Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của rễ củ cây mạch môn (ophiopogon japonicus (l.f.) ker - Gawl.)

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ------------------------ Nguyễn Đình Chung NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA RỄ CỦ CÂY MẠCH MÔN (OPHIOPOGON JAPONICUS (L.f.) KER-GAWL.) Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ Mã số: 62.44.01.14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội – 2018 2 Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS. TS. Nguyễn Tiến Đạt Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Nguyễn Văn Thanh Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ tại hội đồng chấm luận án Tiến sĩ cấp Học viện họp tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Vào hồi: giờ ngày tháng năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - Thư viện Quốc gia 1 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Tính cấp thiết của luận án Vai trò quan trọng của các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học đã được khẳng định từ các nền y học cổ truyền cho đến y học hiện đại. Giá trị của chúng không chỉ có công dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh mà vì còn có thể dùng làm nguyên mẫu hoặc cấu trúc dẫn đường cho sự phát hiện và phát triển nhiều dược phẩm mới. Việt Nam được đánh giá là nước có nguồn tài nguyên dược liệu phong phú và có nhiều kinh nghiệm sử dụng nguồn dược liệu này nhờ vào nền y học cổ truyền lâu đời. Theo thống kê ở Việt Nam hiện có hơn 13000 loài thực vật trong đó hơn 5000 loài được sử dụng làm thuốc. Đây là một lợi thế để chúng ta khai thác nguồn dược liệu này phục vụ cho cuộc sống. Trên cơ sở kết quả sàng lọc các dịch chiết thô của một số dược liệu Việt Nam về các hoạt tính gây độc tế bào ung thư và kháng viêm, rễ củ cây Mạch môn được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu của luận án. Mạch môn có tên khoa học là Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl. được trồng nhiều nơi trong nước ta làm cảnh và làm thuốc. Rễ củ của cây này là một dược liệu quý có mặt trong rất nhiều bài thuốc y học cổ truyền với mục đích chữa ho long đờm, thương tổn, ho lao, sốt, bệnh lý tiểu đường, táo bón, thổ huyết, chảy máu cam. Các nghiên cứu trước đây về thành phần hoá học đã chỉ ra rằng cây này có chứa các hợp chất homoisoflavonoid, steroid saponin và polysaccharide. Đây là những thành phần có nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý như kháng viêm, chống oxi hóa, gây độc tế bào, phòng và ngăn ngừa bệnh tiểu đường Vì vậy đề tài “Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của rễ củ cây Mạch môn (Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl.)” được thực hiện nhằm 2 mục tiêu phát hiện được các hoạt chất có tiềm năng từ cây Mạch môn góp phần làm rõ hơn những công dụng chữa bệnh trong y học cổ truyền đồng thời làm tăng giá trị khoa học của cây này ở Việt Nam. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án  Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất sạch từ rễ củ cây Mạch môn;  Đánh giá tác dụng gây độc tế bào và hoạt tính kháng viêm dựa trên ảnh hưởng ức chế sự sản sinh NO của các hợp chất phân lập được. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án  Phân lập các hợp chất từ rễ củ cây Mạch môn bằng các phương pháp sắc ký kết hợp. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp vật lý, hóa học;  Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được; Chƣơng 1. TỔNG QUAN Những nghiên cứu trên thế giới và trong nước về hóa học và hoạt tính sinh học của cây Mạch môn (O. japonicus). Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mẫu thực vật Mẫu thực vật được PGS.TS. Trần Huy Thái (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học, tiêu bản lưu tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật và Viện Hóa sinh biển. 3 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất Việc phân lập, tinh chế các phần dịch chiết của cây được thực hiện bằng các phương pháp: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC), sắc ký cột thường (CC) silica gel với các cỡ hạt khác nhau, sắc ký cột pha đảo YMC RP-C18 và ray phân tử Sephadex LH-20. 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học Cấu trúc của hợp chất được xác định bằng sự kết hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại: điểm nóng chảy (Mp), độ quay cực ([α]D), phổ hồng ngoại (FT IR), phổ lưỡng sắc tròn (CD), phổ khối phun mù điện tử (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR ESI MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân: phổ một chiều ( 1 H NMR, 13 C NMR và DEPT) và phổ 2 chiều (COSY, HSQC, HMBC và NOESY/ROESY). 2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học  Hoạt tính gây độc trên 4 dòng tế bào ung thư người: tế bào ung thư phổi kháng thuốc (A549), ung thư phổi người (LU-1), ung thư biểu mô người (KB) và ung thư da người (SK-Mel-2).  Hoạt tính tính ức chế sản sinh NO trên tế bào đại thực bào RAW264.7 kích thích bởi LPS. 4 2.3. Phân lập các hợp chất từ rễ củ cây Mạch môn Ophiopogon japonicus Bột khô rễ củ mạch môn O. japonicus (2.4kg) Ngâm với MeOH (5L×3 lần) Cất loại dung môi Cặn MeOH tổng (360 g) Chiết với CHCl3 (3L×3 lần) OJC1.2 Cặn CHCl3 (8,6g) OJW Dịch nước Diaion HP-20 CC, Nước/Methanol (100:0-0:100) OJW 1.3 OJW 1.5 OJW 1.4 100:0 75:25 0:100 Hình 3. Sơ đồ chiết phân đoạn rễ củ Mạch môn OJC21.7 (264,9 mg) YMC RP-18 CC, Acetone:nước (1.5:1) Cặn CHCl3 OJC1.2 (8,6 g) Silica gel CC, n-Hexane:EtOAc (100:0-0:100) OJC17.1 (2,46 g) OJC17.3 (986 mg) OJC17.4 OJC17.5 OJC17.9 Silica gel CC, n-Hexane:EtOAc (20:1) Hợp chất OJ-5 (69,5 mg) OJC21.1 OJC21.4 (116,4 mg) OJC21.9 (50,5 mg) YMC RP-18 CC, Acetone:nước (2:1) Hợp chất OJ-4 (18,2 mg) Silica gel CC, n-Hexane:acetone (8:1) Hợp chất OJ-2 (20,8 mg) c Hình 4. Sơ đồ phân lập các hợp chất OJ-2, OJ-4 và OJ-5 từ cặn chloroform 5 YMC RP-18 CC, Acetone:Nước (1.5:1) OJC 17.3 (986 mg) Silica gel CC, n-Hexane:EtOAc (9:1) OJC19.1 (351,9 mg) OJC19.2 (60 mg) OJC19.3 (197 mg) OJC19.4 YMC RP-18 CC, Acetone:Nước (1:1) Hợp chất OJ-7 (125.7 mg) OJC20.1 (70,9 mg) OJC20.2 (162,3 mg) YMC RP-18 CC, Acetone:Nước (2:1) Hợp chất OJ-9 (46.3 mg) YMC RP-18 CC, Acetone:Nước (1:1) Silica gel CC, n-Hexane:acetone (7:1) Hợp chất OJ-6 (40.4 mg) Hợp chất OJ-8 (31.5 mg) Kết tinh, Rửa tủa bằng n- Hexane:CH2Cl2 (3:1) Hình 5. Sơ đồ phân lập từ hợp chất OJ-6 đến OJ-9 từ phân đoạn OJC17.3 OJW1.5 (11,8 g) Silica gel CC, CHCl3:MeOH (100:0-0:100) OJW2.1 (200 mg) OJW2.4 (455 mg) OJW2.5 (585 mg) OJW2.6 (3,6 g) OJW2.9 c 1. Silica gel CC, n-Hexane:EtOAc (12:1) 2. Silica gel CC, n-Hexane:CH2Cl2:Acetone (15:1:0.1) Hợp chất OJ-1 (30,1 mg) Silica gel CC, CH2Cl2:MeOH(10:1 ) OJW9.1 OJW9.2 (1,39 g) OJW9.3 (868 mg) 1. Sephadex LH-20 CC, Methanol:Nước (1:1) 2. YMC RP-18 CC, Methanol:Nước (1:2) Hợp chất OJ-12 (45,7 mg) Sephadex LH-20 CC, Methanol:Nước (1:1) Hợp chất OJ-15 (365,7 mg) Hình 6. Sơ đồ phân lập hợp chất OJ-1, OJ-12 và OJ-15 từ phân đoạn OJW1.5 6 OJW2.4 (455 mg) YMC RP-18 CC, MeOH:Nước (1:1) OJW 4.1 OJW4.2 (49,3 mg) OJW 4.3 OJW 4.4 (152,5 mg) Silica gel CC, CH2Cl2:Acetone (10:1 và 6:1) Hợp chất OJ-3 (20 mg) Sephadex LH-20 CC, Methanol:Nước (1:1) Hợp chất OJ-11 (15,5 mg) Hợp chất OJ-10 (35,5 mg) Hình 7. Sơ đồ phân lập các hợp chất OJ-3, OJ-10 và OJ-11 từ phân đoạn OJW2.4 OJW2.5 (585 mg) YMC RP-18 CC, Methanol : Nước (1:1) OJW12.1 OJW12.4 (40 mg) OJW12.5 OJW12.6 (26,6 mg) Sephadex LH-20 CC, Methanol:Nước (1.5:1) Hợp chất OJ-13 (13,9 mg) Silica gel CC, CH2Cl2:Methanol (20:1) Hợp chất OJ-14 (10,1 mg) Hình 8. Sơ đồ phân lập các hợp chất OJ-13 và OJ-14 từ phân đoạn OJW2.5 7 2.4. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất Phần này trình bày thông số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ O. japonicus. 2.5. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất phân lập đƣợc 2.5.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất Bảng 14. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất trên các dòng tế bào ung thư người (IC50, μM) Hợp chất LU-1 KB SK-Mel-2 A549 OJ-1 10,90 8,86 14,01 - OJ-2 >30 >30 >30 - OJ-3 >30 >30 29,00 - OJ-4 >30 >30 >30 - OJ-5 >30 >30 >30 - OJ-6 0,66 0,51 0,66 6,26 OJ-7 17,14 >30 28,29 - OJ-8 27,66 >30 >30 - OJ-9 >30 >30 >30 - OJ-10 >30 >30 20,38 - OJ-11 >30 >30 >30 - OJ-12 >30 >30 >30 - OJ-13 >30 >30 >30 - OJ-14 >30 >30 >30 - OJ-15 >30 28,84 24,29 - Ellipticine 0,43 0,51 0,27 - Camptothecin - - - 12,4 Ellipticine và camptothecin: các đối chứng dương sử dụng trong thực nghiệm. 2.5.2. Tác dụng tính ức chế sản sinh NO Bảng 15. Tác dụng tính ức chế sản sinh NO (IC50, μM) Hợp chất OJ-1 OJ-2 OJ-3 OJ-4 OJ-5 OJ-6 OJ-7 OJ-8 IC50 (μM) 11,4 29,1 >30 >30 >30 22,5 19,3 >30 Hợp chất OJ-9 OJ-10 OJ-11 OJ-12 OJ-13 OJ-14 OJ-15 Card.* IC50 (μM) >30 >30 >30 >30 >30 >30 >30 2,80 * Cardamonin: đối chứng dương 8 Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. Các hợp chất phân lập đƣợc từ rễ củ Mạch môn Hình 9. Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ rễ củ Mạch môn 9 3.1.1. Hợp chất OJ-1:(2R)-(4-methoxybenzyl)-5,7-dimethyl-6-hydro xyl-2,3-dihydrobenzofuran (Hợp chất mới) Hình 10. Cấu trúc của hợp chất OJ-1 và các tương tác HMBC chính Hình 12. Phổ 1H NMR của hợp chất OJ-1 Hợp chất OJ-1 thu được dưới dạng bột màu vàng. Công thức phân tử của nó được xác định là C18H20O3 trên cơ sở sự xuất hiện pic ion phân tử tại m/z 283,1365 [M – H]‒ (tính toán lý thuyết cho công thức C18H19O3, 283,1334) trên phổ khối lượng phân giải cao HR- ESI-MS .Trên phổ 1H NMR của hợp chất OJ-1 xuất hiện tín hiệu đặc trưng của vòng thơm dạng A2B2 [δH 7,19 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2' và 6') và 6,86 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3' và 5')], một tín hiệu singlet của proton thơm [δH 6,67 (1H, s, H-4)], một proton của nhóm methin liên kết với oxy [δH 4,86 (1H, m, H-2)], một nhóm methoxy [δH 4,86 (1H, m, H-2)], hai nhóm methylen [δH 3,07 (1H, dd, J = 8,5, 15,0 Hz, H- 10 3a), 2,82 (1H, dd, J = 7,5, 15,0 Hz, H-3b), 3,02 (1H, dd, J = 7,0, 14,0 Hz, H-7'a), 2,84 (1H, dd, J = 6,5, 14,0 Hz, H-7'b)] và hai nhóm methyl thế trên vòng thơm [δH 2,12 (3H, s, CH3-5) và 2,05 (3H, s, CH3-7)]. Hình 13. Phổ 13C NMR của hợp chất OJ-1 Phân tích dữ liệu phổ 13C NMR kết hợp với phổ DEPT nhận thấy có sự xuất hiện của 18 tín hiệu cacbon, bao gồm 2 methyl cacbon [δC 9,15 (C-5) và 16,4 (C-7)], 2 methylen [δC 35,5 (C-3) và 42,0 (C-7')], một methoxy [δC 55,6 (4'-OCH3)], một methin gắn oxy [δC 85,1 (C-2)], 5 methin của vòng thơm [δC 123,9 (C-4), 131,4 (C-2' và 6'), và 114,7 (C-3' và 5')], 3 cacbon của vòng thơm liên kết với oxy [δC 153,8 (C-6), 158,0 (C-7a) và 159,7 (C-4')] và 4 cacbon không liên kết với hydro [δC 118,0 (C-3a), 117,3 (C-5), 108,1 (C-7) và 131,2 (C-1')]. Những dữ liệu phổ ở trên gợi ý cấu trúc của hợp chất OJ-1 là một hợp chất mới có khung 2-benzyl-2,3- dihydrobenzofuran [1,2]. 11 Bảng 3. Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD, δ ppm) của OJ-1 Vị trí TLTK [2] δC a δH b , dạng pic (J = Hz) 2 85,3 85,1 4,86, m 3 34,4 35,8 3,07, dd (8,5, 15,0); 2,82, dd (7,5, 15,0) 3a 118,4 118,0 - 4 121,3 123,9 6,67, s 5 118,4 117,3 - 6 152,2 153,8 - 7 104,4 108,1 - 7a 158,4 158,0 - 1' 130,4 131,2 - 2' 129,3 131,4 7,19, d (8,5) 3' 113,9 114,7 6,86, d (8,5) 4' 158,4 159,7 - 5' 113,9 114,7 6,86, d (8,5) 6' 129,3 131,4 7,19, d (8,5) 7' 40,9 42,0 3,02, dd (7,0, 14,0); 2,84, dd (6,5, 14,0) 5-Me - 16,4 2,12, s 6-Me 56,4 (OMe) - 7-Me 60,5 (OMe) 9,15 2,05, s 4'-OMe 55,1 55,6 3,78, s a 125 MHz, b 500 MHz. Tham khảo hợp chất 6,7-dimethoxy-2-(4-methoxylbenzyl)-2,3- dihydrobenzofuran theo tài liệu [2]. Cấu trúc của hợp chất OJ-1 đã được xác nhận dựa trên phân tích dữ liệu phổ hai chiều. Trên phổ tương tác xa HMBC nhận thấy có sự tương tác của proton thơm H-4 với cacbon C-3, C-3a, C-5, C- 6, và C-7a; từ proton của nhóm methyl CH3-5 với cacbon C-4, C-5, và C-6; và từ proton của nhóm methyl CH3-7 với cacbon C-6, C-7 và C-7a. Những tương tác này đã khẳng định cho sự có mặt của khung dihydrobenzofuran với nhóm thế hydroxyl tại vị trí C-6 và hai nhóm methyl tại vị trí C-5 và C-7. Vị trí của nhóm methoxy đã được xác định tại vị trí C-4' trên cơ sở tương tác HMBC giữa proton của nhóm 12 methoxy và cacbon C-4'. Bằng cách phân tích chi tiết các tương tác nhận được trên phổ HMBC cho phép khâu nối các mảnh cấu trúc lại với nhau và xác định được toàn bộ cấu trúc phẳng của hợp chất OJ-1 như đã được mô tả trong hình. Tính toán 2R Thực nghiệm Hình 17. Phổ ECD của hợp chất OJ-1 Cấu hình tuyệt đối tại vị trí C-2 của OJ-1 được xác định dựa vào phương pháp tính toán lượng tử hóa học điện tử lưỡng sắc tròn (ECD - Electronic Circular Dichroism) dựa trên sự phụ thuộc giữa thời gian và mật độ lý thuyết [3]. Trên phổ ECD của hợp chất OJ-1 xuất hiện hiệu ứng cotton dương tại 224 nm cho cấu hình 2R ở vị trí C-2, phù hợp với mô hình tính toán. Trên cơ sở phân tích dữ liệu phổ, hợp chất mới OJ-1 được xác định là (2R)-(4-methoxybenzyl)- 5,7-dimethyl-6-hydroxyl-2,3-dihydrobenzofuran. 3.1.2. Hợp chất OJ-7: Homoisopogon B Hình 55. Cấu trúc của hợp chất OJ-7 và các tương tác HMBC chính 13 Hình 57. Phổ 1H NMR của hợp chất OJ-7 Hợp chất OJ-7 đã được phân lập dưới dạng bột màu vàng. Công thức phân tử được xác định là C19H22O4 trên cở sở dữ liệu phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS (m/z 315,1602 [M + H]+, tính toán lý thuyết cho công thức C19H23O4, 315,1596). Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H NMR thể hiện những đặc trưng hấp thụ tại δH 4,06 (1H, dd, J = 2,0, 11,0 Hz) và 3,83 (1H, dd, J = 6,0, 11,0 Hz) gắn cho proton H-2, δH 2,25 (1H, m) của proton H-3; δH 2,80 (1H, dd, J = 5,5, 16,0 Hz) và 2,44 (1H, dd, J = 6,5, 16,0 Hz) của proton H-4; δH 2,64 (1H, dd, J = 9,0, 14,0 Hz) và 2,52 (1H, dd, J = 6,5, 14,0 Hz) được gắn cho proton H-9. Thêm vào đó, trên phổ 1H NMR cũng xuất hiện những tín hiệu tại δH 6,38 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-3'), 6,40 (1H, d, J = 2,5, 8,0 Hz, H-5'), và 6,98 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-6') gợi ý cho sự có mặt của nhóm thế 1,2,4 trên vòng thơm B. Hai tín hiệu singlet của proton thơm tại δH 6,76 (1H, s, H-5) và 6,34 (1H, s, H-8) đã được phát hiện, gợi ý cho sự có mặt của 4 nhóm thế trên vòng A. Từ phổ 13C NMR và DEPT, mười chín tín hiệu cacbon đã được ghi nhận bao gồm: một nhóm methyl [δC 15,3 (6-CH3)], 2 nhóm methoxy [δC 55,2 (7-OCH3) và 55,3 (4'-OCH3)], 3 nhóm 14 methylen [δC 69,2 (C-2), 30,2 (C-4) và 31,0 (C-9)], một nhóm methin δC 33,2 (C-3), 5 methin của vòng thơm [δC 131,4 (C-5), 98,9 (C-8), 102,0 (C-3'), 106,1 (C-5'), và 131,5 (C-6')] và 7 cacbon thơm không liên kết với hydro [δC 112,4 (C-4a), 119,1 (C-6), 156,7 (C-7), 152,7 (C-8a), 118,0 (C-1'), 155,0 (C-2') và 159,3 (C-4')]. Những dữ liệu trên đã gợi ý rằng hợp chất OJ-7 là một homoisoflavane [5]. Hình 58. Phổ 13C NMR của hợp chất OJ-7 Trên phổ hai chiều tương tác xa HMBC đã thu được tín hiệu tương tác giữa proton của nhóm methyl tại δH 2,10 (3H, s) với C-5 (δC 131,4), C-6 (δC 119,1) và C-7 (δC 156,7), và tín hiệu từ proton của nhóm methoxy tại δH 3,74 đến C-7 và từ δH 3,73 tới C-4' (δC 159,3). Các kết quả này đã xác định vị trí của nhóm methyl và methoxy trên khung homoisoflavane tại C-6, C-7 và C-4', tương ứng. Cấu hình tuyệt đối tại C-3 cũng được xác định là R trên cơ sở hiệu ứng cotton âm tại bước sóng 230 nm và hiệu ứng cotton dương tại bước sóng 285 nm trên phân tích phổ CD và so sánh với tài liệu tham khảo trước đó công bố cấu hình tuyệt đối cho hợp chất (3R)-6,4'- dihydroxy-8-methoxyhomoisoflavan ([θ]282 +1080 và [θ]217 -2072) 15 [5]. Theo đó, cấu trúc hợp chất mới OJ-7 đã được xác định là (3R)- 4',7-dimethoxy-2'-hydroxy-6-methylhomoisoflavane và là một hợp chất mới được gọi tên homoisopogon B. Bảng 9. Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CDCl3, δ ppm) của OJ-7 Vị trí TLTK [4] δC a δH b dạng pic (J = Hz) 2 69,9 69,2 4,06, dd (2,0, 11,0) 3,83, dd (6,0, 11,0) 3 34,1 33,2 2,25, m 4 30,3 30,2 2,80, dd (5,5, 16,0) 2,44, dd (6,5, 16,0) 4a 113,8 112,4 - 5 130,5 131,4 6,76, s 6 107,8 119,1 - 7 155,3 156,7 - 8 103,0 98,9 6,34, s 8a 154,7 152,7 - 9 37,3 31,0 2,64, dd (9,0, 14,0) 2,52, dd (6,5, 14,0) 1' 132,6 118,0 - 2' 115,1 155,0 - 3' 145,0 102,0 6,38, d (2,5) 4' 145,5 159,3 - 5' 116,6 106,1 6,40, dd (2,5, 8,0) 6' 120,4 131,5 6,98, d (8,0) 6-CH3 - 15,3 2,10, s 7-OCH3 55,2 3,74, s 4'-OCH3 56,0 55,3 3,73, s a125 MHz, b500 MHz. Tham khảo hợp chất 7-hydroxy-3-(3-hydroxy-4- methoxybenzyl)chroman theo tài liệu [4]. 16 3.2. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập đƣợc 3.2.1 Hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư Kết quả theo bảng cho thấy đối với dòng tế bào LU-1 có 4 hợp chất thử nghiệm mang hoạt tính tốt là OJ-1, OJ-6, OJ-7 và OJ- 8, trong đó OJ-6 thể hiện hoạt tính mạnh nhất với giá trị IC50 = 0,66 µM. Trong khi đó ở dòng tế bào ung thư biểu mô KB có 3 chất thể hiện hoạt tính tốt là OJ-1, OJ-6 và OJ-15, trong đó OJ-1 có hoạt tính mạnh nhất với giá trị IC50 = 0,51 µM. 6 hợp chất gồm OJ-1, OJ- 3, OJ-6, OJ-7, OJ-10 và OJ-15 lại có tác dụng gây độc tế bào ung thư da (SK-Mel-2). Điều đáng chú ý là hợp chất homoisopogon A (OJ-6) có tác dụng rất mạnh trên cả 3 dòng tế bào thử nghiệm với giá trị IC50 rất thấp trong khoảng 0,51 đến 0,66 µM. Đây là hợp chất có khung homoisoflavanone khá phổ biến trong chi Ophiopogon và được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học đáng quan tâm. Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên tác dụng gây độc tế bào ung thư của hợp chất thuộc nhóm này ở nồng độ thấp được công bố. Trong nhóm chất homoisoflavane một hợp chất thể hiện hoạt tính ức chế trung bình trên cả ba dòng tế bào ung thư là homoisopogon B (OJ-7) với giá trị IC50 từ 17,14 đến 32,94 µM. Trong khi đó, homoisopogon C (OJ-8) ức chế tế bào LU-1 với giá trị IC50 = 27,66 µM. Mối liên quan giữa cấu trúc và tác dụng gây độc tế bào của các homoisoflavonoid đã được nghiên cứu và công bố. Theo đó, nhóm 4'-methoxy được xem là nhóm quyết định, có ảnh hưởng đến tác dụng độc tế bào của lớp chất này. Trong nghiên cứu này, các homoisoflavonoid có nhóm thế methoxy ở C-4' đã thể hiện hoạt tính mạnh trên ít nhất một dòng tế bào ung thư. Trong khi đó, hợp chất homoisopogon D (OJ-9) với sự 17 có mặt của nhóm methylenedioxy ở C-3'/C-4' không thể hiện hoạt tính ở cả ba dòng tế bào ung thư được nghiên cứu. Trong số các hợp chất benzofuran thử nghiệm, chỉ duy nhất OJ-1 có tác dụng gây độc tế bào. Hợp chất này có cấu hình tuyệt đối ở C-2 được xác định là R, trong khi đó các chất còn lại ở dạng racemic hoặc thêm nối đôi đều không có hoạt tính. Điều này gợi ý vai trò quan trọng của cấu hình 2R trong khung 2-benzylbenzofuran. Hình 115. Tác dụng gây chết theo chương trình OJ-6 trên dòng tế bào A549 Do hợp chất homoisopogon A (OJ-6) có tác dụng gây độc tế bào ung thư rất mạnh trong đó có dòng ung thư phổi (LU-1), hợp chất này được tiếp tục thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư phổi kháng thuốc (A549). Kết quả cho thấy hợp chất này ức chế mạnh sự phát triển của tế bào A549 (IC50 = 6,27 μM) so với thuốc chữa ung thư camptothecin (IC50 = 12,4 μM). Tiếp đến, hợp chất này được đánh giá sâu hơn về tác dụng diệt tế bào ung thư A549 theo cơ chế % a p o p to ti c ce ll s 18 gây chết theo chương trình (apoptosis) bằng phương pháp trắc lưu tế bào. Kết quả trên Hình 115 cho thấy sau 24 giờ ủ với OJ-6 ở nồng độ 25 μM, tỷ lệ tế b