Nghiên cứu chế biến glucosamin từ vỏ tôm

Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 1 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ …………………………………………………………………………..3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN................................................................... 5 1.1. Nguồn gốc và sự tồn tại chitin - chitosan trong tự nhiên. ................................5 1.2. Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá của chitin...........................................................6 1.2.1. Cấu trúc hoá học của chitin. .....................................................................................6 1.2.2. Tính chất lý hoá của chitin. .......................................................................................8 1.3. Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá sinh và độc tính của chitosan...............8 1.3.1. Cấu trúc hoá học của chitosan. ...............................................................................9 1.3.2. Tính chất lý hoá của chitosan................................................................................10 1.3.3. Tính chất sinh học của chitosan. .........................................................................11 1.3.4. Độc tính của chitosan. ..............................................................................................11 1.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng trong thực tế của chitin và chitosan ở Việt Nam và trên thế giới. ................................................................................12 1.5. Cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa của glucosamin..........................................15 1.6. Cấu trúc hóa học, tính chất vật lý một số muối của glucosamin. ............17 1.6.1. Glucosamin hydroclorua..........................................................................................17 1.6.2. Glucosamin sulfat. .......................................................................................................17 1.6.3. Acetyl glucosamin.........................................................................................................18 1.7. Dược lý và dược động học của glucosamin và muối của nó......................18 1.8. Một số quy trình sản xuất chitin, chitosan trên thế giới và ở tại Việt Nam...........................................................................................................................................................21 1.8.1. Trên thế giới. ....................................................................................................................21 1.8.2. Ở Việt Nam........................................................................................................................23 1.9. Quy trình sản xuất glucosamin hydroclorua (glu.HCl). .................................25 1.9.1. Quy trình sản xuất glu.HCl của Trần Thị Luyến. .....................................25 1.9.2. Quy trình sản xuất glu.HCl của Đỗ Đình Rãng. .......................................26 Chương II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ......................................................................................................................................................................27 2.1. Đối tượng nghiên cứu..........................................................................................................27 2.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................................................27 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 2 CHƯƠNG III : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ......................................29 3.1.Quy trình điều chế chitin, chitosan và glucosamin hydroclorua. ..............29 3.2. Điều chế chitin từ vỏ tôm. ................................................................................................30 3.3.Điều chế chitosan bằng cách deacetyl chitin. ........................................................31 3.4. Điều chế glucosamin hydroclorua (glu.HCl). ......................................................32 3.4.1.Điều chế glu.HCl từ chitin. .....................................................................................32 3.4.2.Điều chế glu.HCl từ chitosan..................................................................................33 3.4.3. Tinh chế glu.HCl. ..........................................................................................................34 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin.........................................................................................................................................................39 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin .........................................................................................................................................................39 3.7. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ axit HCl đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin. ..............................................................................................................................40 CHƯƠNG IV : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..................................................41 4.1. Điều chế chitin từ vỏ tôm. ................................................................................................41 4.1.1.Quá trình khử khoáng..................................................................................................41 4.1.2. Quá trình loại bỏ protein.........................................................................................41 4.1.3. Quá trình tẩy màu (loại bỏ Astaxanthin). ......................................................42 4.2. Điều chế chitosan. ..................................................................................................................43 4.3. Điều chế glucosamin hydroclorua (glu.HCl)........................................................43 4.3.1. Điều chế glu.HCl đi từ chitin. ...............................................................................44 4.3.2. Điều chế glu.HCl từ chitosan. ...............................................................................45 KẾT LUẬN......................................................................................................................................48 TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................49 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 3 ĐẶT VẤN ĐỀ Giáp xác là nguồn nguyên liệu thủy sản dồi dào chiếm 1/3 tổng sản lượng nguyên liệu thủy sản ở Việt Nam. Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu, tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng đông lạnh giáp xác chiếm từ 70 - 80% công suất chế biến. Hàng năm các nhà máy chế biến đã thải bỏ một lượng phế liệu giáp xác khá lớn khoảng 70.000 tấn/năm [3]. Nguồn phế liệu này là nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp sản xuất chitin 1, chitosan 2, glucosamin 3 và các sản phẩm có giá trị khác. Do vậy việc nghiên cứu và phát triển sản xuất các sản phẩm từ vỏ tôm là rất quan trọng, để nâng cao giá trị sử dụng phế liệu này và làm sạch môi trường. Sản phẩm chitin - chitosan đã có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng trong thực tế. Chitin có ứng dụng làm da nhân tạo và là nguyên liệu trung gian cho các chất quan trọng như chitosan, glucosamin và các chất có giá trị khác. Chitosan có nhiều ứng dụng trong các ngành công nghiệp, nông nghiệp, y dược và bảo vệ môi trường như: sản xuất glucosamin, chỉ khâu phẫu thuật, thuốc kem, vải, sơn, chất bảo vệ hoa quả, bảo vệ môi trường…Với khả năng ứng dụng rộng rãi của chitin – chitosan mà nhiều nước trên thế giới và cả Việt Nam đã nghiên cứu sản xuất các sản phẩm này. Glucosamin là một hoạt chất quý được sản xuất từ vỏ tôm thông qua nguyên liệu trung gian là chitin hoặc chitosan. Glucosamin chủ yếu được sử dụng trong y học chữa bệnh thoái hoá khớp. Ở người già, chức năng cũng như cấu tạo của khớp có nhiều thay đổi, các tế bào của khớp thoái hoá, trở nên kém linh động. Gân và dây chằng phân đoạn, đóng vôi, khô cằn, trở nên kém bền bỉ, kém co dãn, không chịu được căng lực và dễ bị tổn thương. Sụn trở nên đục màu, xơ hóa, gai xương, khô nước, rạn nứt với nhiều tinh thể canxi làm khớp đau. Khớp co duỗi khó khăn vì màng hoạt dịch mỏng và khô dần [1]. Trước đây, trong điều trị các bệnh thoái hóa khớp người ta thường dùng các thuốc thuộc nhóm corticoid hoặc nhóm kháng viêm giảm đau không steroid NSAID (Non - Steroidal Anti - Inflammatory Drugs), nhưng các thuốc thuộc Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 4 nhóm này chỉ điều trị triệu chứng và có nhiều tác dụng phụ. Với các thuốc thuộc nhóm corticoid thường gây nên các tác dụng phụ: loãng xương, viêm loét dạ dày, giảm miễn dịch…. Đối với các NSAID thì gây viêm loét dạ dày…[12]. Từ thập kỷ 90 người ta đã phát hiện ra glucosamin phục hồi được các sụn khớp, tức là chữa được căn nguyên của bệnh viêm, thoái hoá khớp [2]. Đã có nhiều công trình nghiên cứu với nhiều thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh tác dụng điều trị tận gốc bệnh thoái hoá khớp của glucosamin, nhất là dạng phối hợp với dược liệu thiên nhiên. Trên thực tế glucosamin thường được sử dụng ở các dạng: glucosamin hydroclorua 4, glucosamin sulfat 5, N - Acetyl glucosamin 6. Hiện nay thuốc chứa glucosamin đã được lưu hành trên 70 quốc gia. Tại Việt Nam, glucosamin và các thành phẩm đi từ glucosamin vẫn chủ yếu là nhập khẩu và xu thế sử dụng ngày càng nhiều. Trong khi đó nguồn nguyên liệu (vỏ giáp xác) chủ yếu để điều chế ra glucosamin thì dồi dào. Để tận dụng nguồn nguyên liệu phế thải, tạo nguồn nguyên liệu cho việc sản xuất thuốc chữa bệnh thoái hoá khớp và là nguyên liệu cho việc nghiên cứu các ứng dụng khác của glucosamin chúng tôi đặt vấn đề tiến hành đề tài “Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm”. Mục tiêu của đề tài nhằm giải quyết các vấn đề sau : 1. Phân lập chitin – chitosan từ vỏ tôm phế thải. 2. Điều chế glucosamin hydroclorua từ chitin và chitosan.. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 5 Chương I: TỔNG QUAN 1.1. Nguồn gốc và sự tồn tại chitin - chitosan trong tự nhiên Chitin - chitosan là một polysacharit tồn tại trong tự nhiên với sản lượng rất lớn (đứng thứ hai sau xellulose). Trong tự nhiên chitin tồn tại trong cả động vật và thực vật . Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ một số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Trong động vật bậc cao monome của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô da nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da. Trong thực vật chitin có ở thành tế bào nấm họ zygenmyctes, các sinh khối nấm mốc, một số loại tảo... [13]. Chitin - chitosan là polysacharit có đạm không độc, có khối lượng phân tử lớn. Cấu trúc của chitin là tập hợp các monosacharit (N-acetyl-β-D-glucosamine) liên kết với nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi có tổ chức. Hơn nữa chitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái tự do và hầu như luôn luôn nối bởi các cầu nối đẳng trị (coralente) với các protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác. Hình 1 : Chitin và vỏ tôm Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 6 Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin - chitosan chiếm khá cao đao động từ 14 - 35% so với trọng lượng khô [5]. Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin - chitosan. Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1821, trong cặn dịch chiết từ một loại nấm. Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc của nó. Năm 1823 Odier phân lập được một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong đó. Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống với xellulose. O NHCOCH3 OH CH2OH O O O NHCOCH3 OH CH2OH O O NH2 OH CH2OH O O O NH2 OH CH2OH O O OH OH CH2OH O O O OH OH CH2OH O 2) 3) 1) H×nh 2 :1) Chitin; 2) Chitosan; 3) Xellulose 1.2. Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá của chitin 1.2.1. Cấu trúc hoá học của chitin Chitin 1 có cấu trúc tinh thể rất chặt chẽ và đều đặn. Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X. Người ta đã chứng minh được chitin tồn tại ở ba dạng cấu hình :α, β, γ - chitin [15]. Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi mắt xích (N-acetyl-D-glucosamin) trong mạch. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 7 Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu của mũi tên chỉ nhóm –CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH3, thì các cấu trúc α, β, γ- chitin được mô tả như sau: α - chitin có cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn, nên ngoài liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro giữa các lớp do các chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững. Do các mắt xích sắp xếp đảo chiều, xen kẽ thuận lợi về mặt không gian và năng lượng. Đây cũng là dạng phổ biến trong tự nhiên. β, γ - chitin do mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β - chitin) và hai song song một ngược chiều (γ - chitin), giữa các lớp không có loại liên kết hydro. Dạng β - chitin cũng có thể chuyển sang dạng α - chitin nhờ quá trình axetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn. Qua nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzym hay axit HCl đậm đặc thì người ta thấy rằng chitin có cấu trúc là một polyme được tạo thành từ các đơn vị N-Acetyl-β-D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β-(1-4) glucozit. Công thức cấu tạo của chitin: O O HO NHCCH3 O OH OH NHCH2CH3 HO O O HO NHCH2CH3 O OH O O O 1 Tên gọi : Poly(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucose; Poly(1-4)-2- acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranose. α - Chitin β - Chitin γ - Chitin Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 8 Công thức phân tử: [C8H13O5N]n Phân tử lượng : Mchitin = (203,09)n 1.2.2. Tính chất lý hoá của chitin [3] Chitin có màu trắng hay màu trắng phớt hồng, dạng vảy hoặc dạng bột, không mùi, không vị, không tan trong nước, trong môi trường kiềm, axit loãng và các dung môi hữu cơ như ete, rượu …Nhưng tan trong dung dịch đặc nóng của muối thioxianat liti (LiSCN) và thioxianat canxi (Ca(SCN)2) tạo thành dung dịch keo, tan được trong hệ dimetylacetamid - LiCl 8% [4], tan trong hexafluoro- isopropyl alcohol (CF3CHOHCF3) và hexafluoracetone sesquihydrate (CF3COCF3.H2O) [16]. Chitin có khả năng hấp thu tia hồng ngoại có bước sóng 884 - 890cm-1. Chitin ổn định với các chất oxy hoá mạnh như thuốc tím (KMnO4); oxy già (H2O2); nước javen (NaOCl - NaCl)…, lợi dụng tính chất này mà người ta sử dụng các chất oxy hoá trên để khử màu cho chitin. Khi đun nóng trong dung dịch NaOH đậm đặc (40 - 50%), ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan: Chitn CH2OH OH NHCOCH3 Chitosan CH2OH OH NH2 NaOH 40-50% T0cao Khi đun nóng trong axit HCl đậm đặc, ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị cắt mạch thu được glucosamin: CH2OH OH NHCOCH3 CH2OH OH NH2 Glucosamin HCl 36%Chitn T0cao Phản ứng este hóa : - Chitin tác dụng với HNO3 đậm đặc cho sản phẩm chitin nitrat. - Chitin tác dụng với anhydrit sunfuric trong pyridin, dioxan và N,N-dimetylanilin cho sản phẩm chitin sunfonat. 1.3. Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá sinh và độc tính của chitosan Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 9 1.3.1. Cấu trúc hoá học của chitosan [3] Trong số các dẫn xuất của chitin thì chitosan 2 là một trong những dẫn xuất quan trọng vì nó có hoạt tính sinh học cao và có nhiều ứng dụng trong thực tế. Việc sản xuất chitosan tương đối đơn giản, không cần dung môi, hóa chất độc hại, đắt tiền. Chitosan thu được bằng phản ứng deacetyl hóa chitin, biến đổi nhóm N-acetyl thành nhóm amin ở vị trí C2. Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên người ta qui ước nếu độ deacetyl hóa (degree of deacetylation) DD > 50% thì gọi là chitosan, nếu DD < 50% gọi là chitin [13]. Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị 2-amino-2-deoxy-β-D- glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-(1-4) glucozit. Công thức cấu tạo của chitosan: O O HO NH2 O OH OH NH2 HO O O HO NH2 O OH 2 Tên gọi khoa học: Poly(1-4)-2-amino-2-deoxy-β-D-glucose; poly(1-4)-2- amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose. Công thức phân tử: [C6H11O4N]n Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n Qua cấu trúc của chitin - chitosan ta thấy chitin chỉ có một nhóm chức hoạt động là -OH (H ở nhóm hydroxyl bậc 1 linh động hơn H ở nhóm hydroxyl bậc 2 trong vòng 6 cạnh) còn chitosan có 2 nhóm chức hoạt động là -OH, -NH2, do đó chitosan dễ dàng tham gia phản ứng hóa học hơn chitin. Trong thực tế các mạch chitin - chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản phẩm đồng thời, việc tách và phân tích chúng rất phức tạp. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 10 1.3.2. Tính chất lý hoá của chitosan [3] Chitosan có màu trắng ngà hoặc màu vàng nhạt, tồn tại dạng bột hoặc dạng vảy, không mùi, không vị, nhiệt độ nóng chảy 309 - 3110C. Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, trong kiềm nhưng hoà tan được trong dung dịch axit hữu cơ loãng như: axit acetic, axit fomic, axit lactic…, tạo thành dung dịch keo nhớt trong suốt. Chitosan hoà tan trong dung dịch axit acetic 1 - 1.5%. Độ nhớt của chitosan trong dung dịch axit loãng liên quan đến kích thước và khối lượng phân tử trung bình của chitosan (đây cũng là tính chất chung của tất cả các dung dịch polyme) [6]. Chitosan kết hợp với aldehit trong điều kiện thích hợp để hình thành gel, đây là cơ sở để bẫy tế bào, enzym. Chitosan phản ứng với axit đậm đặc, tạo muối khó tan. Chitosan tác dụng với iod trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím. Một số dẫn xuất chitosan [26]: OO HO HN O OH OO HO NH O OH OO HO NH3+ O OH OO HO NH3+ O OCH2CH2SO3- OO HO NHCH2COOH O OCH2COOH OO HO NHAc O OCH2CH2CN OO HO NHAc O OCS2-Na+ OO HO N=CHR O OH OO HO NHR O OH OO HO NHCH2COOH O OH OO HO NHAc O OCH2CHOHR OO HO NH2 O OH OO -O NHAc O O-Na+ OO RH2CO NHAc O OCH2R OO HO NHAc O OCH2COOH OO HO NHAc O OH Na+ Chitosan Chitin Crosslinked Chitosan Chitosan salts Sulfoethylchitosan N,O-carboxymethylchitosan Cyanoethylchitin Chitin xanthogenate Alkalichitin Alkylchitin Carboxmethylchitin Hydroxyalkylchitin N-carboxymethylchitosan N-alkylchitosan Schiff base Hình 3 : Sơ đồ các dẫn xuất đi từ chitin, chitosan. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 11 1.3.3. Tính chất sinh học của chitosan [5] Chitosan không độc, dùng an toàn cho người [18]. Chúng có tính hoà hợp sinh học cao với cơ thể [19], có khả năng tự phân huỷ sinh học [20]. Chitosan có nhiều tác dụng sinh học đa dạng như: tính kháng nấm, tính kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, tác dụng cầm máu, chống sưng u [21]. Ngoài ra, chitosan còn có tác dụng làm giảm cholesterol và lipid máu, hạ huyết áp [22], điều trị thận mãn tính, chống rối loạn nội tiết [23]. Với khả năng thúc đẩy hoạt động của cá