Nghiên cứu các kiểu hình tế bào viêm và biểu hiện của gen Foxp3 và Hgrα trong bệnh polyp mũi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN NAM HÀ NGHIÊN CỨU CÁC KIỂU HÌNH TẾ BÀO VIÊM VÀ BIỂU HIỆN CỦA GEN FOXP3 VÀ hGRα TRONG BỆNH POLYP MŨI LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC TP. Hồ Chí Minh – Năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN NAM HÀ NGHIÊN CỨU CÁC KIỂU HÌNH TẾ BÀO VIÊM VÀ BIỂU HIỆN CỦA GEN FOXP3 VÀ hGRα TRONG BỆNH POLYP MŨI Chuyên ngành: Tai - Mũi - Họng Mã số: 62720155 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. NGUYỄN THỊ NGỌC DUNG 2. TS. PHẠM HÙNG VÂN TP. Hồ Chí Minh – Năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Nguyễn Nam Hà MỤC LỤC Trang DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4 1.1. Phân loại theo mô bệnh học thông thường ............................................. 5 1.2. Phân loại theo tế bào viêm ...................................................................... 8 1.3. Tế bào viêm và các vấn đề liên quan tế bào viêm trong polyp mũi ..... 10 1.4. Các gen điều hòa tế bào viêm ............................................................... 20 1.5. Các nghiên cứu của nước ngoài ............................................................ 26 1.6. Các nghiên cứu trong nước ................................................................... 28 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 30 2.1. Thiết kế nghiên cứu............................................................................... 30 2.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu ............................................................ 30 2.3. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 30 2.4. Các biến số nghiên cứu ......................................................................... 31 2.5. Các bước thực hiện ............................................................................... 34 2.6. Xử lý số liệu .......................................................................................... 40 2.7. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu ......................................................... 40 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................... 42 3.1. Đặc điểm tế bào viêm và tế bào Lympho của polyp mũi ..................... 42 3.2. Đặc điểm biểu hiện gen FOXP3 và hGRα của polyp mũi .................... 50 3.3. Sự liên quan giữa phân nhóm bệnh với đặc điểm dịch tễ mẫu khảo sát và độ nặng lâm sàng ........................................................................ 54 3.4. Sự đáp ứng với điều trị steroids của các phân nhóm bệnh ................... 69 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ............................................................................. 88 4.1. Đặc điểm tế bào viêm và tế bào Lympho của polyp mũi ..................... 88 4.2. Đặc điểm biểu hiện gen FOXP3 và hGRα của polyp mũi .................... 96 4.3. Sự liên quan phân nhóm bệnh với đặc điểm dịch tễ mẫu khảo sát và độ nặng lâm sàng .................................................................................. 99 4.4. Sự đáp ứng với điều trị steroids của các phân nhóm bệnh ................. 103 KẾT LUẬN ................................................................................................ 114 KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 116 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1: Bảng câu hỏi thu thập số liệu PHỤ LỤC 2: Quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch PHỤ LỤC 3: Quy trình xét nghiệm biểu hiệu gen PHỤ LỤC 4: Danh sách bệnh nhân nghiên cứu tại bệnh viện Nhân dân Gia Định PHỤ LỤC 5: Danh sách bệnh nhân (mẫu chứng) tại bệnh viện Nhân dân Gia Định PHỤ LỤC 6: Letter of confirmation NUS – List of patients – List of controls PHỤ LỤC 7: Danh sách bệnh nhân xét nghiệm gen hGRα tại công ty Nam Khoa. PHỤ LỤC 8: Danh sách bệnh nhân (mẫu chứng xét nghiệm gen hGRα) tại công ty Nam Khoa DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT BCAT Bạch cầu ái toan BCTT Bạch cầu trung tính BN Bệnh nhân EPOS European Position on Sinusitis and Nasal Polyps FOXP3 Foxhead P3 GC Glucocorticoid HE Hematolysin và Eosin hGRα Human Glucocorticoid Receptor Alpha IHC ImmunoHistoChemical IL Interleukin NCS Nghiên cứu sinh RT-qPCR Reserve Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction SNOT-22 SinoNasal Outcome Test - 22 TH1 T- helper 1 TH2 T- helper 2 T-reg T- regulatory TP.HCM Thành phố Hồ Chí Minh DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Số lượng trung bình của BCAT trong mô polyp ................................ 42 Bảng 3.2. So sánh bắt cặp giá trị trung bình số lượng BCAT theo phân nhóm bệnh ............................................................................................................. 43 Bảng 3.3. Số lượng trung bình của BCTT trong mô polyp ................................ 44 Bảng 3.4 So sánh bắt cặp giá trị trung bình số lượng BCTT theo phân nhóm bệnh ............................................................................................................. 45 Bảng 3.5. Số lượng trung bình của tế bào TH2 trong mô polyp .......................... 47 Bảng 3.6. So sánh bắt cặp giá trị trung bình số lượng tế bào TH2 theo phân nhóm bệnh ................................................................................................... 47 Bảng 3.7. Số lượng trung bình của tế bào TH1 trong mô polyp .......................... 48 Bảng 3.8. So sánh bắt cặp giá trị trung bình số lượng tế bào TH1 theo phân nhóm bệnh ................................................................................................... 48 Bảng 3.9. Số lượng trung bình tế bào T-reg trong mô polyp .............................. 49 Bảng 3.10. So sánh bắt cặp giá trị trung bình số lượng tế bào T-reg theo phân nhóm bệnh .......................................................................................... 50 Bảng 3.11. Chỉ số biểu hiện gen FOXP3 của mô polyp trước khi dùng steroids ........................................................................................................ 51 Bảng 3.12. So sánh bắt cặp giá trị trung bình chỉ số biểu hiện gen FOXP3 theo phân nhóm bệnh .................................................................................. 52 Bảng 3.13. Chỉ số biểu hiện gen hGRα của mô polyp ........................................ 52 Bảng 3.14. So sánh bắt cặp giá trị trung bình chỉ số biểu hiện gen hGRα theo phân nhóm bệnh .......................................................................................... 53 Bảng 3.15. Đặc điểm giới tính của các phân nhóm bệnh.................................... 54 Bảng 3.16. Đặc điểm tuổi của các phân nhóm bệnh ........................................... 54 Bảng 3.17 Đặc điểm tiền căn hen của các phân nhóm bệnh ............................... 55 Bảng 3.18. Đặc điểm tiền căn dị ứng của các phân nhóm bệnh ......................... 55 Bảng 3.19. Đặc điểm tiền căn hút thuốc lá của các phân nhóm bệnh ................. 56 Bảng 3.20. Số lượng polyp khe mũi giữa theo phân nhóm bệnh ........................ 56 Bảng 3.21. Số lượng polyp khe mũi trên theo phân nhóm bệnh ........................ 58 Bảng 3.22. Điểm trung bình SNOT-22 của các phân nhóm bệnh ...................... 60 Bảng 3.23. So sánh bắt cặp giá trị trung bình SNOT-22 theo phân nhóm bệnh ............................................................................................................. 61 Bảng 3.24. Độ thường gặp các triệu chứng SNOT-22 của các phân nhóm bệnh ............................................................................................................. 62 Bảng 3.25. So sánh bắt cặp độ thường gặp của các triệu chứng SNOT-22 theo phân nhóm bệnh .................................................................................. 63 Bảng 3.26. Độ nặng các triệu chứng SNOT-22 của các phân nhóm bệnh ......... 66 Bảng 3.27. So sánh bắt cặp độ nặng các triệu chứng SNOT-22 theo phân nhóm bệnh ................................................................................................... 67 Bảng 3.28. Sự giảm độ polyp mũi trước-sau điều trị steroids theo phân nhóm bệnh ............................................................................................................. 69 Bảng 3.29 Điểm SNOT-22 trước và sau điều trị steroids theo phân nhóm bệnh ............................................................................................................. 72 Bảng 3.30. So sánh bảng điểm SNOT-22 trước-sau điều trị theo phân nhóm ... 73 Bảng 3.31. Số lượng BCAT trước và sau điều trị steroids theo phân nhóm bệnh ............................................................................................................. 74 Bảng 3.32. Số lượng BCTT trước và sau điều trị steroids theo phân nhóm bệnh ............................................................................................................. 76 Bảng 3.33. Số lượng tế bào TH2 trước-sau điều trị steroids theo phân nhóm bệnh ............................................................................................................. 77 Bảng 3.34. Số lượng tế bào TH1 trước-sau điều trị steroids theo phân nhóm bệnh ............................................................................................................. 79 Bảng 3.35. Số lượng trung bình tê bào T-reg trước-sau điều trị steroids theo phân nhóm bệnh .......................................................................................... 80 Bảng 3.36. Chỉ số biểu hiện gen FOXP3 trước-sau điều trị steroids theo phân nhóm bệnh ................................................................................................... 81 Bảng 3.37. Chỉ số biểu hiện gen hGRα trước-sau điều trị steroids theo phân nhóm bệnh ................................................................................................... 84 Bảng 4.1. So sánh số lượng bạch cầu ái toan của chúng tôi với Cao và Ikeda ... 89 Bảng 4.2. So sánh số lượng bạch cầu trung tính của chúng tôi với Ikeda .......... 91 Bảng 4.3. So sánh tỉ lệ phân bố các nhóm bệnh theo số lượng tế bào viêm ....... 92 Bảng 4.4. So sánh tỉ lệ giảm độ polyp mũi sau điều trị steroids ....................... 103 Bảng 4.5. So sánh điểm SNOT-22 trước và sau điều trị steroids ..................... 104 Bảng 4.6. So sánh số lượng bạch cầu ái toan trước- sau điều trị steroids ........ 106 Bảng 4.7. So sánh số lượng bạch cầu trung tính trước- sau điều trị steroids.... 107 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 3.1. Phân bổ các phân nhóm bệnh theo số lượng tế bào viêm .............. 46 Biểu đồ 3.2. Phân bố chỉ số biểu hiện gen FOXP3 theo phân nhóm bệnh ......... 51 Biểu đồ 3.3. Phân bố chỉ số biểu hiện gen hGRα theo phân nhóm bệnh. ........... 53 Biểu đồ 3.4. Phân bố độ của polyp khe mũi giữa theo phân nhóm bệnh............ 57 Biểu đồ 3.5. Đánh giá độ nặng của polyp khe mũi giữa theo phân nhóm bệnh . 57 Biểu đồ 3.6. Phân bố độ của polyp khe mũi trên theo phân nhóm bệnh ............ 59 Biểu đồ 3.7. Đánh giá độ nặng của polyp khe mũi trên theo phân nhóm bệnh .. 59 Biểu đồ 3.8. Phân bố điểm SNOT-22 theo phân nhóm bệnh .............................. 61 Biểu đồ 3.9. Độ thường gặp của các triệu chứng mũi xoang .............................. 64 Biểu đồ 3.10. Độ nặng của các triệu chứng mũi xoang ...................................... 68 Biểu đồ 3.11. Phân bố tỉ lệ giảm độ polyp mũi sau điều trị steroids theo phân nhóm bệnh. .................................................................................................. 70 Biểu đồ 3.12. Điểm SNOT-22 trước-sau điều trị steroids theo phân nhóm bệnh ............................................................................................................. 73 Biểu đồ 3.13. Phân bố số lượng BCAT trước-sau điều trị steroids theo phân nhóm bệnh ................................................................................................... 75 Biểu đồ 3.14. Phân bố số lượng BCTT trước-sau điều trị steroids theo phân nhóm bệnh ................................................................................................... 77 Biểu đồ 3.15. Phân bố số lượng tế bào TH2 trước-sau điều trị steroids theo phân nhóm bệnh .......................................................................................... 78 Biểu đồ 3.16. Phân bố kết quả số lượng tế bào TH1 trước-sau điều trị steroids theo phân nhóm bệnh .................................................................................. 79 Biểu đồ 3.17. Phân bố kết quả số lượng tế bào T-reg trước và sau điều trị steroids theo phân nhóm bệnh ..................................................................... 80 Biểu đồ 3.18. Phân bố kết quả chỉ số biểu hiện gen FOXP3 trước và sau điều trị steroids theo phân nhóm bệnh ................................................................ 82 Biểu đồ 3.19. Phân bố kết quả chỉ số biểu hiện gen FOXP3 trước điều trị giữa bệnh nhân không đáp ứng và đáp ứng với Steroids trong từng phân nhóm bệnh. .................................................................................................. 83 Biểu đồ 3.20. Phân bố kết quả chỉ số biểu hiện gen hGRα trước và sau điều trị steroids theo phân nhóm bệnh ................................................................ 85 Biểu đồ 3.21. Phân bố kết quả chỉ số biểu hiện gen hGRα trước điều trị giữa bệnh nhân không đáp ứng và đáp ứng với Steroids trong từng phân nhóm bệnh. .................................................................................................. 86 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Hình dạng đại thể của polyp ................................................................. 6 Hình 1.2. Hình dạng vi thể của polyp ................................................................... 8 Hình 2.1. Hình ảnh nhuộm HE đếm số lượng BCAT ......................................... 32 Hình 2.2. Hình ảnh nhuộm IHC đếm số lượng BCTT ........................................ 32 Hình 2.3. Đồ thị kết quả phản ứng real-time RT-qPCR đọc chỉ số biểu hiện gen ............................................................................................................... 32 Hình 2.4. Bảng SNOT-22 bằng tiếng Việt .......................................................... 33 Hình 2.5 Nội soi và CT Scan đánh giá độ polyp ................................................ 33 Hình 2.6. Xếp 5 độ polyp mũi theo Hadley, Đại học Florida, Hoa Kỳ .............. 35 Hình 3.1. Sự thấm nhập nhiều BCAT trong mô bệnh. ....................................... 43 Hình 3.2. Sự thấm nhập nhiều BCTT trong mô bệnh. ........................................ 45 Hình 3.3. Sự thấm nhập nhiều tế bào T-reg trong mô bệnh................................ 49 Hình 3.4. Polyp mũi giảm độ đáng kể (giảm 3 độ) sau điều trị steroids ............ 70 Hình 3.5. Polyp mũi giảm độ (giảm 2 độ) sau điều trị steroids .......................... 71 Hình 3.6. Polyp mũi giảm độ (giảm 2 độ) sau điều trị steroids .......................... 71 Hình 3.7. Polyp mũi giảm độ ít (giảm 1 độ) sau điều trị steroids ....................... 71 Hình 3.8. Polyp mũi không giảm độ (dù có nhỏ hơn) sau điều trị steroids ........ 72 Hình 3.9. Polyp mũi không giảm độ (dù có nhỏ hơn) sau điều trị steroids ........ 72 Hình 3.10. Sự thấm nhập BCAT trong mô bệnh giảm đáng kể sau điều trị steroids ........................................................................................................ 74 Hình 3.11. Sự thấm nhập BCTT trong mô bệnh giảm đáng kể sau điều trị steroids ........................................................................................................ 76 1 MỞ ĐẦU Viêm mũi xoang mạn là bệnh phổ biến ảnh hưởng có ý nghĩa đến chất lượng sống của bệnh nhân. Do tần suất bệnh ngày càng gia tăng, viêm xoang mạn trở thành gánh nặng cho kinh tế xã hội. Viêm mũi xoang mạn thường được chia thành 2 loại: có polyp mũi và không có polyp mũi, vì mức độ nặng, sự đáp ứng với điều trị và sự tái phát khác nhau giữa 2 loại này. Ngoài tiền căn hen suyễn và dị ứng, polyp mũi đã được nhận biết là yếu tố tiên lượng xấu cho kết quả phẫu thuật mũi xoang. Tỷ lệ tái phát sau phẫu thuật của bệnh nhân polyp mũi cao hơn bệnh nhân không có polyp mũi[49]. Nhiều nghiên cứu đã ủng hộ ý kiến là loại viêm mũi xoang mạn có polyp mũi đi kèm với mức độ nặng hơn loại không có polyp mũi trên CT-scan, và sự có mặt hay không của polyp mũi là yếu tố quan trọng nhất trong tiên lượng, không liên quan đến độ nặng của triệu chứng lâm sàng hay trên CT-scan. Các kết quả này làm sáng tỏ sự cần thiết phải lưu ý hơn đến polyp mũi trong viêm mũi xoang mạn. Do vậy, ngày càng có nhiều nghiên cứu về polyp mũi[10],[15],[30]. Hiện nay, cũng như các bệnh lý tai mũi họng khác, việc đánh giá phân loại độ nặng polyp mũi được thực hiện nhằm mục tiêu cuối cùng là chọn cách điều trị thích hợp và dự đoán sự tái phát của căn bệnh này. Đã có rất nhiều nghiên cứu trong y văn thế giới theo hướng phân loại độ nặng của bệnh dựa trên triệu chứng cơ năng, nội soi và CT-scan. Hướng nghiên cứu này có thể được xem là nghiên cứu theo “ngành ngang”[10],[30]. Tuy nhiên, nhiều bệnh nhân cùng một mức độ nặng lâm sàng theo các cách phân loại trên nhưng đáp ứng với điều trị rất khác nhau. Hiện tượng này dẫn đến các phân loại theo hướng truy tìm nguyên nhân của viêm mũi xoang ở những bệnh nhân cùng mức độ nặng nhưng đáp ứng điều trị khác nhau này. 2 Hướng nghiên cứu này có thể được xem là nghiên cứu theo “ngành dọc”. Các nghiên cứu loại này có thể theo hướng vi sinh và miễn dịch học, trong đó vai trò dị ứng nguyên của vi nấm, vai trò siêu kháng nguyên của Staphylococcus aureus được nhắc đến nhiều, và vai trò của đơn bào dù ít gặp nhưng cũng đã được báo cáo. Nó có thể theo hướng có hay không có độc chất trong môi trường như các hydrocarbon vòng từ khí thải giao thông, công nghiệp, khói thuốc lá,... Và gần đây, phân loại được nghiên cứu ngày càng nhiều là theo hướng mô bệnh học và sinh học phân tử[15],[30]. Về mô bệnh học, theo các nhà giải phẫu bệnh, polyp mũi có hình ảnh phù nề mô đệm, hình thành các nang chứa dịch, sung huyết, dày hoặc hyaline hóa màng đáy, tăng sản tế bào đài, thấm nhập nhiều loại tế bào viêm. Biểu mô điển hình phủ polyp là biểu mô trụ giả tầng có lông chuyển, nhưng cũng có những vùng chuyển sản biểu mô lát. Sợi thần kinh ít khi được thấy. Polyp lâu ngày có mô đệm hóa sợi. Các hình ảnh vi thể có thể thay đổi chút ít, nhưng sự thấm nhập tế bào viêm thì rất thay đổi trong từng cá thể[8],[42]. Do nhiều bệnh nhân có cùng độ nặng lâm sàng, cùng môi trường sống, nhưng kiểu hình tế bào viêm lại khác nhau. Hiện nay, các tác giả đồng thuận rằng kiểu hình tế bào viêm do tế bào Lympho T-reg điều hòa hoạt động các dòng tế bào Lympho khác thông qua hoạt động của gen FOXP3. Như vậy, biểu hiện của gen FOXP3 cần được nghiên cứu trong mối liên quan với kiểu hình tế bào viêm trong mô polyp mũi[30]. Có một hiện tượng tương tự nữa là nhiều bệnh nhân polyp mũi có cùng độ nặng lâm sàng, cùng môi trường sống, nhưng đáp ứng với điều trị Steroids lại khác nhau. Steroids là một trong các thuốc chủ yếu trong điều trị các bệnh lý viêm. Một số nghiên cứu đã kết luận Steroids hoạt động thông qua thụ thể Glucocorticoids, được điều hòa bởi gen hGRα. Gen hGRα có liên quan đến 3 các cytokines do các t