Nghiên cứu đa dạng của họ bọ cánh cứng ăn lá và mối quan hệ của chúng với thực vật của vườn quốc gia núi Chúa tỉnh Ninh thuận bằng phương pháp sinh học phân tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Thị Định NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG CỦA HỌ BỌ CÁNH CỨNG ĂN LÁ (CHRYSOMELIDAE) VÀ MỐI QUAN HỆ CỦA CHÚNG VỚI THỰC VẬT TRONG ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG CỦA VƯỜN QUỐC GIA NÚI CHÚA, TỈNH NINH THUẬN, VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ Chuyên ngành: Sinh thái học Mã số: 9 42 01 20 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2018 Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học 1: PGS. TS. Nguyễn Văn Sinh Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Jesús Gómez-Zurita Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: . Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Haọc viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi giờ ..’, ngày tháng năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Các quần xã sinh vật không phải là các đơn vị độc lập, mà là những mảnh ghép của bức tranh môi trường tự nhiên, và có sự phụ thuộc lẫn nhau. Trong đó, quần xã thực vật có liên quan chặt chẽ đến tính chất vật lý của môi trường như nhiệt độ, độ ẩm, bức xạ mặt trờiCác nhân tố vật lý này thay đổi theo độ cao, sẽ kéo theo sự thay đổi trong cấu trúc của quần xã thực vật. Về phần mình, thực vật là thức ăn của nhiều loại côn trùng, có vai trò quyết định trong sự đa dạng cũng như sự phân bố của chúng. Nghiên cứu về phản ứng của côn trùng ăn thực vật với sự thay đổi của quần xã thực vật theo độ cao sẽ giúp chúng ta hiểu biết rõ hơn về mối quan hệ phụ thuộc lẫn nhau trong hệ sinh thái. Bọ cánh cứng ăn lá (Chrysomelidae) là một họ lớn nhất trong bộ cánh cứng (Coleoptera). Thức ăn của Chrysomelidae là thực vật, vì vậy chúng có liên kết chặt chẽ với thực vật trong toàn bộ đời sống và việc thu bắt mẫu của chúng tương đối đơn giản. Do đó, Chrysomelidae là nhóm côn trùng phù hợp làm đối tượng cho việc nghiên cứu sự phụ thuộc của các quần xã sinh vật trong hệ sinh thái. Vườn Quốc Gia (VQG) Núi Chúa bao gồm diện tích rừng bán khô hạn độc đáo nhất Việt Nam và quần xã thực vật ở đây có sự thay đổi rõ rệt theo độ cao từ rừng khô trên đất thấp, qua rừng chuyển tiếp (rừng bán ẩm) tới rừng ẩm thường xanh trên núi cao. Vì vậy, VQG Núi Chúa là địa điểm lý tưởng để thực hiện nghiên cứu của luận án. Vì tất cả các lý do trên tôi chọn đề tài “Nghiên cứu đa dạng của họ bọ cánh cứng ăn lá (Chrysomelidae) và mối quan hệ của chúng với thực vật trong điều kiện môi trường của vườn quốc gia Núi Chúa, tỉnh Ninh Thuận, Việt Nam bằng phương pháp sinh học phân tử” 2 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án Đánh giá sự đa dạng loài và sự biến động theo không gian của họ Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa. Xác định thức ăn của các loài họ Chrysomelidae và đánh giá sự thay đổi thức ăn của chúng theo không gian. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án Sử dụng bộ ba mã vạch ADN để đánh giá sự đa dạng loài của họ Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa. Sử dụng bộ ba mã vạch ADN để xác định thức ăn của các loài họ Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa. Xác định sự biến đổi thành phần của họ Chrysomelidae và thức ăn của chúng theo không gian ở VQG Núi Chúa. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Các vấn đề liên quan đến luận án 1.1.1. Sử dụng công cụ sinh học phân tử để đánh giá đa dạng sinh học 1.1.1.1. Đa dạng sinh học và những vấn đề liên quan Định nghĩa đa dạng sinh học: Theo Luật Đa dạng sinh học (2008) thì “Đa dạng sinh học là sự phong phú về gen, loài sinh vật và hệ sinh thái trong tự nhiên”. Trong ba cấp độ đa dạng thì đa dạng loài được sử dụng nhiều trong nghiên cứu về sinh học, bảo tồn và sinh thái học. Mora et al. (2011) dự đoán có khoảng 8,7 triệu (± 1,3 triệu) loài có nhân trên toàn cầu; trong đó có khoảng 2,2 triệu (± 0,18 triệu) là sống dưới biển. Họ cho rằng khoảng 86% các loài đang tồn tại trên trái đất và 91% các loài trong đại dương vẫn đang chờ đợi mô tả. Đến nay, tổng số loài mô tả được chấp nhận trên thế giới được ước tính là gần 1.900.000 loài và có khoảng 18.000 loài mới được miêu tả mỗi năm 3 (Chapman 2009). Trong đó rừng nhiệt đới hỗ trợ 50% đa dạng sinh học trên trái đất (Myers 1988, Mittermeier et al. 1998) và 80% các loài côn trùng đã biết (WWF), 1998) mặc dù chỉ bao phủ <10% diện tích đại lục trái đất (Achard et al. 2002). Đánh giá đa dạng sinh học: Các nhà sinh vật học thường đánh giá đa dạng sinh học thông qua đánh giá độ giàu loài. Có hai phương pháp chính để đánh giá độ giàu loài đó là phương pháp định tính (số loài) và phương pháp định lượng (số cá thể hoặc sinh khối từng loài). Lý tưởng nhất, để đánh giá đa dạng sinh học là đo lường sự phong phú của tất cả các sinh vật theo không gian và thời gian, sử dụng phân loại (số lượng các loài), đặc điểm chức năng và sự tương tác giữa các loài có ảnh hưởng đến động lực và chức năng của chúng. Thậm chí quan trọng hơn sẽ là đánh giá sự dịch chuyển của đa dạng sinh học trong không gian hoặc thời gian. Hiện nay, chúng ta không thể làm được điều này với độ chính xác cao bởi vì các số liệu còn thiếu. Khủng hoảng đa dạng sinh học: là sự mất đi của gen, các loài và các hệ sinh thái. Vos et al. (2015) ước tính rằng sự mất đi trong tự nhiên có thể gần với tỷ lệ 0,1 loài trên một triệu loài trên một năm và do đó tỷ lệ tuyệt chủng hiện nay là cao hơn 1.000 lần so với tỷ lệ tự nhiên và trong tương lai có thể sẽ cao hơn 10.000 lần. Levin (2002) cho thấy rằng trung bình cứ 20 phút có một loài trên trái đất bị mất đi. Trở ngại phân loại trong nghiên cứu đa dạng sinh học: Việc thiếu tên khoa học và những khó khăn trong việc xác định loài trong nghiên cứu sinh thái là "trở ngại phân loại" (New, 1984). Điều này đang có ảnh hưởng rất lớn cho khoa học bảo tồn. Nhiều loài sẽ bị tuyệt chủng trước khi chúng được mô tả và chúng ta vẫn tiếp tục không biết chính xác có bao nhiêu loài trên hành tinh của chúng ta. Các "trở ngại phân 4 loại" đã dẫn tới sự hiểu biết không đầy đủ về phần lớn đa dạng sinh học toàn cầu. 1.1.1.2. Sử dụng công cụ sinh học phân tử để tăng tốc độ đánh giá đa dạng sinh học Sử dụng công cụ sinh học phân tử để đánh giá đa dạng loài: Mã vạch ADN dựa trên gen ty thể (thường xuyên nhất là gen COI) đã nổi lên như một công cụ hữu ích để xác định các loài động vật. Mã vạch ADN được sử dụng như một công cụ hiệu quả cho cả việc xác định các loài đã biết và phát hiện ra những loài mới (Hebert et al. 2003, 2010, Savolainen et al. 2005). Mã vạch ADN có thể cung cấp thêm cơ sở dữ liệu giúp phân loại loài được chính xác hơn (Thompson et al. 2012). Thứ hai, mã vạch ADN có thể giúp xác định loài trong những trường hợp việc định loại chỉ được thực hiện tới mức chi hoặc họ. Thứ ba, dữ liệu di truyền thu thập cho mã vạch ADN thường bao gồm các biến đổi trong một loài, chúng cho phép phân tích theo hướng mức độ thấp của quần thể bao gồm cả việc phát hiện các cấu trúc di truyền, và trong một số trường hợp là theo dõi biến động quần thể (Nagy et al. 2013). Mã vạch ADN trên nhiễm sắc thể hiện nay thường được sử dụng nhiều nhất cho thực vật. Hai vùng ADN được định nghĩa là 'mã vạch lõi' gồm rbcLa và matK đã được chuẩn hóa như mã vạch ADN cho thực vật trên cạn (CBOL Plant Working Group 2009). Ngoài các mã vạch lõi, hai khu vực khác, trnH-psbA và nrITS đã được đề xuất như mã vạch ADN bổ sung cho thực vật (Hollingsworth et al. 2011, Li et al. 2011). Sử dụng công cụ sinh học phân tử trong nghiên cứu tương tác sinh thái: Phương pháp này tách chiết ADN từ mô của thực vật bị tiêu hóa 5 bởi côn trùng ăn thực vật. Một phần của ADN lục lạp (chloroplast) đã được khuếch đại, và các trình tự gen thực vật đã được xác định qua so sánh với cơ sở dữ liệu tham khảo hiện tại như GenBank hoặc thư viện mã vạch ADN của các nhóm thực vật đích. Kỹ thuật dựa trên ADN này cho phép chúng ta xác định thực vật chủ của côn trùng ăn thực vật mà không quan sát trực tiếp. Hơn nữa, bởi vì kỹ thuật này nhắm vào ít mục tiêu, nó làm giảm khả năng bỏ qua mối quan hệ dinh dưỡng của động vật ăn thực vật. 1.1.2. Sự không đồng nhất của môi trường và ảnh hưởng của nó đến đa dạng sinh học Haller et al. (2013) cho rằng, có hai loại mô hình không gian trên hành tinh của chúng ta: mô hình siêu quần thể, trong đó các cá thể sinh sống ở hai hoặc nhiều mảnh rời rạc khác nhau và mô hình không gian liên tục của dải biến đổi môi trường. Theo tác giả, sự không đồng nhất về môi trường xuất phát từ hai yếu tố: đầu tiên là sự thay đổi của môi trường, tiếp đến là sự phân mảnh liên tục trong không gian, được mô tả bởi biên độ và quy mô không gian của nó. Cùng với nhau, các thành phần này tạo lên một loạt các cảnh quan với mô hình không đồng nhất. Họ kết luận rằng tính không đồng nhất không gian, bằng cách tạo ra các chế độ lựa chọn khác nhau đã thúc đẩy sự đa dạng, là một động lực quan trọng của sự hình thành loài . 1.1.3. Chrysomelidae là đối tượng thích hợp để áp dụng công cụ sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng sinh học và nghiên cứu sự phụ thuộc lẫn nhau trong hệ sinh thái. Bọ cánh cứng ăn thực vật nói chung và bọ cánh cứng ăn lá nói riêng (Chrysomelidae), chúng đại diện cho một số lượng loài lớn, dễ thấy và rất đa dạng của hoạt động ăn thực vật trong hệ sinh thái nhiệt 6 đới và ôn đới. Thêm vào đó, chúng cho thấy một sự đa dạng đáng chú ý của việc ăn thực vật (từ lá đến gốc), cũng như mức độ chuyên môn khác nhau, từ loài ăn một loại thức ăn đến loài ăn nhiều loại thức ăn khác nhau, và khả năng phát tán, chúng có mối quan hệ sinh thái chặt chẽ với thực vật ở tất cả các giai đoạn của chu kỳ sống và có tỷ lệ đặc hữu cao, cả hai yếu tố đó cho thấy chúng có mối quan hệ chặt chẽ với môi trường. Do vậy chúng là đối tượng thích hợp trong nghiên cứu các phương diện của đa dạng sinh học: nghiên cứu đa dạng loài và tương tác sinh thái (Price 2002). 1.1.3.1. Tình hình nghiên cứu Chrysomelidae ở Việt Nam Côn trùng cánh cứng ăn lá (Chrysomelidae) đã được tập trung nghiên cứu nhiều mặt: khu hệ, sinh học, sinh thái, phân bố, ý nghĩa kinh tếtừ năm 1975 đến 2008. Đặc biệt khu vực phía Bắc Việt Nam (Tam Đảo, Hòa Bình, Hà Nam, Ninh Bình..), khu vực ba tỉnh miền trung (Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế) và một số tỉnh Tây Nguyên (Đặng Thị Đáp và Medvedev, 1982- 1989 và Đặng Thị Đáp và cs 2005-2008). Phân loại học của Chrysomelidae ở Việt Nam được nhiều tác giả nước ngoài quan tâm nghiên cứu và công bố như Medvedev (1983- 2015), Kimoto (1997, 1998, 2000). Theo ghi nhận của các tác giả này, có khoảng 700 loài Chrysomelidae ở Việt Nam đã được mô tả và công bố trên các tạp chí khoa học, ước tính số loài Chrysomelidae ở Việt Nam có thể vượt 1.000 loài. Điều này cho thấy sự đa dạng rất cao của quần xã Chrysomelidae ở Việt Nam và nhiều loài đang chờ phát hiện và mô tả mới cho khoa học. Tuy nhiên những ghi nhận về thực vật chủ của các loài Chrysomelidae ở Việt Nam còn rất hạn chế. Đặng Thị Đáp (1983) đã có kết quả ban đầu về ảnh hưởng của cảnh quan tới sự phân bố của phân họ Cassidinae, tuy 7 nhiên chưa có nghiên cứu về ảnh hưởng của dải biến đổi môi trường tới quần xã Chrysomelidae. Năm 2005, Tạ Huy Thịnh và cộng sự đã có nghiên cứu bước đầu về côn trùng ở VQG Núi Chúa, tuy nhiên chưa có nghiên cứu riêng về quần xã Chrysomelidae ở khu vực này. 1.1.3.2. Tình hình nghiên cứu Chrysomelidae trên thế giới Chúng được nghiên cứu khá đầy đủ về thực vật chủ (Jolivet và Hawkeswood 1995), về sinh học: nhận dạng, phát sinh loài, di truyền, sinh thái .(Jolivet, và Cox , 1996). Các nhà khoa học ngày nay đã sử dụng sinh học phân tử để nghiên cứu sâu hơn về phát sinh loài của Chrysomelidae (Montelongo và Gómez-Zurita, 2014; ) cũng như đánh giá đa dạng của Chrysomelidae (Thormann et al., 2016) và tìm kiếm thực vật chủ của chúng (De la Cadena et al. 2016; Kishimoto-Yamada et al. 2013; Jurado-Rivera et al.2009). Có nhiều nghiên cứu về sự dịch chuyển loài theo dải độ cao, hầu hết các nghiên cứu được thực hiện trong khu vực Nam và Trung Mỹ. Các nghiên cứu này tập trung vào nhóm chân khớp giàu loài, cụ thể côn trùng (24,5%), hầu hết cánh cứng và bướm, chỉ có một vài nghiên cứu về Chrysomelidae theo dải độ cao. Hầu hết các nghiên cứu đều cho kết quả rằng đa dạng loài thay đổi với độ cao. 1.2. Khái quát về điều kiện tự nhiên – kinh tế xã hội của khu vực nghiên cứu 1.2.1. Vị trí địa lý VQG Núi Chúa thuộc huyện Ninh Hải, tỉnh Ninh Thuận, giáp với tỉnh Khánh Hòa. Có toạ độ từ 11°35'25" đến 11°48'38" vĩ bắc và 109°4'5" đến 109°14'15" kinh đông, diện tích: 29.865 ha trong đó phần đất liền là 22.513 ha và phần biển là 7.352 ha, vùng đệm có diện tích 7.350 ha 8 1.2.2. Địa hình Khu vực Núi Chúa là một khối núi khá liền nhau, nhìn từ ảnh vệ tinh thì Núi Chúa có hình dạng như một con rùa có đầu quay về phía Nam, đuôi là phần nhô ra mũi Xốp. Khối núi này có nhiều đỉnh ở các độ cao khác nhau, mà đỉnh cao nhất là đỉnh núi Cô Tuy có độ cao 1.039 m. 1.2.3. Khí hậu, thủy văn Khu vực VQG Núi Chúa nằm lọt hoàn toàn trong khu vực khí hậu ven biển miền trung thuộc vùng khí hậu Nam Trung Bộ với đặc điểm là khô hạn, đặc điểm này liên quan đến vị trí bị che khuất của vùng này bởi các núi vòng cung bao bọc phía Bắc, Tây và Nam với hai luồng gió mùa chính. Mùa mưa ở khu vực này đến muộn so với các vùng khác và kết thúc cũng sớm hơn, bắt đầu khoảng tháng 9 - 10 và kết thúc khoảng tháng 12. 1.2.4. Đặc điểm sinh thái thảm thực vật Khu vực VQG Núi Chúa có kiểu hệ sinh thái bán khô hạn được biết đến như là kiểu hệ sinh thái tiêu biểu cho khu vực nhưng ngoài ra còn có kiểu hệ sinh thái khác làm cho khu vực khác với các vùng khác, đó là hệ sinh thái rừng thường xanh với hệ thực vật và thành phần loài khác với hệ thực vật của hệ sinh thái bán khô hạn. 1.2.5. Hệ động, thực vật Điều tra đã ghi nhận được 1.504 loài thực vật bậc cao có mạch trên cạn nằm trong 85 bộ, 147 họ và 596 chi thuộc 7 ngành thực vật khác nhau. Đã ghi nhận 330 loài động vật có xương sống trên cạn với 84 loài thú, 163 loài chim và 83 loài bò sát – lưỡng cư, trong số đó có 46 loài là loài nguy cấp quý hiếm có tên trong Sách đỏ Việt Nam, . Trong đợt điều tra khảo sát 6/2004, từ 3 tuyến điều tra đã thu thập 9 được 10 bộ, 95 họ Côn trùng gồm 361 loài và dạng loài. Số loài đã định tên khoa học chiếm 53,7% trong số đó (Tạ Huy Thịnh et al., 2005). Như vậy, VQG Núi Chúa bao gồm diện tích rừng bán khô hạn độc đáo nhất Việt Nam và quần xã thực vật ở đây có sự thay đổi rõ rệt theo độ cao từ rừng khô trên đất thấp, qua rừng chuyển tiếp (rừng bán ẩm) tới rừng ẩm thường xanh trên núi cao. Vì vậy, VQG Núi Chúa là địa điểm lý tưởng để thực hiện nghiên cứu của luận án . Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Phương pháp thu mẫu và phân chia sinh cảnh ở VQG Núi Chúa 2.1.1. Thiết kế và thu thập mẫu vật Chúng tôi thu mẫu 10 lần trong năm 2012 và 2013 ở Vườn Quốc Gia Núi Chúa, tỉnh Ninh Thuận cố định dọc theo năm con đường rừng (Mái Nhà, Đá Đỏ, Ao Hồ, Núi Ông và Suối Trục), mỗi con đường rừng, thu mẫu bắt đầu từ độ cao ở mức nước biển (tương ứng với vùng sinh thái khô) theo độ cao tăng dần lên đến 449m (tương ứng với vùng sinh thái chuyển tiếp và một phần của vùng sinh thái ẩm) và con đường Đá Hang cách vịnh Vĩnh Hy 8-10 km về phía tây nam chỉ được thu mẫu một lần trong đợt khảo sát đầu tiên (5/2012) (Hình 2.2) Các mẫu vật họ Chrysomelidae được thu thập quanh những điểm cố định dọc theo các tuyến đường rừng trong mỗi lần thu mẫu, tại mỗi điểm thu mẫu việc thu thập mẫu vật được thực hiện trong 10 phút bằng cách đập từ thảm cỏ, cây bụi và các cành cây thấp tới cao đến khi nào không thể với được thì dừng (khoảng 2,5 m). Bọ cánh cứng thu được được lưu trữ ngay lập tức trong các lọ có chứa ethanol tuyệt đối (96%) 10 cho bảo quản ADN, các lọ được đánh nhãn thời gian vị trí địa lý và tuyến đường thu mẫu. Hình 2.2: Sơ đồ thu mẫu Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa (a) Vị trí VQG Núi Chúa trong bản đồ Việt Nam (b) Phác họa hình dáng VQG Núi Chúa và các tuyến thu mẫu (c) Các vị trí thu mẫu trong các tuyến thu mẫu ở VQG Núi Chúa, với vùng màu xám là vùng chuyển tiếp được giả định 2.1.2. Phân chia sinh cảnh trong khu vực thu mẫu ở VQG Núi Chúa Sự phân chia sinh cảnh trong khu vực nghiên cứu dựa trên sự các kết quả nghiên cứu về VQG Núi Chúa trước đây kết hợp với việc phân tích một số tham số của quần xã Chrysomelidae như chỉ số Sorensen – Dice (chỉ số tương đồng) bằng việc sử dụng phương pháp cửa sổ trượt (sliding window) (Barton et al. 2013). 2.2. Phương pháp sinh học phân tử Toàn bộ phần mềm cơ thể mẫu vật đã được sử dụng cho tách chiết ADN bằng bộ công cụ DNeasy Blood và Tissue (Qiagen Iberia), theo protocol trong phòng thí nghiệm, phần xác còn lại của những mẫu vật này sau khi tách triết ADN được giữ lại, làm khô, gắn lại làm 11 tiêu bản với các thông tin thời gian, địa điểm và người thu thập mẫu vật để làm tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu sau này. Để phân định loài Chrysomelidae, các ADN của từng cá thể được dùng làm khuôn cho sự khuếch đại PCR của gen ty thể cytochrome c oxidase 1 (cox1). Để nghiên cứu thức ăn trong ruột của Chrysomelidae, chúng tôi khuếch đại vùng giữa của locus cpDNA PsbA-TrnH. 2.3. Phương pháp xác định loài Chrysomelidae Xác định loài Chrysomelidae theo dữ liệu sinh học phân tử: Chúng tôi sử dụng hai phương pháp tiếp cận loài dựa trên cây: mô hình Generalized Mixed Yule-Coalescent (GMYC) xem xét cả đơn và đa ngưỡng (Pons J. et al. 2006) và sự bổ sung Bayesian của mô hình Poisson Tree Processes (bPTP) (Zhangj-J et al. 2013). Chúng tôi sử dụng một số phần mềm như r8s, PADTHd8, BEAST 1.8.1 để thu được cây ultrametric (là cây quan hệ họ hàng mà các chiều dài từ gốc tới đỉnh bằng nhau). Sau đó sử dụng gói "splits " (Ezard et al. 2009) trong phần mềm R 3.1.1 để phân định loài theo mô hình GMYC với cả đơn ngưỡng và đa ngưỡng. Phương pháp bPTP, không yêu cầu cây phân cực và phân định loài được tối ưu hóa trên độ dài nhánh, bPTP chạy trực tuyến trên trang web "bPTP server" ( và chúng tôi đã sử dụng cùng một cây đầu vào gốc RAxML giống như trong sử dụng mô hình GMYC. Xác định loài dựa vào đặc điểm hình thái. Đầu tiên, các mẫu vật được quan sát dưới kính lúp soi nổi và phân chia sơ bộ đến mức độ phân họ sau đó các mẫu vật trong các phân họ được nhận dạng tới bậc phân loại thấp nhất theo khóa định loại của Kimoto (2000, 1989, 1982, 1981) Kết quả được so sánh với kết quả từ phương pháp xác định loài 12 dựa trên dữ liệu ADN. Nếu các dạng hình thái có sự đa màu sắc sẽ tiến hành kiểm tra đặc điểm của cơ quan sinh dục. 2.4. Phương pháp xác định thức ăn của các loài Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa: Sử dụng chương trình BAGpipe. 2.5. Đánh giá độ giàu loài tiềm năng của Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa: Các tính toán được thực hiện trong phần mềm EstimateS 9.1. 2.6. Nhóm các phương pháp xác định mối liên quan của Chrysomelidae với điều kiện môi trường 2.6.1. Phân tích biến động của quần xã Chrysomelidae theo không gian: Sử dụng phần mềm EstimateS 9.1 (Colwell 2013) và gói “betapart” trong phần mềm R. 2.6.2. Phân tích sự sắp xếp hợp quy chuẩn (CCA) để tìm ra nhân tố tác động tới tương tác giữa Chrysomelidae và thực vật chủ của chúng: Sử dụng gói “vegan” 2.0-10. 2.6.3. Đánh giá đa dạng beta của tương tác giữa các loài Chrysomelidae và thực vật chủ của chúng theo sinh cảnh (độ cao): Sử dụng gói “BAT”, các chỉ số đa dạng beta được tính toán cho từng quần xã Chrysomelidae và thực vật chủ trong hai sinh cảnh khô và ẩm. Đa dạng beta của tương tác thực vật chủ được thực hiện trên gói “betalink” 2.1.0 trong phần mềm R. 2.6.4.