Nghiên cứu sugarcane yellow leaf virus gây bệnh vàng gân lá trên mía (yls) bằng kính hiển vi huỳnh quang và kỹ thuật rt-Pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** NGUYỄN MINH NAM NGHIÊN CỨU SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS GÂY BỆNH VÀNG GÂN LÁ TRÊN MÍA (YLS) BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG VÀ KỸ THUẬT RT-PCR Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************* NGHIÊN CỨU SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS GÂY BỆNH VÀNG GÂN LÁ TRÊN MÍA (YLS) BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG VÀ KỸ THUẬT RT-PCR LUẬN VĂN KỸ SƢ Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN NGUYỄN MINH NAM Niên khóa: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** RESEARCH ON SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS, THE CAUSAL AGENT OF YELLOW LEAF SYNDROME IN SACCHARUM BY FLUORESCENCE MICROCOPY AND RT-PCR METHOD Graduation thesis Major: Biotechnology Professor Student A.Professor. Dr. BUI CACH TUYEN NGUYEN MINH NAM Term: 2002 - 2006 Ho Chi Minh City 09/2006 LÔØI CAÛM TAÏ Con xin thành kính khắc ghi cù lao của cha mẹ, Ngƣời đã sinh thành, dƣỡng dục và hy sinh tất cả để cho anh em con đƣợc ăn học nên ngƣời. Con xin cảm ơn gia đình đã là chỗ dựa vững chắc cho con vững bƣớc vƣợt qua mọi khó khăn. Em xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM, ban Chủ Nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện cho em thực hiện thành công khóa luận. PGS. TS. Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn tất khóa luận này. TS. Bùi Minh Trí đã tận tình dạy bảo và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. PGS. TS. Trần Thị Dân, TS. Nguyễn Ngọc Hải, ThS. Trần Nhật Phƣơng đã giúp đỡ em giải quyết những vƣớng mắc trong quá trình thực hiện khóa luận. Toàn thể Thầy, Cô đã trang bị cho em những kiến thức quí báu. TS. M. Irey (USDA) đã tận tình cung cấp trình tự primers và protocol RT- PCR cho em. TS. Tania (South African Sugarcane Research Institute) và TS. S. Schenck (HARC) đã tận tình cung cấp antiserum của ScYLV cho em. TS. Becky (itdna company) đã cung cấp cho em những tài liệu quí giá. Anh Hà Đình Tuấn và anh Thống ở Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú, các anh ở trại giống Đức Huệ, Long An và các hộ dân ở xã Phú Lý, Vĩnh Cửu, Đồng Nai đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em trong quá trình thu thập mẫu. Các Thầy, Cô và anh chị tại Trung tâm Phân tích Hóa Sinh đã hết lòng giúp đỡ và cho em những kinh nghiệm quí báu để em thực hiện thành công khóa luận này. Các bạn lớp công nghệ sinh học 28 đã luôn ở bên mình, động viên và nhiệt tình giúp đỡ mình trong suốt thời gian mình học tập cũng nhƣ trong lúc mình thực hiện khóa luận này. Tp Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 08 năm 2006 Nguyễn Minh Nam TÓM TẮT Nguyễn Minh Nam, Đại học Nông Lâm Tp HCM. Tháng 9 năm 2006. “NGHIÊN CỨU SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS GÂY BỆNH VÀNG GÂN LÁ TRÊN MÍA (YLS) BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG VÀ KỸ THUẬT RT-PCR” đƣợc tiến hành tại Trung tâm Phân tích Hóa Sinh Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh; Trung tâm Công nghệ và Quản lý Môi trƣờng và Tài nguyên Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh; Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú, Bình Dƣơng; xã Phú Lý, huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai; xã Mỹ Thạnh Tây, Đức Huệ, Long An, xã Tân An, Thủ Dầu Một từ tháng 3/2006 đến tháng 8/2006. Triệu chứng vàng gân lá trên mía do sugarcane yellow leaf virus gây ra, đây là một tác nhân gây bệnh quan trọng. Bệnh này đã xảy ra ở nhiều vùng trồng mía trên thế giới. ScYLV tập trung trong bó mạch libe của cây. Triệu chứng của bệnh thƣờng xuất hiện ở cây trƣởng thành với biểu hiện vàng ở gân lá. Bệnh này có thể đƣợc chẩn đoán dựa vào biểu hiện triệu chứng, kỹ thuật RT-PCR, ELISA, TBIA, ISEM, kính hiển vi điện tử hoặc kính hiển vi huỳnh quang. Nội dung của đề tài bao gồm: - Phát hiện sự nhiễm ScYLV dựa vào triệu chứng. - Kiểm tra các bó mạch libe của cây có và không có biểu hiện triệu chứng vàng gân lá bằng kính hiển vi quang học và kính hiển vi huỳnh quang. - Chẩn đoán ScYLV bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi YLS111 và YLS462. Kết quả của đề tài: - Triệu chứng vàng gân lá trên mía đã xuất hiện tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú, Bình Dƣơng; xã Phú Lý, huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai; xã Mỹ Thạnh Tây, Đức Huệ, Long An, xã Tân An, Thủ Dầu Một, Bình Dƣơng. - Đối với cây có biểu hiện triệu chứng thì bó mạch libe có sự phát huỳnh quang trong khi bó mạch của cây bình thƣờng thì không. - Xây dựng đƣợc qui trình RT-PCR có thể chẩn đoán ScYLV. SUMMARY The thesis entitled “RESEARCH ON SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS, THE CAUSAL AGENT OF YELLOW LEAF SYNDROME IN SACCHARUM BY FLUORESCENCE MICROCOPY AND RT-PCR METHOD”. This research was conducted from 3th, 2006 to 8th, 2006 in the laboratory of Biological and Chemical Analysis Center of Nong Lam University; Research Center for Environmental Technology and Nature Resource Management of Nong Lam University; and at Institute of Sugarcane Research of An Phu; Phu Ly village, Vinh Cuu district, Dong Nai province; My Thanh Tay village, Duc Hue district, Long An province, Tan An village, Thu Dau Mot town, Binh Duong province. Sugarcane yellow leaf syndrome is caused by sugarcane yellow leaf virus, being a pathogen of economic importance. The disease has been reported to occur in many sugarcane growing area worldwide. Sugarcane yellow leaf virus resides in the phloem of diseased canes. Symptoms of the disease generally appear in maturing plant as a yellowing of the leaf midrib. The disease can be diagnosed by symptoms, RT- PCR, ELISA, TBIA, ISEM, EM or fluorescence microcopy. The objectives of this research are as follows: - To identify ScYLV infecting plants by symptoms. - To examine the phloem of plant with symptom and symptom less plant by light microcopy and fluorescence microcopy. - To diagnose the ScYLV by RT-PCR with YLS111 and YLS462 primers. The results of this research are as follows: - Sugarcane yellow leaf syndrome has been present in sugarcane grown at Institute of Sugarcane Research of An Phu; Phu Ly village, Vinh Cuu district, Dong Nai province; My Thanh Tay village, Duc Hue district, Long An province, Tan An village, Thu Dau Mot town, Binh Duong province. - In plants expressing disease symptom, the vascular bundles presented fluorescence in the phloem while symtomless plants do not have fluorescence. - Finding out the RT-PCR process that can be used for ScYLV diagnosis. iv MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa LÔØI CAÛM TAÏ ........................................................................................................................ i TÓM TẮT .................................................................................................................................. ii MỤC LỤC ................................................................................................................................. iv DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................................... vi DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ ............................................................................. vii DANH SÁCH CÁC HÌNH ....................................................................................................... vii PHẦN 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................................... 1 1.2 Mục Đích .................................................................................................................... 2 1.3 Yêu Cầu ...................................................................................................................... 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 3 2.1 Tổng quan về cây mía ................................................................................................. 3 2.1.1 Về cây mía .......................................................................................................... 3 2.1.2 Một số bệnh do virus trên cây mía ..................................................................... 5 2.2 Bệnh vàng gân lá trên mía và sugarcane yellow leaf virus ........................................ 7 2.2.1 Bệnh vàng gân lá trên mía .................................................................................. 7 2.2.2 Sugarcane yellow leaf virus ................................................................................ 9 2.2.3 Ảnh hƣởng về kinh tế của bệnh vàng gân lá .................................................... 15 2.2.4 Những nghiên cứu về tính kháng ScYLV trên mía .......................................... 16 2.2.5 Tạo cây mía chuyển gene kháng ScYLV ......................................................... 16 2.2.6 Tạo cây mía sạch bệnh bằng kỹ thuật nuôi cấy mô .......................................... 17 2.2.7 Một số kỹ thuật trong chẩn đoán ScYLV ......................................................... 17 2.3 Những nghiên cứu về ScYLV trên thế giới và ở việt nam ....................................... 25 2.3.1 Những nghiên cứu về ScYLV trên thế giới ...................................................... 25 2.3.2 Những nghiên cứu về ScYLV ở Việt Nam ...................................................... 26 2.4 Kỹ thuật PCR và RT-PCR ........................................................................................ 27 2.4.1 PCR ................................................................................................................... 27 2.4.2 RT-PCR ............................................................................................................ 28 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 30 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................................ 30 v 3.2 Phƣơng pháp lấy mẫu ............................................................................................... 30 3.3 Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ........................................................................ 31 3.3.1 Máy móc, thiết bị .............................................................................................. 31 3.3.2 Dụng cụ ............................................................................................................ 31 3.4 Hóa chất .................................................................................................................... 32 3.4.1 Hóa chất sử dụng trong RT- PCR ..................................................................... 32 3.4.2 Hóa chất sử dụng trong điện di ......................................................................... 32 3.5 Phƣơng pháp quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang ............................................ 33 3.6 Phƣơng pháp phát hiện bằng kỹ thuật RT-PCR ....................................................... 33 3.6.1 Qui Trình Ly Trích RNA .................................................................................. 33 3.6.2 Qui trình thực hiện phản ứng RT-PCR ............................................................. 35 3.6.3 Qui trình RT-PCR chỉnh sửa ............................................................................ 35 3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu ........................................................................................ 36 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................... 37 4.1 Các biểu hiện của triệu chứng vàng gân lá do ScYLV ............................................. 37 4.2 Kết quả chuẩn đoán dựa vào triệu chứng ................................................................. 39 4.2.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng ................................................... 39 4.2.2 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo địa phƣơng ................................................................... 40 4.2.3 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo nguồn gốc giống .......................................................... 42 4.3 Quan sát mạch dẫn bằng kính hiển vi huỳnh quang ................................................. 43 4.4 Kết quả RT-PCR dựa theo qui trình của M. Irey ...................................................... 46 4.5 Kết Quả RT-PCR ...................................................................................................... 46 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................ 48 5.1 Kết luận .................................................................................................................... 48 5.2 Đề nghị ..................................................................................................................... 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................... 50 vi DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT Bp: Base pair BYDV: Barley Yellow Dwarf Luteovirus cDNA: complementary DNA CP: Coat Protein DAS-ELISA: Double Antibody Sandswich - ELISA DBIA: Dot-Blot Immunoassay DEPC: Diethyl Pyrocarbonate DNA: Deoxyribonucleic Acid dNTP: Deoxyribonucleoside Triphosphate dsRNA: double stranded RNA ELISA: Enzyme - Linked Immunosorbent Assay EM: Electron Microscopy g: Gram ha: Hecta ISEM: Immunosorbent Electron Microscopy k Da: Kilo Dalton kg: Kilogram ml: Mililitre µl: Microlitre µm: Micrometre mm: Milimetre MP: Movement Protein mRNA: Messenger RNA NASBA: Nucleic Acid Sequence-Based Amplification nm: Nanometre ORF: Open Reading Frame PCR: Polymerase Chain Reaction PEMV: Pea enation mosaic virus PLRV: Potato leaf roll virus PTGS: Posttranscriptional Gene Silencing PVP: Polyvinylpyrrolidone RdRp: RNA dependent RNA polymerase RNA: Ribonucleic Acid RT-PCR: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction SCBV: Sugarcane bacilliform virus ScYLV: Sugarcane Yellow Leaf Virus SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sunfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis SSR: Single Sequence Repeat ssRNA: Single stranded Ribonucleic Acid TIBA: Tissue Blot Immunoassay UTR: Untranslated Region YLS: Yellow Leaf Syndrome vii DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ Bảng 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng ........................................................... 39 Bảng 4.2. Tỷ lệ nhiễm bệnh vàng gân lá theo địa phƣơng ....................................................... 40 Bảng 4.3. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giống .................................................................................................... 42 Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng ...................................................... 39 Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ nhiễm bệnh giữa các địa phƣơng ................................................................ 41 Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo nguồn gốc giống ............................................................... 43 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Sự phân bố của ScYLV trên thế giới .......................................................................... 8 Hình 2.2. Sugarcane yellow leaf virus dƣới kính ....................................................................... 9 Hình 2.3. Rệp lá bắp. Rệp có cánh (A,B), rệp không cánh (C) trƣởng thành. ......................... 11 Hình 2.4. Biểu đồ mô tả bộ gene của Luteovirus thuộc nhóm phụ I và II ............................... 12 Hình 2.5. Cấu trúc kẹp tóc giả định trong bộ gene của ScYLV ............................................... 14 Hình 2.6. Các bó mạch gân lá đƣợc kiểm tra bởi kính hiển vi huỳnh quang.. ......................... 19 Hình 2.7. Vi ảnh điện tử của lát cắt siêu mỏng của tế bào kèm libe cây mía ........................... 20 Hình 2.8. Kết quả TIBA của vết in gân lá khỏe (trên) và lá bị nhiễm (dƣới) ........................... 21 Hình 2.9. Màng nitrocellulose đƣợc xử lý bằng kỹ thuật TBIA với huyết thanh ..................... 22 Hình 2.10. Kết quả immunoblotting (westren blotting) của protein ScYLV ........................... 22 Hình 2.11. Phân tử Beacon ....................................................................................................... 23 Hình.2.12. Nguyên tắc của phản ứng PCR ............................................................................... 27 Hình 2.13. Sơ đồ phản ứng RT-PCR ........................................................................................ 29 Hình.4.1. Lá biểu hiện triệu chứng vàng gân lá ....................................................................... 37 Hình 4.2 Triệu chứng vàng gân lá bắt đầu từ lá thứ 3 .............................................................. 37 Hình 4.3. Cây biểu hiện triệu chứng vàng gân lá. .................................................................... 38 Hình 4.4. Cánh đồng có triệu chứng vàng gân lá (A). Cánh đồng khỏe mạnh (B) ................. 38 Hình 4.5 Các bó mạch của gân lá đƣợc kiểm tra bởi kính hiển vi huỳnh quang. ..................... 44 Hình 4.6. Các bó mạch gân lá đƣợc quan sát bằng kính hiển vi quang học (100X) ................ 45 Hình 4.7. Sự phát huỳnh quang của tế bào do có phản ứng chết (200X) ................................. 45 Hình 4.8. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR. ......................................................................... 46 Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR ......................................................................................... 47 iv PHẦN 1. MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ở nƣớc ta hiện nay mía là nguyên liệu duy nhất để chế biến ra đƣờng, nên mía là một cây trồng quan trọng trong cơ cấu cây thực phẩm. Ngoài ra, mía còn là cây có sản lƣợng cao (có thể đạt tới 200-250 tấn sinh khối/1ha/năm) và hiệu quả kinh tế cao nên mía là cây xóa đói giảm nghèo cho nông dân (Trần Văn Sỏi, 2003). Tuy nhiên trở ngại lớn trong quá trình canh tác cây mía là bệnh dịch, đặc biệt nhất là bệnh do virus. Trong đó, bệnh do Sugarcane yellow leaf virus (ScYLV) đang là tác nhân gây bệnh quan trọng về kinh tế ở nhiều nƣớc trên thế giới. Virus này đƣợc phát hiện và công bố ở hơn 30 nƣớc trên khắp thế giới nhƣ South Afica, Swaziland, Malawi và Zimbabwe (Bailey et al., 1996), Mauritius (Anon 1996, Saumtally and Moutia, 1997), USA và Australia (Borg et al., 1997), Brazil (Anon., 1995), Cuba (Arocha, Y., Gonzalez, L., Peralta, E. L., and Jones, 1999) (trích bởi Schenck, 2001), Ecuador (Freddy, 2006), … Sugarcane yellow leaf virus gây thiệt hại kinh tế lớn trên các vùng trồng mía, thiệt hại ƣớc tính khoảng 40-60% ở Brazil và hơn 20% ở các vùng khác. Việc chẩn đoán sự nhiễm virus và đƣa ra các biện pháp phòng trừ có ý nghĩa kinh tế rất lớn. Diện tích trồng mía ở nƣớc ta lớn, triệu chứng vàng lá do virus Sugarcane yellow leaf virus cũng đã xuất hiện ở nhiều nơi. Tuy vậy, hiện nay vẫn chƣa có một công trình nghiên cứu nào cụ thể đánh giá sự hiện diện và phân bố cũng nhƣ nguồn gốc của virus này ở nƣớc ta. Việc chẩn đoán và đánh giá tình hình, sự hiện diện nguồn gốc và phân bố của Sugarcane yellow leaf virus là rất cần thiết trong việc hạn chế và phòng ngừa thiệt hại do virus này gây ra tại Việt Nam. Với thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sugarcane yellow leaf virus gây bệnh vàng lá trên mía (YLS) bằng kính hiển vi huỳnh quang và kỹ thuật RT-PCR”. 2 Mục đích ­ Đánh giá tình trạng nhiễm virus ScYLV trên tập đoàn giống gốc và tập đoàn giống mới nhập nội từ Thái Lan tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú, huyện Bến Cát, tỉ