm 2012, Phòng Genomics & Bioinformatic, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu giải trình tự hệ gen ty thể chó Phú Quốc để đánh giá độ đa dạng di truyền chó Phú Quốc giống tại Tp. Hồ Chí Minh” cho ra nhiều kết quả nổi bật. Theo đó Chó lưng xoáy Phú Quốc mang kiểu gen đơn bội (haplotype) dạng E là dạng rất hiếm trên thế giới (chỉ chiếm 1-2%) phân bố hạn hẹp ở khu vực Đông Á như ShiBa Nhật Bản, Indo Hàn Quốc, Shar-Pei Trung Quốc và PungSang Triều tiên. Hơn nữa, nghiên cứu hệ gen ty thể của chó Phú Quốc, nhóm nghiên cứu còn thấy, hệ gen ty thể chó Phú Quốc có mức độ tương đồng đến 98% với hệ gen ty thể chó sói xám. Tuy nhiên trong nghiên cứu này, các tác giả chưa phân tích hệ gen ty thể của chó lưng có xoáy Thái Lan để tìm hiểu quan hệ nguồn gốc giữa chó lưng có xoáy Thái Lan và lưng có xoáy Phú Quốc. Để có thêm những bằng chứng chứng minh sự phát triển song song của hai loài chó này cần có những nghiên cứu sâu hơn về chó có xoáy Thái Lan. Do vậy chúng tôi muốn giải trình tự hệ gen ty thể chó lưng có xoáy Thái Lan để so sánh với hệ gen ty 2 thể chó lưng có xoáy Phú Quốc, nhằm tìm quan hệ phát sinh chủng loài của hai loài có hình thái bên ngoài tương cận nhau này. 2. Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình khuếch đại toàn bộ hệ gen ty thể chó có xoáy lưng Thái Lan bằng kĩ thuật Long-PCR để thu thập dữ liệu phân tử nhằm phân tích quan hệ di truyền giữa chó có xoáy lưng Thái Lan và Phú Quốc. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Nội dung 1: Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA tổng số của mẫu chó Thái Lan. 3.2. Nội dung 2: Xây dựng quy trình khuếch đại các mảnh của hệ gen ty thể chó Thái Lan bằng kĩ thuật Long-PCR - Nghiên cứu các cặp mồi phổ quát để khuếch đại các mảnh của hệ gen ty thể chó có xóay Thái Lan. - Nghiên cứu chuẩn hóa điều kiện phản ứng khuếch đại các mảnh của hệ gen ty thể chó có xoáy Thái Lan bằng kĩ thuật Long-PCR. 3.3. Nội dung 3: Giải và hiệu chỉnh trình tự năm gen của hệ gen ty thể chó có xoáy Thái Lan - Giải trình tự của năm gen của hệ gen ty thể chó có xoáy Thái Lan. - Hiệu chỉnh kết quả giải trình tự. - Tích hợp các kết quả giải trình tự. 3.4. Nội dung 4: Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền và xác định mối quan hệ di truyền chó Phú Quốc và chó Thái Lan dựa trên phân tích phát sinh chủng loài dựa vào t