Lưu trần công huy, đại học nông lâm tp. Hồ Chí Minh, tháng 07/2007. “khai thác dữ liệu ests (expressed sequence tags) ở chi cam chanh (citrus) cho việc phát triển marker phân tử ssr (simple sequence repeats)”

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHAI THÁC DỮ LIỆU ESTs (EXPRESSED SEQUENCE TAGs) Ở CHI CAM CHANH (CITRUS) CHO VIỆC PHÁT TRIỂN MARKER PHÂN TỬ SSR (SIMPLE SEQUENCE REPEATS) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003-2007 Sinh viên thực hiện: LƢU TRẦN CÔNG HUY Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 ii LỜI CẢM ƠN Xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ và gia đình đã hết lòng hỗ trợ, động viên về mọi mặt để tôi hoàn thành đề tài. Xin chân thành cảm tạ Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ Sinh Học cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. Chân thành cảm ơn TS. Trần Thị Dung đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. Xin cảm ơn CN. Lƣu Phúc Lợi đã giúp đỡ, hỗ trợ kiến thức và tài liệu chuyên môn. Xin cảm ơn bạn bè thân yêu của lớp DH03SH đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài. Tp. Hồ Chí Minh tháng 08 năm 2007 Sinh viên thực hiện Lƣu Trần Công Huy iii TÓM TẮT KHOÁ LUẬN LƢU TRẦN CÔNG HUY, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, tháng 07/2007. “KHAI THÁC DỮ LIỆU ESTs (EXPRESSED SEQUENCE TAGs) Ở CHI CAM CHANH (CITRUS) CHO VIỆC PHÁT TRIỂN MARKER PHÂN TỬ SSR (SIMPLE SEQUENCE REPEATS)” Hội đồng hƣớng dẫn TS. Trần Thị Dung Cử Nhân. Lƣu Phúc Lợi Khóa luận đƣợc thực hiện tại bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trƣờng đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, trong khoảng thời gian từ tháng 3/2007 đến 8/2007. Trong những năm qua, sinh học không ngừng phát triển và đã tạo ra những kho dữ liệu miễn phí và trực tuyến rất lớn về trình tự gene, protein, bộ gene ... của thực vật lẫn động vật nhƣ các cơ sở dữ liệu sinh học lớn nhƣ NCBI, EMBL, DDBj…. Một trong những CSDL lớn đó là ESTs (Expressed Sequence Tags), trong đó có ESTs của chi cam chanh (citrus). Những trình tự ESTs này có thể đƣợc sử dụng để khai thác các SSRs (Simple Sequence Repeats). Những SSRs này rất hữu ích vì chúng có rất nhiều ứng dụng nhƣ genome mapping, phenotype mapping và chọn giống thực vật nhờ marker phân tử. Hơn thế nữa, việc phát triển marker SSR từ EST có chi phí rất thấp so với phƣơng pháp phân lập SSR truyền thống. Để đạt đƣợc mục tiêu trên, khóa luận cần đảm bảo thực hiện những nội dung nhƣ sau: 1) Dùng Perl script để thu nhận trình tự các nucleotide của ESTs của Citrus vừa tìm từ trang cơ sở dữ liệu GenBank NCBI. 2) Tìm và tách các đoạn microsatellite có thể có trong mỗi đoạn gen. 3) Tìm SSR nằm trên vùng gen kháng virus Tristeza iv 4) Tìm hiểu về mô hình dữ liệu quan hệ, sử dụng mô hình này vào việc lƣu trữ dữ liệu các trình tự nucleotide và trình tự SSRs của chi cam chanh (Citrus), và tạo cơ sở dữ liệu chứa những trình tự này. Sau đó đƣa các dữ liệu này vào cơ sở dữ liệu chính. 5) Trang web đƣợc thiết kế để chia sẻ thông tin trực tuyến với ngƣời dùng Kết quả Thu nhận đƣợc 191.110 trình tự ESTs của các loài Citrus đƣợc thu thập từ CSDL dbEST và CoreNucleotide của GenBank. Những trình tự ESTs này đƣợc tìm các vùng lặp lại, từ đó xác định đƣợc 28.241 SSRs trong 190412 ESTs . 19755 primers đƣợc thiết kế trên vùng flanking của các SSRs. Các primers này đã đƣợc kiểm tra sự lặp lại và sự bắt cặp đặc hiệu bằng BLAST. Cơ sở dữ liệu có 28241 trình tự SSRs đƣợc chuyển vào CSDL quan hệ và tích hợp vào website BUILDING SSRs DATABASE of Citrus. Sau khi đƣợc loại bỏ các trình tự tạp, nhiễu và dấu các trình tự ở các bào quan, trình tự lặp lại và trình tự vector, các trình tự ESTs đƣợc phân nhóm thành 2 nhóm Contigs và Singletons. Việc nhóm các trình tự giúp ích cho việc giảm bớt các trình tự dƣ thừa, kéo dài các EST-SSR và xác định các trình tự bảo tồn. Kết quả là thêm 1071 primers đƣợc thiết kế cho các EST-SSR đƣợc kéo dài. Ngoài ra, chúng tôi cũng xác định đƣợc 33 EST-SSRs tƣơng đồng gene kháng virus Tristeza bằng công cụ BLAST với ngƣỡng e-value = 10-10 v ABSTRACT LUU TRAN CONG HUY, NONG LAM UNIVERSITY, DATA MINING FOR DEVELOPING SIMPLE SEQUENCE REPEATS (SSR) MARKER IN EXPRESSED SEQUENCE TAGS (ESTs) FROM CITRUS Supervisor: Dr Trần Thị Dung Bsc Lƣu Phúc Lợi The research was carried out at the department of biotechnology at Nong Lam University. Recent advances in genomic technologies have generated a vast amount of publicly available expressed sequence tags (ESTs) in Citrus. These data can be mined to identify Simple sequence repeats (SSRs) or microsatellites. These SSRs are useful because of a broad range of application, such as genome mapping and characterization, phenotype mapping, marker assisted selection of plant breeding, additional map-based cloning of important genes. Moreover, this method of developing SSR marker from ESTs is inexpensive comparing to the traditional methods. Methodology 1) We used perl script to receive EST sequences from database NCBI 2) Finded and separated SSRs include in ESTs database 3) We were learning about relationship database model to used to saved nucleotide, SSRs citrus sequences data and created database contain them. 4) Finding SSR which are homologous with tristeza virus resistance gene. 5) Designed web that contain database control software to share information with users Results: 28,241 SSR-containing ESTs (EST-SSRs) were identified by analyzing 191,110 ESTs sequences belonging to Citrus in dbEST division of GenBank. 19,755 primers, which were filtered with repetition checking and BLAST checking, vi were designed in flanking regions of SSRs. These data were put into relational database and integrated SSR finder tool into the BUILDING SSRs DATABASE of Citrus Website. After cleaning, masking repeat, vector and organelle sequences, the EST-SSR sequences and the related EST sequences without SSRs were assembled into contigs and singletons, to reduce redundancy, to enlarge EST-SSRs for primer designed and to develop consensus sequences. As a result, more 1071 primers were design for these enlarged EST-SSRs. Using a stringent BLAST search with a threshold e-value = 10 -10 against typical pathogen resistance gene database in Citrus, we identified 33 EST-SSRs which are homologous with tristeza virus resistance gene. vii Mục Lục LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... iii TÓM TẮT KHOÁ LUẬN ................................................................................. iv ABSTRACT ...................................................................................................... vi DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................ xi Chƣơng 1 ............................................................................................................ 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề 1.2.Mục tiêu của khóa luận Chƣơng 2 ............................................................................................................ 3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................... 3 2.1 Giớ thiệu về chi cam chanh ........................................................................... 3 2.1.1 Vị trí phân lọai ........................................................................................... 3 2.1.2 Đặc điểm .................................................................................................... 4 2.1.3 Sâu hại và bệnh tật .................................... 6 2.2 EST ............................................................................................................... 7 2.3.1 Sơ lƣợc về EST .......................................................................................... 7 2.3.2 Nguồn gốc của EST ................................................................................... 7 2.3.Sơ lƣợc về phƣơng pháp Microsatellite (SSR) ............................................. 8 2.3.1Những khái niệm về kỹ thuật microsatellite ............................................... 8 2.3.2 Giới thiệu chung ......................................................................................... 9 2.3.2.1 Tính chất .................................................................................................. 9 2.3.2.2 Khuếch đại của microsatellites ............................................................. 10 2.3.2.3 Những giới hạn của microsatellite ........................................................ 11 2.3.3 Các loại microsatellite ............................................................................. 12 2.3.4 Cơ chế hình thành microsatellite ............................................................. 12 viii 2.3.5 Vai trò của microsatellite ......................................................................... 13 2.4 Phƣơng pháp xác định microsatellite truyền thống..................................... 15 2.5 Phƣơng pháp phát hiện microsatellite sử dụng ........................................... 16 2.6 Ứng dụng ..................................................................................................... 18 2.7 Cơ sở dữ liệu sinh học ................................................................................. 18 2.7.1 NCBI ........................................................................................................ 19 2.7.1.1 Vài nét về NCBI .................................................................................... 19 3.1.1.2 Một số cơ sở dữ liệu trong NCBI .......................................................... 19 Chƣơng 3 ......................................................................................................... 20 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .................................................................... 20 3.1 Các chƣơng trình và ngôn ngữ lập trình đƣợc sử dụng............................. 20 3.1.1 Hệ điều hành ............................................................................................ 20 3.1.2 Các chƣơng trình phân tích trình tự ......................................................... 20 3.1.2.1 Chương trình Perl ssrfinder_1 .................................................. 20 3.1.2.2 Chƣơng trình tìm kiếm các trình tự tƣơng đồng – BLAST .................. 22 3.1.2.3 Hệ quả trị CSDL quan hệ Microsoft ACEESS ..................................... 23 3.1.2.4 Egassembler .......................................................................................... 23 3.1.3 Apache web Server .................................................................................. 24 3.4 CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH ......................................................................... 25 Chƣơng 4 .......................................................................................................... 37 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................... 37 4.1 Thu thập trình tự ESTs Citrus từ CSDL dbEST ....................................... 37 4.2 Loại các dữ liệu nhiễu và dƣ bằng công cụ EGassembler bao gồm các bƣớc sau: ........................................................................................................................... 38 4.2.1 Làm sạch trình tự ..................................................................................... 38 4.2.2 Dấu những vùng trình tự nhiễu của vector và adaptors ........................... 39 4.2.3 Dấu những vùng trình tự nhiễu của các bào quan .................................... 39 ix 4.3 Assembling .................................................................................................. 41 4.4 Tìm SSR: bằng SSRFinder v1.0 của Steven Schroeder .............................. 42 4.4.1 BLASTn: ................................................................................................. 43 4.5.Thiết kế và kiểm tra primer ......................................................................... 45 4.6 tBLASTx ..................................................................................................... 48 4.7. Đƣa tất cả các dữ liệu này vào CSDL quan hệ Microsoft ACCESS để dễ dàng truy xuất thông tin. ............................................................................................ 49 4.8 Tích hợp CSDL vừa xây dựng vào web thông qua Apache Server để chia sẽ thông tin qua mạng. .......................................................................................... 49 4.8.1 Trang chủ (HOME PAGE) ...................................................................... 49 4.8.2 Trang cơ sở dữ liệu SSRs (SSRs PAGE) ................................................. 50 Chƣơng5 ........................................................................................................... 52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................... 52 5.1. Kết luận ...................................................................................................... 52 5.2. Đề nghị ....................................................................................................... 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 54 Phụ Lục ............................................................................................................. 57 x DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT BLAST Basic Local Alignment Search Tool CGI Common Gateway Interface CSDL Cơ sở dữ liệu DBD Database Driver DBI Database Interface DNA deoxyribonucleic acid EST Expressed Sequence Tag HTML Hypertext Markup Language HTTP Hypertext Transfer Protocol NCBI the National Center for Biotechnology Information NIG the National Institute of Genetics NIH the National Institutes of Health NLM the Nation Library of Medicine Perl Practical Extraction and Report Language PHP Hypertext Preprocessior RDBMS Relational Database Management System SNP Single Nucleotide Polymorphism SSCP Single- Strand Conformation Polymorphism SSR Simple Sequence Repeats STS Sequence Tagged Site xi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Sơ đồ tóm tắt quá trình thu nhận trình tự chính từ NCBI .................. 26 Bảng 3.2 : Từ khóa sử dụng để thu nhận trình tự trên NCBI ............................ 26 Bảng 3.3 Nội dung tblStrain ............................................................................. 34 Bảng 3. 4 Nội dung tblMotifLengthGroup ....................................................... 34 Bảng 3.5 Nội dung tblSSR ................................................................................ 34 Bảng 4.1 số lƣợng ESTs của từng loài thu nhận đƣợc từ NCBI ....................... 37 Bảng 4.2 Số trình tự bị lọai bỏ ở bƣớc 2.1 ....................................................... 38 Bảng 4.3 số trình tự bị lọai bỏ ở bƣớc 2.3 ....................................................... 39 Bảng 4.4 số trình tự bị lọai bỏ ở bƣớc 2.4 ....................................................... 39 Bảng 4.5 số lƣợng Contigs thu đƣợc ở mỗi lòai sau khi assembling ................ 41 Bảng 4.6 Tổng số lƣợng SSRs thu nhận đƣợc .................................................. 42 Bảng 4.7 Lƣợng trình tự ESTs và số primer mới đƣợc tạo thành ..................... 43 Bảng 4.8 Tổng số primer thiết kế đƣợc ............................................................. 45 Bảng 4.9 Tổng số Primer còn lại sau khi kiểm tra ............................................ 45 Bảng 4.10 Các trình tự tƣơng đồng với gene kháng virus tristeza.................... 48 Bảng 4.11: Các nhóm Strain id có trong cơ sở dữ liệu ..................................... 50 Bảng 4.12 Các nhóm Motif trong cơ sở dữ liệu ................................................ 51 xii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. CTV dƣới KHV điện tử ..................................................................... 6 Hình 2.2: Nguồn gốc của EST ............................................................................ 8 Hình 2.3 Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân ................................................. 12 Hình 2.4 Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã ............................................. 13 Hình 2.5: Phƣơng pháp phân lập microsatellite truyền thống .......................... 16 Hình 2.6 Tƣơng quan giữa NCBI (National Library of Medicine và NIH) ...... 19 Hình 3.1 : Danh sách các trình tự EST Citrus trên NCBI (nguồn www.NCBI.nlm.nih.gov/genomes/plant/plantlist.html#est) ............................ 27 Hình 3.2 : Các bƣớc thực hiện của Egassembler .............................................. 29 Hình 3.3 phân biệt giữa Contig và Singleton .................................................... 30 Hình 3.4 nội dung tập tin “ssrout20030101.txt” ............................................... 31 Hình 3.5 nội dung tập tin “labdbout20030101.txt” ........................................... 31 Hình 3.6 Nội dung tập tin “new_ids20030101.txt” ......................................... 32 Hình 3.7 Trang web mẫu về trình tự microsatellite(Nguồn: india.org/ssr/ssr.htm) ......................................................................................... 36 Hình 4.1: Sơ đồ so sánh lƣợng ESTs của từng loài .......................................... 37 Hình 4.2: Bảng so sánh dữ liệu ESTs trƣớc và sau khi lọai nhiễu ................... 40 Hình 4.3: Bảng so sánh lƣợng Contigs và ESTs ............................................... 41 Hình 4.4: Biểu đồ so sánh lƣợng SSRs phân lập và lƣợng ESTs ban đầu ... 42-43 Hình 4.5: Biểu đồ so sánh lƣợng noneprimers và ESTs, Primers mới ............ 44 Hình 4.6: Bảng so sánh lƣợng Primers trƣớc và sau khi kiểm tra .................... 46 Hình 4.7: Bảng so sánh tổng trình tự SSRs và Primers thiết kế đƣợc .............. 47 Hình 4.8 : Mối quan hệ giữa các bảng .............................................................. 49 Hình 4.9: Tổng quan về Website ...................................................................... 49 Hình 4.10 Trang cơ sở dữ liệu SSRs (All) ........................................................ 50 Hình 4.11 Trang cơ sở dữ liệu SSRs chọn lọc theo Strain Id “ST01” và “Motif Length Group ID” là 3 ...................................................................................... 51 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Công tác bảo tồn chọn giống ngày càng cần thiết do quá trình thoái hóa diễn ra ngày càng nhanh và phức tạp vì vậy đòi hỏi phải có nhiều công cụ, phƣơng pháp đắc lực hỗ trợ. Hiện nay, SSR đã và đang là 1 trong những công cụ đắc lực phục vụ cho qui trình này  việc phát triển maker SSR rất cần thiết Tình hình bệnh ở cây trồng diễn biến ngày càng phức tạp, nghiêm trọng. Chúng ta phải sử dụng các lọai marker khác nhau để chuẩn đoán, phát hiện bệnh sớm nhằm tìm biện pháp khắc phục.Hiện nay, maker có độ tin cậy cao nhất là Microsatellite. SSR đƣợc phân lập theo phƣơng pháp truyền thống từ thƣ viện cDNA hay thƣ viện Genomic rất tốn kém, do phải sàng lọc từ các mẫu dò một cách mò mẫm. Trong khi đó, phƣơng pháp mới dùng để phân lập SSR từ nguồn dữ liệu ESTs có chi phí thấp và tƣơng đối dễ thực hiện, do trình tự ESTs luôn sẵn có và ta có thể sử dụng miễn phí Lƣợng trình tự EST đƣợc giải mã và công bố ngày càng nhiều, tính đến nay có khỏang 46159508 trình tự EST đƣợc công bố (theo NCBI) Hiện nay các cây thuộc họ chi cam chanh đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều do những giá trị mà nó mang lại nhƣ giá trị thƣơng phẩm, dƣợc phẩm… 1.2.Mục tiêu