Nghiên cứu đặc tính sinh học của vi khuẩn gây bệnh trên một số loài cá biển nuôi lồng tại Việt Nam và tạo chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin phòng bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --------------- LÊ MINH HẢI NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN Photobacterium damselae GÂY BỆNH TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ BIỂN NUÔI LỒNG TẠI VIỆT NAM VÀ TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN GIẢM ĐỘC LỰC PHỤC VỤ SẢN XUẤT VẮC XIN PHÒNG BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội, năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --------------- LÊ MINH HẢI NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN Photobacterium damselae GÂY BỆNH TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ BIỂN NUÔI LỒNG TẠI VIỆT NAM VÀ TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN GIẢM ĐỘC LỰC PHỤC VỤ SẢN XUẤT VẮC XIN PHÒNG BỆNH Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Phạm Thị Tâm PGS.TS. Tô Long Thành Hà Nội, năm 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện. Toàn bộ số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng được sử dụng để công bố trong các công trình nghiên cứu để nhận học vị, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2018 Tác giả luận án Lê Minh Hải ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài luận án này, ngoài sự lỗ lực của bản thân tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các tổ chức và cá nhân. Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Phạm Thị Tâm (Viện Đại học Mở Hà Nội), PGS. TS. Tô Long Thành (Trung tâm chuẩn đoán thú ý Trung ương) đã định hướng, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ, kỹ thuật viên, học viên của Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội nơi tôi thực hiện các nội dung trong đề tài luận án, đã hỗ trợ về mọi mặt để tôi có thể hoàn thành luận án này. Để hoàn thành luận án này, tôi còn nhận được sự động viên, khuyến khích giúp đỡ của các bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Tất cả những sự giúp đỡ và tình cảm quý báu đó là nguồn động lực lớn giúp tôi có thể hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những giúp đỡ quý báu đó! Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2018 Tác giả luận án Lê Minh Hải iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................ iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... vii DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................viii MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4 1.1. Tình hình nuôi cá biển trên thế giới và ở Việt Nam .................................. 4 1.1.1. Tình hình nuôi cá biển trên thế giới ........................................................ 4 1.1.2. Tình hình nuôi cá biển ở Việt Nam ......................................................... 5 1.2. Một số bệnh thường gặp trên cá biển nuôi lồng ........................................ 8 1.3. Vi khuẩn Photobacterium damselae và bệnh do vi khuẩn P. damselae gây ra trên cá biển .................................................................................................. 10 1.3.1.Vi khuẩn Photobacterium damselae ....................................................... 10 1.3.2. Bệnh do vi khuẩn Photobacterium damselae gây ra trên cá biển ......... 15 1.4. Tổng quan về tạo chủng vi khuẩn nhược độc .......................................... 19 1.4.1. Phương pháp vật lý ............................................................................... 19 1.4.2. Các phương pháp vi sinh vật học .......................................................... 21 1.4.3. Đột biến bằng kháng sinh rifampicin .................................................... 22 1.4.4. Giảm độc bằng kỹ thuật gen ................................................................. 24 1.5. Đáp ứng miễn dịch của cá và vắc xin phòng bệnh .................................. 25 1.5.1. Đáp ứng miễn dịch của cá ..................................................................... 25 1.5.2. Vắc xin phòng bệnh cho cá ................................................................... 29 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 42 2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 42 2.2. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 42 2.2.1. Động vật thí nghiệm .............................................................................. 42 iv 2.2.2. Hóa chất................................................................................................. 42 2.2.3. Môi trường và dung dịch nuôi cấy vi khuẩn ......................................... 42 2.2.4. Thiết bị .................................................................................................. 43 2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 43 2.4. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 43 2.4.1. Phương pháp thu mẫu cá bệnh .............................................................. 43 2.4.2. Phương pháp mổ cá để lấy nội tạng ...................................................... 44 2.4.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae ................. 44 2.4.4. Phương pháp giữ giống các chủng vi khuẩn tuyển chọn ...................... 45 2.4.5. Phương pháp xác định đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn tuyển chọn ................................................................................................................. 45 2.4.6. Phương pháp xác định ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng nhân lên và sinh độc tố gây dung huyết của vi khuẩn ............................ 46 2.4.7. Phương pháp nghiên cứu đặc tính gây bệnh Photobacteriosis (xuất huyết nhiễm trùng) trên cá biển của vi khuẩn P. damselae ............................ 47 2.4.8. Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm và xác định LD50 .......... 48 2.4.9. Phương pháp tách chiết DNA ................................................................. 48 2.4.10. Phương pháp Multiplex PCR phát hiện phân biệt P.damselae subsp. Damselae và P. damselae subsp. piscicida ..................................................... 49 2.4.11. Phương pháp PCR phát hiện gen dly và hlyA .................................... 49 2.4.12. Phương pháp điện di trên agarose ....................................................... 50 2.4.13. Phương pháp tạo chủng nhược độc bằng kỹ thuật gây đột biến thực nghiệm ............................................................................................................. 50 2.4.14. Đánh giá khả năng gây dung huyết của các dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực .............................................................................................................. 51 2.4.15. Phương pháp mô bệnh học .................................................................. 52 2.4.16. Giải trình tự DNA, xử lý và phân tích số liệu trình tự các gen ........... 53 v 2.4.17. Phương pháp xác định khả năng tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ ở cá của dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực ....................................................... 53 2.4.18. Phương pháp ELISA xác định kháng thể đặc hiệu ............................. 53 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 55 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn P. damselae ................................................... 55 3.1.1. Đặc điểm mẫu cá bệnh .......................................................................... 55 3.1.2. Kết quả phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh trên cá biển nuôi lồng .......................................................................................................... 57 3.1.3. Xác định phân loài P. damselase gây bệnh trên cá biển nuôi lồng bằng phương pháp sinh học phân tử ........................................................................ 61 3.1.4. Nghiên cứu độc lực của các chủng P. damselae phân lập .................... 63 3.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn P. damselae phân lập được ............................................................................................................ 65 3.2.1. Ảnh hưởng nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và gây dung huyết của vi khuẩn P. damselae ...................................................... 65 3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng và gây dung huyết của vi khuẩn P. damselae .......................................................................................... 69 3.2.3. Ảnh hưởng của độ mặn (NaCl) đến khả năng sinh trưởng và gây dung huyết của vi khuẩn P. damselae ...................................................................... 71 3.3. Kết quả tạo dòng vi khuẩn Photobacterium damselae đột biến giảm độc lực .................................................................................................................... 73 3.3.1. Kết quả tạo và lựa chọn các dòng vi khuẩn Photobacterium damselae đột biến ............................................................................................................ 73 3.3.2. Kết quả đánh giá mức độ giảm độc lực của các dòng vi khuẩn Photobacterium damselae đột biến ................................................................. 76 3.3.3. Kết quả đánh giá mức độ an toàn của vi khuẩn P. damselae đột biến giảm độc lực trên cá mú .................................................................................. 81 vi 3.3.4. Kết quả phân tích kiểm tra đột biến của các chủng vi khuẩn Photobacterium damselae nhược độc ............................................................. 88 3.4. Nghiên cứu mức độ tạo đáp ứng miễn dịch của dòng vi khuẩn Photobacterium damsalae đột biến giảm độc lực ......................................... 104 3.4.1. Kết quả xác định khả năng tạo kháng thể đặc hiệu ............................. 104 3.4.2. Kết quả xác định khả năng tạo kháng thể bảo hộ ............................... 106 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................... 111 Kết luận ......................................................................................................... 111 Kiến nghị ....................................................................................................... 111 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN ............................................................................ 112 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................... 113 PHỤ LỤC vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải thích AFLP Amplified fragment length polymorphism BFNNV Barfin flounder nervous necrosis virus BHI Brain heart infusion CFU Colony forming units - đơn vị khuẩn lạc cs Cộng sự Da Dalton DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme linked immunosorbent assay FA Fluorescent antibody - Kháng thể huỳnh quang GS Grouper spleen – tế bào lách cá mú IgM Immunoglobulin M - globulin miễn dịch lớp M LD50 Lethal dose 50 - liều gây chết 50% nt Nucleotide OD Optical density - mật độ quang ORF Open reading frame -khung đọc mở PCR Polymerase chain reaction - Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic acid TCBS Thiosulphate citrate bile salt- môi trường nuôi cấy UV Ultra violet VNN Viral nervour necrosis viii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Sản lượng đánh bắt và nuôi trồng thủy hải sản trên thế giới ........... 4 Bảng 1.2. Các loài cá biển nuôi chủ yếu ở Trung Quốc ................................... 5 Bảng 1.3. Báo cáo quy hoạch nuôi cá biển ở Việt Nam ................................... 7 Bảng 1.4. Một số vắc xin sản xuất từ vi khuẩn làm giảm độc lực ................. 37 Bảng 2.1. Mồi khuếch đại các gen UreC và 16S RNA ................................... 49 Bảng 2.2. Mồi khuếch đại các gen dly và hlyA .............................................. 49 Bảng 3.1. Kết quả thu mẫu và mẫu bệnh phẩm .............................................. 56 Bảng 3.2. Kết quả phân lập vi khuẩn P. damsalae từ các mẫu cá biển nghi mắc Photobacteriosis (xuất huyết nhiễm trùng) .............................. 58 Bảng 3.3. Kết quả xác định liều LD50 của các chủng vi khuẩn P.damselae phân lập .......................................................................................... 64 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng gây dung huyết của vi khuẩn P. damselae T1.7 và T4.3 ......................................... 69 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của pH đến khả năng gây dung huyết của vi khuẩn P. amselae T1.7 và T4.3 ..................................................................... 71 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng gây dung huyết của vi khuẩn P. damselae T1.7 và T4.3 .............................................................. 73 Bảng 3.7. Kết quả tạo chủng vi khuẩn P. damselae nhược độc bằng tác nhân UV .................................................................................................. 74 Bảng 3.8. Kết quả tạo chủng vi khuẩn P. damselae nhược độc bằng tác nhân kháng sinh Rifampicin ................................................................... 75 Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra gây dung huyết của các dòng Photobacterium damsela đột biến ............................................................................ 77 Bảng 3.10. Kết quả xác định liều LD50 của các dòng vi khuẩn P.damselae đột biến ................................................................................................. 80 Bảng 3.11. Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng của cá thí nghiệm ........... 81 ix Bảng 3.12. Biểu hiện bệnh tích do P. damselae trên cá thí nghiệm ............... 83 Bảng 3.13. Tần suất xuất hiện các tổn thương vi thể trong các tổ chức của cá thí nghiệm ...................................................................................... 85 Bảng 3.14. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn phân lập lại từ cá gây nhiễm .... 87 Bảng 3.15. So sánh độ tương đồng gen hlyA Genbank với chủng P.damselae T4.3 ................................................................................................ 92 Bảng 3.16. So sánh độ tương đồng gen dly Genbank so với chủng P.damselae T4.3 .............................................................................................. 101 x DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Hình thái của vi khuẩn P. damselae ............................................... 11 Hình 1.2. Tác động của tia tử ngoại tạo các dimer thymine. ......................... 21 Hình 1.3. Vùng kháng Rif của tiểu đơn vị β RNAP [56]. ..................................... 23 Hình 1.4. Đột biến kháng Rif ở vùng I của gen rpoB [56]. ................................ 23 Hình 2.1. Sơ đồ phương pháp mô bệnh học .................................................. 52 Hình 3.1. (a), (b) Mẫu cá mú nghi mắc bệnh Photobacteriosis, thu tại Hải Phòng (c) Mẫu cá mú không bị bệnh............................................................................. 55 Hình 3.2. Hình ảnh cơ quan nội tạng cá bị bệnh Photobacteriosis ................. 56 Hình 3.3. Hình thái vi khuẩn P. damselae...................................................... 59 Hình 3.4. Kết quả thử nghiệm các phản ứng sinh hóa của chủng T1.7 ......... 60 Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm multi-PCR khuếch đại các gen ureC và 16S rRNA của vi khuẩn P. damselase ............................................................. 62 Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn P. damselae T1.7 .............................................................................. 66 Hình 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn P. damselae T4.3 .............................................................................. 66 Hình 3.8. Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh trưởng của P. damselae .... 70 Hình 3.9. Ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn ... 72 P. damselae phân lập ....................................................................................... 72 Hình 3.10. Khuẩn lạc sống sót sau khi chiếu UV .......................................... 75 Hình 3.11. Khuẩn lạc sống sót sau khi sử dụng kháng sinh rifampicin ......... 76 Hình 3.12. Hình ảnh dung huyết thạch máu của các dòng vi khuẩn thí nghiệm . 77 Hình 3.13. Biểu hiện bệnh tích bên ngoài của cá mú gây nhiễm chủng P. damselae T4.3 (liều tiêm 100 LD50, sau 7 ngày) ............................................ 82 Hình 3.14. Biểu hiện bệnh tích ở các cơ quan bên trong cơ thể của cá gây nhiễm ............................................................................................................... 84 xi Hình 3.15. Biểu hiện bệnh tích ở các cơ quan bên trong cơ thể của cá gây nhiễm ... 86 Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen hlyA của chủng giống gốc và các dòng gây giảm độc lực ........................................................ 89 Hình 3.17. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dly của chủng giống gốc và các dòng gây giảm độc lực ........................................................ 89 Hình 3.18. Kết quả so sánh trình tự gen hlyA của chủng gốc T4.3 với trình tự hlyA trên Genbankmã số KF984030.1 ............................................................ 92 Hình 3.19. So sánh trình tự gen hlyA của các dòng đột biến và chủng T4.3 gốc .. 95 Hình 3.20. Vị trí mã mở đầu và mã kết thúc vùng mã hóa protein của dòng U4.3K8.2 và chủng gốc T4.3 .......................................................................... 98 Hình 3.21. So sánh trình tự amino acid của các dòng T4.3U6, T4.3K8.2 và chủng gốc T4.3 ................................................................................................ 99 Hình 3.22. Kết quả so sánh trình tự gen dly của chủng gốc T4.3 và LBT6 với trình tự gen dly của Genbank ........................................................................ 100 Hình 3.23. Trình tự đoạn gen dly của các dòng đột biến với chủng gốc T4.3 . 102 Hình 3.24. Trình tự protein suy diễn của các dòng đột biến với chủng gốc T4.3 102 Hình 3.25. Biến thiên mức độ hình thành kháng thể đặc hiệu ở cá được tiêm vi khuẩn nhược độc và vô hoạt ..................................................................... 105 Hình 3.26. Tỷ lệ sống của cá được công cường độc với chủng T1.8 sau khi tiêm vi khuẩn nhược độc và vô hoạt ............................................................. 107 Hình 3.27. Tỷ lệ sống của cá được công cường độc với chủng T1.7 sau khi tiêm vi khuẩn nhược độc và vô hoạt ............................................................. 108 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Việt Nam có tiềm năng lớn về nuôi trồng thủy sản trên biển, diện tích có khả năng sử dụng phát triển nuôi cá biển bao gồm các vùng vịnh kín, bãi triều ven biển và một phần ở các hải đảo, vùng biển hở. Biển Việt Nam có nhiều loài cá phân bố tự nhiên có thể đưa vào nuôi biển như nhóm cá mú, cá hồng, cá cam, cá tráp, cá giò, cá vược... Trong chương trình nuôi, đến năm 2020 Việt Nam dự kiến đạt sản lượng 200.00