Nghiên cứu sự đa dạng tuyến trùng ký sinh gây sần rễ meloidogyne spp ở Tây Nguyên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- LÊ THỊ MAI LINH NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY SẦN RỄ Meloidogyne spp. Ở TÂY NGUYÊN LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC HÀ NỘI – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- LÊ THỊ MAI LINH NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY SẦN RỄ Meloidogyne spp. Ở TÂY NGUYÊN LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC Chuyên ngành: Tuyến trùng học Mã số: Thí điểm Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. TS. Trịnh Quang Pháp 2. PGS. TS. Phan Kế Long Hà Nội – 2019 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan : Luận án „NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY SẦN RỄ Meloidogyne spp. Ở TÂY NGUYÊN‟‟là công trình do bản thân tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Trịnh Quang Pháp và PGS.TS. Phan Kế Long. Các trích dẫn trong luận án theo các nguồn công bố đầy đủ. Số liệu, kết quả nêu trong Luận án là trung thực và chưa công bố hoặc công bố trong các bài báo khoa học mà tôi là tác giả hoặc đồng tác giả. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận án Lê Thị Mai Linh ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới TS. Trịnh Quang Pháp và PGS.TS. Phan Kế Long đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn TS. Vũ Thị Thanh Tâm, ThS. Nguyễn Thị Duyên, ThS. Nguyễn Hữu Tiền, TS. Nguyễn Thị Ánh Dương đã hỗ trợ tôi trong quá trình hoàn thiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn ban lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn, phòng Tuyến trùng học, Học viện Khoa học và Công nghệ cùng các đồng nghiệp, Thầy Cô trong Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Quỹ phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOTED) trong đề tài mã số:106–NN.03–2013.56; Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật (IEBR) trong đề tài mã số: IEBR.ĐT/04/17-18, IEBR.ĐT/04/G2-18 đã hỗ trợ kinh phí để tôi thực hiện các nội dung nghiên cứu. Một lần nữa, tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận án Lê Thị Mai Linh iii MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. vi DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... vii DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. ix MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 5 1.1.Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne trên thế giới... 5 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu ......................................................................................................... 5 1.1.2. Đặc điểm sinh học, vòng đời của tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne ............... 7 1.1.3. Khả năng gây hại trên một số cây trồng ...................................................................... 9 1.1.4. Nghiên cứu phân loại các loài tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne ...... 11 1.1.4.1. Phương pháp phân tích hình thái .............................................................................. 11 1.1.4.2. Phương pháp phân tích phân tử ................................................................................ 13 1.2. Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne tại Việt Nam ................................................................................................................................... 16 1.2.1. Tình hình nghiên cứu chung tại Việt Nam ............................................................... 16 1.2.2. Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ Meloidogyne tại Tây Nguyên .............. 18 1.2.2.1. Tổng quan Tây Nguyên .............................................................................................. 19 1.2.2.2. Tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne tại Tây Nguyên .......................................... 21 1.3. Biện pháp phòng trừ sinh học tuyến trùng sần rễ Meloidogyne.................................... 22 CHƢƠNG 2 NỘI DUNG, ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 27 2.1. Nội dung, đối tƣợng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu ................. 27 2.1.1. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................... 27 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................................. 27 2.1.3. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................................... 27 2.1.4. Thời gian, địa điểm nghiên cứu .................................................................................. 27 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................. 28 2.2.1. Khảo sát thực địa và phương pháp thu mẫu ............................................................. 28 2.2.2. Phương pháp tách lọc tuyến trùng từ đất .................................................................. 29 2.2.3 Phương pháp tách lọc tuyến trùng từ rễ ..................................................................... 30 2.2.4. Nhân nuôi tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. ...................................................... 30 2.2.5. Phương pháp xử lý làm trong và làm tiêu bản tuyến trùng .................................... 31 2.2.6. Nghiên cứu hình thái ................................................................................................... 33 iv 2.2.7. Nghiên cứu đa dạng di truyền .................................................................................... 35 2.2.7.1. Tách chiết DNA .......................................................................................................... 35 2.2.7.2. Phản ứng PCR ............................................................................................................ 36 2.2.7.3. Điện di sản phẩm ........................................................................................................ 37 2.2.7.4. Tinh sạch sản phẩm PCR và đọc trình tự DNA ........................................................ 38 2.2.7.5. Phân tích trình tự DNA .............................................................................................. 38 2.2.7.6. Thiết lập cây phát sinh chủng loại ............................................................................. 38 2.2.8. Đánh giá ảnh hưởng của một số vi sinh vật đối kháng ........................................... 38 2.2.8.1. Nấm Paecylomyces javanicus .................................................................................... 38 2.2.8.2. Vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 .................................................................. 39 2.2.8.3. Ảnh hưởng của hợp chất 4-HydroxyphenylaceticAcid (4-HPAA) đến tuyến trùng M. incognita .............................................................................................................................. 39 2.2.8.4. Phân tích số liệu.......................................................................................................... 40 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................... 41 3.1. Tần suất xuất hiện, đặc điểm phân bố, khả năng gây hại của các loài tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne ............................................................................. 41 3.1.1. Tần suất xuất hiện của các loài tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne trên một số cây trồng ở Tây Nguyên ......................................................................................................... 41 3.1.2. Phân bố, mật độ của các loài tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne bắt gặp trên các vùng thu mẫu và cây chủ ................................................................................................ 43 3.2. Đặc điểm hình thái các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở Tây Nguyên ................................................................................................................................... 49 3.2.1. Loài Meloidogyne incognita (Kofoid & White, 1919) Chitwood, 1949 ................. 49 3.2.1.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng ...................................................................... 49 3.2.1.2. Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại ................................................................. 50 3.2.2. Loài Meloidogyne javanica (Treub, 1885) Chitwood, 1949 ..................................... 61 3.2.2.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng ...................................................................... 61 3.2.2.2. Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại ................................................................. 68 3.2.3. Loài Meloidogyne arenaria (Neal, 1889) Chitwood, 1949 ...................................... 69 3.2.3.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng ...................................................................... 70 3.2.3.2. Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại ................................................................. 70 3.2.4. Loài Meloidogyne enterolobii Yang, Eisenback., 1983 ........................................... 80 3.2.4.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng ...................................................................... 80 3.2.4.2. Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại ................................................................. 87 3.2.5. Loài Meloidogyne graminicola Golden & Birchfield 1965 ..................................... 90 3.2.5.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng ...................................................................... 90 3.2.5.2. Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại ................................................................. 91 v 3.2.6. Loài Meloidogyne daklakensis Trinh, Le, Nguyen, Nguyen, Liebanas & Nguyen, 2018 ........................................................................................................................................... 97 3.2.7. Loài Meloidogyne sp................................................................................................... 106 3.3. Đa dạng hình thái, hình thái lƣợng các loài Meloidogyne .......................... 113 3.3.1. Phân tích đa dạng hình thái lượng giữa các loài Meloidogyne ............................ 113 3.3.2. So sánh hình thái giữa các loài Meloidogyne spp. ................................................. 118 3.4 . Phân tích đa dạng di truyền các loài Meloidogyne spp. ............................. 127 3.4.1. Phản ứng Multiplex-PCR .......................................................................................... 127 3.4.2. Phân tích đa dạng di truyền ...................................................................................... 128 3.4.2.1 Vùng gen ITS .............................................................................................................. 129 3.4.2.2 Vùng gen D2D3 ......................................................................................................... 133 3.4.2.3. Vùng gen COI ........................................................................................................... 137 3.4.2.4. Vùng gen COII-16S .................................................................................................. 141 3.4.2.5. Vùng gen NAD5 ........................................................................................................ 146 3.5. Đánh giá ảnh hƣởng của một số vi sinh vật đối kháng ............................... 150 3.5.1. Nấm Paecylomyces javanicus .................................................................................. 150 3.5.1.1. Ảnh hưởng của dịch bào tử nấm P. javanicus đến tỷ lệ nở của trứng của tuyến trùng M. incognita .................................................................................................................. 150 3.5.1.2. Ảnh hưởng của dịch bào tử nấm P. javanicus đến tỷ lệ chết của ấu trùng M. incognita.................................................................................................................................. 151 3.5.2. Vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 .............................................................. 154 3.5.2.1. Ảnh hưởng của dịch bào tử vi khuẩn L. antibioticus HS124 đến sự nở trứng của tuyến trùng M. incognita........................................................................................................ 154 3.5.2.2. Ảnh hưởng của dịch bào tử vi khuẩn L. antibioticus HS124 đến ấu trùng M. incognita.................................................................................................................................. 155 3.5.3. Ảnh hưởng của 4-HPAA tới tuyến trùng Meloidogyne incognita ..................... 158 CHƢƠNG 4............................................................................................................ 161 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 161 4.1. KẾT LUẬN ..................................................................................................... 161 4.2. KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 162 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ........................................... 163 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 164 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Diễn giải 16S-rRNA 16S Ribosomal Axit Ribonucleic ADF Actin depolymerizing factor ANOVA One-way analysis of variance (Phân tích phương sai một yếu tố) CDA Canonical discriminant analysis (Phân tích chỉ số khác biệt) COI Cytochrome c oxidase subunit 1 COII Cytochrome c oxidase subunit 2 ĐC Đối chứng DMSO Dimethyl sulphoxide DNA Deoxyribonucleic acid (Axit Deoxyribonucleic) EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid (Axit ethylenediamine tetraacetic ) ETS E26 transformation-specific GA Gallic acid (Axit galic) HPAA Hydroxyphenylacetic acid (Axit hydroxyphenylacetic) IGS Intergenic spacer ITS Internal transcribed spacer MIG Meloidogyne incognita group NAD5 Nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit 5 NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase) RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA (Đa hình DNA nhân bản ngẫu nhiên) SCAR Sequence Characterized Amplified Region (Nhân bản chuỗi DNA được mô tả) SEM Scanning Electron Microscope (Hiển vi điện tử quét) STT Số thứ tự TAE Tris-acetate-EDTA TAF Triethanolamine formalin VSV Vi sinh vật WLB Worm lysis buffer vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Trình tự mồi được sử dụng trong nghiên cứu ....................................................... 37 Bảng 3.1. Tần suất xuất hiện của các loài tuyến trùng Meloidogyne spp. trên một số cây trồng ở Tây nguyên .................................................................................................................. 43 Bảng 3.2. Phân bố của các loài Meloidogyne bắt gặp trên các vùng thu mẫu, cây chủ ...... 45 Bảng 3.3. Danh sách mẫu và mật độ các loài tuyến trùng Meloidogyne ghi nhận được ... 47 Bảng 3.4. Số đo con cái các quần thể Meloidogyne incognita (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước ...................................................................................................................... 53 Bảng 3.5. Số đo con đực các quần thể Meloidogyne incognita (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước ...................................................................................................................... 54 Bảng 3.6. Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne incognita (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước ...................................................................................................................... 57 Bảng 3.7. Số đo con cái các quần thể Meloidogyne javanica (số đo theo µm) và nghiên cứu trước .......................................................................................................................................... 62 Bảng 3.8. Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne javanica (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước ...................................................................................................................... 63 Bảng 3.9. Số đo con đực quần thể Meloidogyne javanica (số đo theo µm) và nghiên cứu trước. ......................................................................................................................................... 65 Bảng 3.10. Số đo con cái các quần thể tuyến trùng loài Meloidogyne arenaria (số đo theo µm) và nghiên cứu trước ......................................................................................................... 73 Bảng 3.11. Số đo con đực các quần thể Meloidogyne arenaria (số đo theo µm) và nghiên cứu trước ................................................................................................................................... 74 Bảng 3.12. Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne arenaria (số đo theo µm) và nghiên cứu trước ................................................................................................................................... 76 Bảng 3.13. Số đo con cái các quần thể Meloidogyne enterolobii (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước ...................................................................................................................... 81 Bảng 3.14. Số đo con đực các quần thể Meloidogyne enterolobii (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước đó ................................................................................................................. 82 Bảng 3.15. Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne enterolobii (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước đó ................................................................................................................. 84 Bảng 3.16. Số đo con cái các quần thể Meloidogyne graminicola (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước ...................................................................................................................... 92 Bảng 3.17. Số đo con đực các quần thể Meloidogyne graminicola (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước ...................................................................................................................... 93 Bảng 3.18. Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne graminicola (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước ...................................................................................................................... 94 Bảng 3.19. Số đo các quần thể Meloidogyne daklakensis n. sp .......................................... 102 Bảng 3.20. Số đo các quần thể tuyến trùng sần rễ Meloidogyne sp ................................... 110 Bảng 3.21. Bảng chỉ số CDA giữa các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne .................... 114 viii Bảng 3.22. Đặc điểm so sánh hình thái lượng của các loài tuyến trùng Meloidogyne ...... 119 Bảng 3.23. Tỷ lệ % các loại nucleotide trong trình tự gen ITS ...........