Một số kỹ thuật cơ bản trong nuôi cấy tế bào động vật

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********&******** KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT GVHD : TS. Nguyễn Hữu Đức Nhóm III Hà Nội - 3/2011 * NỘI DUNG * I I MỞ ĐẦU II NỘI DUNG 1. 2. CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO 3. ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO 4. GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO 5. XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO 6. CHUẨN BỊ TẾ BÀO CHO VẬN CHUYỂN KẾT LUẬN III CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN I - MỞ ĐẦU Những năm gần đây, công nghệ tế bào động vật đã đạt được những bước tiến mạnh mẽ. Nuôi cấy tế bào động vật là một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ tế bào động vật. Ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật: mô hình thử nghiệm và chuẩn đoán bệnh, sản xuất các hợp chất sinh học, làm vật liệu cấy ghép, tạo cơ quan từ tế bào động vật nuôi cấy… Trong nuôi cấy tế bào động vật in vitro, chìa khóa để thành công là cần phải nắm vững một số các kỹ thuật cơ bản như: cấy chuyển, đông lạnh, giải đông, đếm số lượng tế bào… * II - NỘI DUNG 1. CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN 2. CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO 3. ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO 4. GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO 5. XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO 6. CHUẨN BỊ TẾ BÀO CHO VẬN CHUYỂN * CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN Cấy chuyển tế bào lớp đơn là kỹ thuật chọn lọc và tách các tế bào dạng lớp đơn từ kết quả nuôi cấy sơ cấp, chuyển sang nuôi cấy các loại tế bào khác nhau. Trong dụng cụ nuôi cấy có môi trường dinh dưỡng thích hợp * CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN  Chu kỳ sinh trưởng của tế bào động vật gồm 4 pha: Pha tiềm sinh (lag phase) Pha số mũ ( Log phase) Pha tuyến tính (Stationary phase) Pha suy thoái (Death phase) * CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN Giai đoạn cấy chuyển vào gần cuối pha log * Vật liệu Các bình nuôi cấy tế bào sơ cấp HBSS không có Ca2+ và Mg2+, 37 ° C Dung dịch Trypsin/EDTA, 37° C Môi trường được bổ sung huyết thanh Vd: DMEM với 10% - 15% (V/ V) FBS (Đầy đủ DMEM-10 hay-15), 37° C Pipet, đầu côn vô trùng Khay ấm 37°C hoặc máy ủ Bình nuôi cấy 25cm2 hoặc đĩa petri * CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN Các bước thực hiện Hút bỏ môi trường cũ Rửa và tách các tế bào Chọn các tế bào thích hợp chuyển sang môi trường mới * CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN Hút bỏ môi trường cũ - Loại bỏ tất cả các môi trường từ nuôi cấy sơ cấp với một ống pipet vô trùng. - Nếu các tế bào bám chặt có thể đổ bỏ môi trường. - Nếu nhiều tế bào nổi hay bám yếu, nên lắc nhẹ và rửa. * CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN Rửa và tách các tế bào - Rửa lớp đơn tế bào bám dính một hoặc hai lần với một lượng nhỏ HBSS ở 37°C không có Ca2+ và Mg2+ - Tách các tế bào: Sử dụng trypsin / EDTA ở 37°C * CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN Trypsin là một serine protease tìm thấy trong hệ tiêu hóa của nhiều động vật có xương sống, có vai trò thủy phân các protein. Môi trường hoạt động pH: 6-9 (tối ưu ở pH 8-9) * CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN Rửa và tách các tế bào - Đặt đĩa trên một khay ấm 37°C từ 1-2 phút. - Gõ nhẹ đáy đĩa trên mặt bàn để tách các tế bào. - Kiểm tra quá trình nuôi cấy bằng kính hiển vi hồng ngoại. - Thêm huyết thanh hoặc môi trường có chứa huyết thanh để ức chế trypsin. * Chọn các tế bào thích hợp chuyển sang môi trường mới - Thêm một lượng bằng nhau dung dịch huyền phù tế bào cho các đĩa hoặc bình nuôi cấy đã được dán nhãn thích hợp. - Thêm 4 ml môi trường mới vào, bảo quản trong tủ nuôi cấy điều kiện 370C, CO2 5%. - Cung cấp dinh dưỡng cho các mảng nhỏ nuôi cấy (subconfluent cultures) sau 3 hoặc 4 ngày bằng cách loại bỏ môi trường cũ và thay môi trường mới, 370C. - Chuyển qua lần nuôi cấy tiếp theo khi môi trường nghèo chất dinh dưỡng * CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN NỘI DUNG 1. CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN 2. CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO 3. ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO 4. GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO 5. XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO 6. CHUẨN BỊ TẾ BÀO CHO VẬN CHUYỂN * CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO Nuôi cấy huyền phù tế bào là phương thức nuôi cấy các tế bào trong môi trường lỏng trong bình nuôi có dung tích phù hợp và lắc nhẹ nhàng. Cấy chuyển các dung dịch huyền phù ít phức tap hơn cấy chuyển nuôi cấy lớp đơn do không cần thiết phải tách chúng bằng enzyme trước khi khi cấy chuyển. * CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO VẬT LIỆU Các bình nuôi cấy chứa dung dịch huyền phù tế bào Bình Shaker mà không có vách ngăn hoặc bình spinner Môi trường sinh trưởng hoàn chỉnh,được làm ấm tới 370C Tủ ủ 370C với nồng độ CO2 5% Máy khuấy từ, giá đựng bình Hóa chất và trang thiết bị để xác định kết quả và đếm tổng số tế bào. * CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO CÁC BƯỚC THỰC HIỆN Cung cấp dinh dưỡng cho tế bào 2-3 ngày cho đến khi các tế bào nuôi cấy kết tụ. Lấy nhẹ nhàng dung dịch huyền phù từ buồng ủ, tránh làm phân tán các tế bào đã ổn định ở đáy bình. Loại bỏ khoảng 1/3 môi trường từ bình và thay thế bằng môi trường đã được làm ấm 370C với cùng một lượng thể tích. Nếu các tế bào sinh trưởng nhanh chóng, thêm vào bình 10% môi trường để duy trì mật độ 1 × 106 tế bào /ml. Nhẹ nhàng lắc bình để làm phân tán các tế bào. Đặt bình vào buồng ủ: Vmt <15ml: đặt bình nằm ngang Vmt ≥15ml: đặt bình đứng. * CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH Trong những ngày nuôi cấy không cung cấp dinh dưỡng, kiểm tra tế bào thông qua quá trình làm vẩn đục bình và quan sát sự thay đổi màu sắc trong môi trường để phát hiện sự sinh trưởng phát triển các tế bào là tốt Khi các tế bào nuôi cấy kết tụ (~2.5 × 10 2cell/ml) sẽ cấy chuyển như sau: Lấy bình từ buồng ủ và lắc bình cho tới khi các tế bào tách rời nhau trong môi trường Lấy 1/2 thể tích tế bào huyền phù và chuyển sang một bình mới Cung cấp dinh dưỡng cho mỗi bình 7-10 ml môi trường đã được làm ấm và tiếp tục đưa vào buồng ủ. * NỘI DUNG 1. CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN 2. CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO 3. ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO 4. GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO 5. XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO 6. CHUẨN BỊ TẾ BÀO CHO VẬN CHUYỂN * ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO Đông lạnh tế bào động vật là sử dụng môi trường đông lạnh, nhiệt độ thấp (-800C, -1960C) để lưu giữ các tế bào động vật phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đông lạnh gồm: - Tốc độ đông lạnh - Kỹ thuật đông lạnh - Chất bảo quản lạnh - Môi trường dinh dưỡng - Nhiệt độ bảo quản - Đặc trưng của tế bào đông lạnh…. * ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO Quy trình bảo quản đông lạnh Chuẩn bị Môi trường đông lạnh và các ống đông lạnh chuyên dụng. Môi trường này thường là môi trường dinh dưỡng, bổ sung khoảng 20-90 % huyết thanh và khoảng 5-10 % chất bảo quản lạnh ( DMSO, Glycerol…) Bảo quản Chuyển dịch huyền phù tế bào nuôi cấy đang ở pha log vào ống ly tâm, tiến hành ly tâm ở nhiệt độ 2 - 80C với tốc độ khoảng 1000 v/p trong 5 phút. Trộn tế bào vào môi trường đông lạnh để tạo dạng huyền phù, mật độ thích hợp khoảng 107 tế bào/ml * ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO * Ghi nhãn, dùng giấy nến, bao gói và các ống đông lạnh có huyền phù vào tủ đông lạnh -800C trong một vài giờ, và chuyển vào giữ trong bình chứa Nitơ lỏng NỘI DUNG 1. CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN 2. CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO 3. ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO 4. GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO 5. XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO 6. CHUẨN BỊ TẾ BÀO CHO VẬN CHUYỂN * GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO Mục đích: Khôi phục lại trạng thái hoạt động, đặc điểm, tính chất của tế bào trong nuôi cấy tế bào động vật. Kỹ thuật giải đông có ảnh hưởng đến chất lượng tế bào: - Nếu quá trình giải đông chậm, các tế bào bị tổn thương hoặc bị chết nhiều, ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy. - Nếu giải đông càng nhanh, đúng kỹ thuật, chất lượng tế bào càng tốt. * GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO Lấy ống tế bào đông lạnh từ trong bình Ni tơ lỏng, đặt ngay vào bình ổn nhiệt có lắc ở 37oC. Chuyển dịch huyền phù tế bào trong ống đông lạnh sang ống ly tâm 15ml vô trùng. Bổ sung huyết thanh bê bào thai FBS * Quy trình giải đông tế bào động vật có vú trữ lạnh theo quy trình của Schrieber’s gồm có các bước chủ yếu sau: GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO Ly tâm trong 5 phút với tốc độ 1000 vòng/phút Bổ sung 5 - 6ml môi trường dung dịch đã làm ấm Chuyển sang bình nuôi, ủ ở 37oC trong điều kiện nồng độ CO2 5 %. Sau 24h thì kiểm tra kết quả nuôi cấy, bỏ môi trường cũ và bổ sung 5 - 6ml môi trường mới đã làm ấm và tiếp tục nuôi cấy. * NỘI DUNG 1. CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN 2. CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO 3. ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO 4. GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO 5. XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO 6. CHUẨN BỊ TẾ BÀO CHO VẬN CHUYỂN * XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO Cấu tạo buồng đếm hồng cầu: Buồng đếm hồng cầu là một bản kính dầy với phần trung tâm là buồng đếm, được dùng để định lượng tế bào. * Sử dụng buồng đếm hồng cầu và thuốc nhuộm trypan blue XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO Cấu tạo buồng đếm hồng cầu: * XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO Thuốc nhuộm trypan blue Trypan (C14H16N2) là một thuốc nhuộm sống được sử dụng để xác định sức sống của tế bào, thuộc loại thuốc nhuộm diazo dye * XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO Màng tế bào của những tế bào sống có khả năng thấm chọn lọc, ngăn không cho trypan blue xâm nhâp vào tế bào → không bắt màu. Đối với những tế bào chết hay mô chết, màng tế bào không có khả năng thấm chọn lọc, trypan blue có thể vượt qua màng → bắt màu xanh. * XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO Vật liệu Ethanol 70 % (v/v) Huyền phù tế bào Thuốc nhuộm trypan blue 0.4% (w/v) hoặc nigrosin 0.4% (w/v) được chuẩn bị trong HBSS Buồng đếm hồng cầu có lá kính đậy Máy đếm cầm tay * XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO Các bước thực hiện: Chuẩn bị buồng đếm hồng cầu Chuẩn bị huyền phù tế bào Nạp buồng đếm hồng cầu Đếm tế bào Tính tổng số lượng tế bào Nhuộm tế bào để xác định sức sống của tế bào Tính số lượng tế bào sống * XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO Chuẩn bị buồng đếm hồng cầu: - Làm sạch lá kính đậy và buồng đếm hồng cầu bằng cồn 70 %. - Làm ướt mép của lá kính đậy (lamen) và ấn thành đường rãnh trên buồng đếm hồng cầu * XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO Chuẩn bị huyền phù tế bào - Đối với các tế bào phát triển trong nuôi cấy lớp đơn, tách tế bào từ bề mặt của đĩa bằng cách sử dụng trypsin. - Pha loãng tế bào cần thiết để thu được huyền phù đồng nhất hoặc phân tán một số cụm tế bào * XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO Nạp buồng đếm hồng cầu - Sử dụng một pipet Pasteur vô trùng để chuyển huyền phù tế bào tới cạnh buồng đếm. - Giữ đầu pipet dưới lá kính đậy và nạp đầy huyền phù vào buồng đếm. * XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO Đếm tế bào - Để các tế bào ổn định một vài phút trước khi bắt đầu đếm. - Loại bỏ chất lỏng dư thừa. - Xem tiêu bản trên kính hiển vi với độ phóng đại 100 x - Sử dụng máy đếm cầm tay để đếm tế bào ở bốn góc và ô vuông trung tâm * XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO Tính tổng số lượng tế bào - Xác định số tế bào/ ml sử dụng công thức sau: Tế bào/ml = (số lượng trung bình tế bào ở mỗi ô vuông) . x (hệ số pha loãng) x 104 104 là hệ số điều chỉnh thể tích buồng đếm hồng cầu Tổng số tế bào = (tế bào/ml) x (tổng thể tích ban đầu của . . huyền phù tế bào) * XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO - Thêm 0,5ml thuốc nhuộm trypan blue 0,4%; 0,3ml HBSS; 0,1 ml huyền phù tế bào vào 1ống nhỏ. - Trộn thật kỹ và để yên trước khi nạp buồng đếm hồng cầu. 0,4 % thuốc nhuộm trypan blue hoặc 0,4 % nigrosin có thể được sử dụng để xác định số lượng tế bào có khả năng tồn tại và phát triển độc lập. - Các tế bào chết sẽ bắt màu nhuộm, các tế bào sống sẽ không bắt màu nhuộm. * Nhuộm tế bào để xác định sức sống của tế bào: XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO Tính số lượng tế bào sống - Tính % tế bào có thể tồn tại và phát triển độc lập như sau: Số tế bào sống %Tế bào có khả năng tồn tại = x 100 Tổng số tế bào - Làm sạch lớp kính đậy và buồng đếm hồng cầu bằng cách rửa với ethanol 70% và sau đó rửa với nước đã được khử ion . - Làm khô và lưu trữ để sử dụng lần sau. * NỘI DUNG 1. CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN 2. CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO 3. ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO 4. GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO 5. XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO 6. CHUẨN BỊ TẾ BÀO CHO VẬN CHUYỂN * CHUẨN BỊ TẾ BÀO CHO VẬN CHUYỂN Các bước thực hiện: Loại bỏ môi trường cũ trong bình nuôi, cho môi trường mới. Đậy chặt nắp bình. Đặt các bình nuôi trong các túi nhựa hoặc các thùng đựng hàng chống rò rỉ. Đặt tiếp vào thùng cách nhiệt. Dán nhãn an toàn sinh học. Vận chuyển trong ngày hoặc qua đêm. * CHUẨN BỊ TẾ BÀO CHO VẬN CHUYỂN Vận chuyển đông lạnh Lấy các lọ có chứa tế bào đông lạnh ra khỏi tủ nitơ lỏng. Đặt lên băng khô trong thùng cách nhiệt. * Cấy chuyển các tế bào lớp đơn hay huyền phù tế bào sang môi trường mới nhằm cung cấp chất dinh dưỡng và không gian cho các dòng tế bào phát triển liên tục. Đông lạnh tế bào nuôi cấy ngăn cản sự thay đổi do trôi dạt di truyền và tránh mất mẫu nuôi cấy do lão hóa, hay vô tình làm nhiễm mẫu Giải đông nhằm khôi phục lại trạng thái hoạt động, đặc điểm, tính chất của tế bào trong nuôi cấy tế bào động vật Đếm số lượng tế bào để xây dựng đường cong sinh trưởng, phục vụ cho cấy chuyển tế bào. - Việc thực hiện tốt hay không tốt các kỹ thuật trên quyết định đến sự thành công hay thất bại của quá trình nuôi cấy, muốn thành công đòi hỏi người thực hiện cần phải có những đức tính: cẩn thận, tỉ mỉ, say mê với công việc… III- KẾT LUẬN * TÀI LIỆU THAM KHẢO Cơ sở công nghệ tế bào động vật và ứng dụng (Khuất Hữu Thanh) Công nghệ sinh học trên người và động vật (Phan Kim Ngọc, Phạm Văn phúc ) Basic techniques for Mammalian cell tissue culture - Current Protocols in Cell Biology (1998), Contributed by Mary C. Phelan Hình ảnh, video nguồn internet. * *