Nghiên cứu thay thế chủng nakayama bằng chủng Beijing - 1 trong sản xuất vắc xin viêm não Nhật Bản

viÖn vÖ sinh dÞch tÔ trung −¬ng c«ng ty v¾c xin vµ sinh phÈm sè 1 b¸o c¸o tæng kÕt ®Ò tµi KHCN cÊp Nhµ n−íc nghiªn cøu thay thÕ chñng nakayama b»ng chñng Beijing-1 trong s¶n xuÊt v¾c xin viªm n∙o NhËt b¶n M∙ sè ch−¬ng tr×nh : kc.10.22 chñ nhiÖm ®Ò tµi: GS.TS Huúnh ph−¬ng liªn 5983 23/8/2006 Hµ néi – 2006 1 CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1. Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm não Nhật Bản - Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) lần đầu tiên được ghi nhận năm 1871, với các triệu chứng viêm não ở ngựa và ở người. Năm 1873, bệnh xuất hiện rải rác ở nhiều vùng tại Nhật Bản. Năm 1924, một vụ dịch lớn xảy ra tại Nhật Bản với 6000 người mắc và có đến 60% trong số này tử vong [62]. - Năm 1934, Hayashi đã gây bệnh thực nghiệm trên khỉ bằng cách lấy não người tử vong do mắc viêm não tiêm vào não khỉ và sau thời gian ủ bệnh từ 10-14 ngày, thấy xuất hiện các triệu chứng viêm não [57, 115]. - Năm 1935, lần đầu tiên phân lập được virut VNNB từ não một trẻ em bị chết do viêm não tại Tokyo (Nật Bản), chủng được đặt tên là Nakayama [24, 183]. - Năm 1937, phân lập được virut gây viêm não ở ngựa, về sau virut này được xếp vào chủng viêm não ngựa miền Tây. - Năm 1938, Mitamura đã phân lập được virut VNNB từ muỗi Culex tritaeniorhynchus, mặc dù từ những năm 1930 người ta đã nghi ngờ sự lây truyền của bệnh là do muỗi truyền [183]. - Năm 1936-1938, Mitamura và Takanouchi đã nghiên cứu sản xuất thử văcxin viêm não từ não chuột, dù bước đầu nhưng là rất sớm sau khi đã phân lập được virut VNNB [16]. Công nghệ này 40 năm sau mới được hoàn thiện. Văcxin bất hoạt tinh khiết, an toàn cao và hiện đang có mặt trên thị trường quốc tế, đó là văcxin của hãng Biken theo phương pháp hóa lý của Takaku Nhật Bản [111]. - Năm 1959, Buecher và Scherer đã nghiên cứu về sinh thái học bệnh VNNB ở Nhật Bản và đã chứng minh chim và lợn là những vật chủ chính bị nhiễm virut huyết và nhờ có muỗi là vectơ hút máu các động vật nhiễm truyền virut sang cho người. Từ đó bệnh VNNB được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu [21]. 2. Phân loại virut VNNB Virut VNNB là một thành viên của virut Arbo (arthropod borne viruses). Là những virut do côn trùng tiết túc truyền cho động vật có xương sống qua đường máu. Tất cả các virut arbo đều có hệ gen (genome) là ARN, hầu hết chúng đều có vỏ lipit và bị bất hoạt bởi ether hoặc sodium deoxycholate [20, 24]. Việc đặt tên cho các virut arbo đôi khi dựa vào bệnh như sốt Dengue, số vàng (yellow fever) hoặc theo vùng địa lý mà ở đó lần 2 đầu tiên phân lập được virut như viêm não Nhật Bản (Japanese encephalitis), St. Louis encephalitis, West Nile fever... Có trên 350 loài trong nhóm virut arbo, trong đó arbo gây bệnh cho người có trên 75 thành viên, được sắp xếp theo mối quan hệ kháng nguyên. Một số tác giả nghiên cứu để xếp loại theo các đặc tính địa lý. Nhiều virut arbo được xếp vào họ Togaviridae, Bunyaviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae... Họ Togaviridae được chia thành 2 chi (genus) là Alphavirus thuộc nhóm A trong đó điển hình là các loài Aura; Babanki; Barmah Forest; Eastern equine encephalitis; Everglades; Western equine encephalitis; Whataroa. Họ Flaviviridae thuộc nhóm B bao gồm: Japanese encephalitis (VNNB); Dengue; Yellow fever; West Nile fever; Brazilian encephalitis… Hình 1: Mô hình so sánh các virut trong nhóm Flavivirus dựa vào trình tự axit amin của protein vùng vỏ (E-protein), sử dụng phần mềm Beckman Microgenie Software package, Version 4.0 [101]. (DEN: Dengue; WN: West Nile; KVN: Kunjin; MVE: Murray Valley encephalitis; JE: Japanese encephalitis; SLE: St. Louis encephalitis; YF: Yellow fever; POW: Powassan; LGT: Langat; LI: Louping ill; TBE: Tick borne encephalitis) Các tác giả phân tích trong 3 nhóm chính DEN, JE và TBE cho thấy: Phân tích huyết thanh hỗn hợp JE và DEN thì tỷ lệ giống nhau là 46-53%. DEN1 và DEN3 có quan hệ gần nhất (77% tương đồng); với DEN2 là 69% và DEN4 là 62%. JE và TBE có tỷ lệ nucleotit cùng loại 72-77%, còn axit amin của protein E cùng loại là 40-44% [101]. 93 82 77-78 72-74 CEE RSSE 96 46-53 40-44 77-78 85-89 91-94 40 50 60 70 80 90 100 E -P ro te in A m in o A ci d H om ol og y (% ) JE WN KUN MVE JE SLE YF TBE POW LGT LI TBE DEN DEN 3 1 2 4 77 69 62 3 Hội nghị 1992 tại Geneve, Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) đã xếp loại viêm não do muỗi truyền và gây tổn thương thần kinh trung ương được ký hiệu như sau: A83.0 Viêm não Nhật Bản A83.1 Viêm não ngựa miền Tây A83.2 Viêm não ngựa miền Đông A83.3 Viêm não St. Louis A83.4 Viêm não châu Úc A83.5 Viêm não California A83.6 Viêm não virut Nga A83.7 Viêm não virut do muỗi truyền khác A83.8 Viêm não virut do muỗi truyền không xác định Viêm não Nhật Bản được xếp hàng đầu trong các loại viêm não do muỗi truyền, bệnh để lại hậu quả nặng nề nên đã có văcxin phòng bệnh từ 1954, và sớm có các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm để xác định căn nguyên [31, 47, 95, 115, 120, 139, 148, 187]. 3. Đặc điểm và cấu trúc của virut VNNB Virut có hình cầu, đường kính trung bình 40-50nm, có màng lipid kép, gắn vào lớp vỏ là glycoprotein E và protein màng (M). Vật liệu di truyền là 1 sợi ARN đơn phân cực dương xoắn, được bao bọc bởi nucleocapsid. Hạt virut VNNB tinh khiết cho thấy sợi ARN chiếm 6%, protein 66%, lipid 17% và carbonhydrate chiếm 9%, cấu trúc của lớp lipid kép phụ thuộc vào tế bào chủ, nơi virut nhân lên [152, 180]. Cấu trúc phân tử của sợi ARN bao gồm 11000 nucleotid, tương ứng với 3400 axit amin. Đây chính là yếu tố gây nhiễm của virut. Hệ gen của virut VNNB mã hóa cho 10 protein gồm 3 protein cấu trúc và 7 protein không cấu trúc trong một khung đọc mở liên tục và trật tự từ đầu 5’ đến đầu 3’ và các vùng không mã hóa. Kết quả dịch mã để hình thành một polyprotein đơn được giải phóng sau sự hoạt hóa của tế bào chủ và enzym chuyển hóa tạo ra sự phân cắt của các protein [31]. 4 Trên hình 2, cho ta thấy sắp xếp thứ tự các protein trong sợi ARN: Cap 5’-C- preM-M-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’. Đầu 3’ sợi ARN của virut VNNB không chứa đuôi polyA nhưng được coi là làm khuôn mẫu cho các cấu trúc tiếp theo. Từ đầu 5’ các gen được mã hóa cho protein vỏ capsid của ARN (C); protein tiền màng (preM); hoặc protein màng (M) của virut trưởng thành và protein vỏ (E) là protein cấu trúc chiếm 1/4 chiều dài của hệ gen. Các protein không cấu trúc là phần còn lại của hệ gen [149, 181]. Vỏ (Envelope) M (Membrane) Lớp Lipit kép Nucleocapsid 5’ 7-mG 3’ Capsid preM E NS1 NS3 NS4 NS2 NS5 118 nt 51 nt Sù phiªn m· vµ ph©n c¾t protein ORF ®¬n (10233 nt) NS4A NS4B NS2BNS2A Phiªn m· trªn m¹ng l−íi néi chÊt h¹t Hình 2: Sơ đồ cấu trúc hạt virut VNNB (Flaviviruses) 5 3.1 Protein C Protein C rất nhỏ, chỉ 9-12 KDa gồm 112-127 axit amin được tạo thành rất vững chắc gồm một số lớn axit amin Lys và Arg. Các axit amin trong protein C liên kết với nhau rất chặt chẽ, có thể loại trừ khả năng trung hòa của phân tử ARN của virut với các tác nhân liên quan [106, 148]. 3.2 Protein M Protein M có 2 dạng: protein preM chưa trưởng thành trong tế bào chủ và quan sát thấy có 165 axit amin không trùng lặp với protein E. Từ đó một số tác giả nghiên cứu sử dụng protein E trong sản xuất văcxin VNNB tái tổ hợp để tổng hợp preM của virut với mục đích tạo các nếp gấp chính xác ở tại protein M và lắp ráp vào protein E của 1 flavivirus nào đó (như yellow fever). Trước khi virut được giải phóng ra ngoài tế bào, preM được phân cắt bởi một phân tử protease (furin-like) để tạo thành protein M hoàn chỉnh. PreM chưa trưởng thành không tự tiến tới tế bào đích nhưng lại rất cần thiết cho hoạt động chức năng duy trì nòi giống của virut trưởng thành [148, 170, 189]. Protein M có trong virut trưởng thành ngoài tế bào. Hạt virut trưởng thành có khả năng kháng axit kém hơn hạt virut chưa trưởng thành khoảng 400 lần khi nghiên cứu so sánh trên hạt virut chưa hoàn chỉnh, vì vậy khả năng tiếp cận với tế bào đích dễ dàng hơn. Sự ly giải preM khi ra ngoài tế bào tạo ra sự sắp xếp lại các cấu trúc oligo trên bề mặt hạt virut do đó làm tăng khả năng gây nhiễm của virut trưởng thành tới vật chủ [58, 104]. 3.3 Protein E Có trọng lượng phân tử 55-60KDa, là một glycoprotein bao gồm khoảng 494-501 axit amin là thành phần cấu tạo chính của vỏ (E). So sánh các chuỗi axit amin tương đồng cho thấy protein E là một protein cấu trúc có tính bảo tồn cao trong các virut thuộc nhóm flavivirus. Protein E có liên quan chặt chẽ đến chức năng sinh học của virut như chức năng bám dính, thụ cảm thể, ngưng kết hồng cầu, trung hòa kháng thể, điều chỉnh pH nội nguyên sinh chất của tế bào chủ [56, 59, 115, 139, 147, 149]. 3.4 Các protein không cấu trúc (NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5) - NS1: có trọng lượng phân tử 42-50KDa, là một glycoprotein gồm 353-354 axit amin. Chức năng chưa rõ, có thể như một bổ thể hòa tan cố định kháng nguyên khi bộc lộ trên tế bào cảm nhiễm, có thể NS1 như là đích của đáp ứng miễn dịch chăng? [86, 88, 148]. 6 - NS3: có trọng lượng phân tử 67-70 KDa gồm 618-623 axit amin và có tính bảo tồn cao trong chuỗi nucleotid của nhóm flavivirus, đóng vai trò mã hóa cho enzym proteaza và helicaza [31, 101, 148]. - NS5: có trọng lượng phân tử 104-106 KDa gồm 900-905 axit amin và cũng có tính bảo tồn cao trong chuỗi nuleotid. Một số nghiên cứu khác cho thấy NS5 gắn liền với sự tạo vỏ capsid của ARN. Các nghiên cứu invitro polymeraza đã thẩm định và cho thấy NS3 và NS5 được sử dụng khi ARN của virut nhân lên [148, 149, 176, 179, 181]. - NS2A-NS2B-NS4A và NS4B: đều rất nhỏ bé, có tính chất bảo tồn kém trong chuỗi nucleotid, có thể nghĩ đến sự mã hóa của chúng có liên quan đến protein M. Những năm gần đây, các nghiên cứu về sinh học phân tử của virut VNNB đã có những bước tiến đáng kể. Định loại cấu trúc 3 protein của virut VNNB là M, C và E. Protein E phân lập được từ bề mặt của hạt virut. Thử nghiệm trên động vật có vú cho thấy protein E tạo ra kháng thể trung hòa sau khi tiêm và các động vật này (chuột nhắt trắng) đã sống sót sau khi thử thách bằng chủng độc lực. Khả năng bảo vệ của protein E được thử nghiệm và phân tích bằng thử nghiệm kháng thể đơn dòng (MAb) để định loại nhiều epitop có phản ứng chéo với các flavivirus và cũng giống nhau về đặc tính sinh học [23, 24, 31]. 3.5 Tính chất hóa lý và bền vững của virut VNNB [31, 82] - Virut VNNB có tỷ trọng 1,19-1,20g/cm3 trong đường và 1,22-1,24g/m3 trong cesium chlorid. - Hệ số lắng 200S. - Trọng lượng phân tử 60-70 x 106 dalton. - Độ bền vững: với độ pH giao động từ 7-9. Thích hợp nhất là pH 8. - Virut dễ bị bất hoạt bởi nhiệt độ cao: 50oC trong 50 phút ; 37oC trong vài giờ. Nhiệt độ thấp như -80oC, -20oC virut tồn tại trong nhiều năm và trong nitơ lỏng (-196oC) virut tồn tại vĩnh cửu. - Virut VNNB rất nhạy với dung môi hòa tan như ether, sodium deoxycholate, dễ dàng bị bất hoạt bởi tia cực tím, formaldehyt... 3.6 Thành phần và quyết định kháng nguyên Theo nhiều nghiên cứu đã cho thấy kháng nguyên của flavivirus có phản ứng chéo với nhau, 3 nhóm kháng nguyên quan hệ mật thiết và rất khăng khít với nhau đó là sốt Tây sông Nile (West Nile fever), viêm não Louis (Louis encephalitis) và viêm não Nhật Bản (Japanese encephalitis) [29, 140]. Bằng các phản ứng huyết thanh với kháng thể đa dòng rất khó phân biệt. Riêng phản ứng trung hòa (NT) là nhạy nhất tiếp đến là phản ứng 7 kết hợp bổ thể (CF), rồi miễn dịch huỳnh quang (IF). Vậy đánh giá đáp ứng miến dịch sau khi tiêm văcxin bằng ký thuật trung hòa là đặc hiệu nhất, đặc biệt là trung hòa giảm 50% đám hoại tử (PRNT) trên tế bào [126, 127]. Hoặc dùng kháng thể đơn dòng để định loại flavivirus và phân biệt với virut VNNB [59, 68, 74, 102, 104, 123, 126, 127, 128, 139, 151]. Những năm cuối thập kỷ 90, công nghệ sinh học phân tử phát triển không ngừng và chỉ cần sử dụng kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR), với cặp mồi (primer) đặc hiệu thì rất nhanh chóng định loại được typ virut trong các flavivirus [118, 133]. Hoặc xa hơn còn phân tích được đặc tính di truyền của các virut VNNB lưu hành ở các vùng khác nhau bằng phương pháp phân tích trình tự gen (sequencing), so sánh trình tự các nucleotid của các chủng virut VNNB khác nhau [134, 185]... Ngày nay, nhờ công nghệ này mà nhiều nhà khoa học đã cố gắng chế tạo các văcxin tái tổ hợp ADN nhằm cải thiện một bước công nghệ gen trong việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng [65]. 3.7 Khả năng bảo vệ của kháng nguyên Kháng nguyên tạo ra kháng thể tương ứng, nhưng không phải tất cả các kháng nguyên đều liên quan đến việc gây bệnh và sinh miễn dịch. Thường có 1-2 kháng nguyên quyết định tính sinh miễn dịch và cũng là kháng nguyên bị kháng thể trung hòa nếu xâm nhập vào cơ thể đã được miễn dịch. Kháng nguyên này nằm ngay trên bề mặt của hạt virut. Đó là kháng nguyên chịu trách nhiệm tiếp xúc đầu tiên trên tế bào chủ. Với hạt virut VNNB thì kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA) và hoạt tính trung hòa là glycoprotein trên preM và E (vỏ và tiền màng của virut), cũng chính 2 thành phần glycoprotein này sinh kháng thể ƯCNKHC (HI) và kết hợp bổ thể (CF), kháng thể trung hòa (NT) [31, 96, 111, 151]. Để chứng minh đều này khi Kitano và Suzuki đã tách chiết ngưng kết tố hồng cầu trên bề mặt hạt virut VNNB rồi gây miễn dịch cho chuột nhắt trắng. Kết quả là kháng thể trung hòa ở chuột được gây miễn dịch với hạt virut VNNB nguyên vẹn và bằng kháng nguyên HA đều có hiệu giá như nhau. Từ đó hai tác giả kết luận yếu tố ngưng kết hồng cầu (HA) là kháng nguyên kích thích tạo ra kháng thể trung hòa [82]. 4. Sự nhân lên của virut trên tế bào 4.1 Chu kỳ nhân lên của virut ARN Khi virut gặp tế bào cảm thụ và nhận biết các thụ thể trên màng tế bào, tiến đến và bám vào thụ thể, màng tế bào bị tác động và tạo khe hở cho virut thâm nhập vào bên trong tế bào gây cảm ứng tổng hợp ARN [35, 115, 148]. Sau đó sợi ARN được bộc lộ là ARN đơn-polymeraza để tạo thành ARN phân cực (-) bổ sung thành chuỗi ARN kép nhờ phiên mã sớm và thông tin trung gian sao chép sợi ARN kép được làm khuôn để tổng 8 hợp các sợi ARN mới theo cách bán bảo tồn và không đối xứng. Khung đọc mở được đồng dịch mã bằng cách cắt đoạn protein liên tiếp thành các đoạn protein cấu trúc và không cấu trúc [172]. ARN và protein của virut được tổng hợp trên lưới nội chất có hạt, vùng quanh nhân trong nguyên sinh chất của tế bào chủ. Sự nhân lên của virut liên quan đến phát triển của lưới nội chất tạo thành các nội bào đặc trưng. Các sản phẩm tổng hợp được lắp ráp ở màng tế bào chất. Sau đó các hạt virion được giải phóng qua bộ máy Golgi bằng ngoại bào xuất tiết và các virut mới tiếp tục xâm nhập vào tế bào khác và bắt đầu một chu kỳ mới [52, 53, 54]. 4.2 Sự nhân lên của virut trong tế bào Hình 3 : Sơ đồ nhân lên của flaviviruses [148] Virut VNNB nhân lên trên nhiều loại tế bào cả ở trên tế bào tiên phát và tế bào thường trực, chúng có nguồn gốc từ người, khỉ, gặm nhấm, lợn, chim, gia cầm và muỗi [23, 24, 45]. Tế bào thận bào thai người, thận khỉ, thận lợn, tế bào phôi gà... các dòng tế bào thường trực như GMK2, Vero (thận khỉ), BHK21 (thận chuột đất vàng), C6/36 (tế bào muỗi Albobitus). Virut nhân lên gây hủy hoại tế bào (CPE) nhưng cũng có một số 7. Sự hình thành virion trong NSC 1. Gắn kết thụ thể 2. Thụ thể của tế bào 3. Dung hợp màng tế bào ở pH thấp 4. Cởi áo (bộc lộ sợi ARN) 5. Dịch mã thành chuỗi polyprotein 6. Sao chép ARN 8. Lắp ráp và hoàn thiện 9. Phóng thích các hạt virut 9 loại tế bào quan sát dưới kính hiển vi quang học, không thấy hiện tượng CPE [119]. Hiệu giá virut đạt được tùy thuộc vào tế bào chủ, loại cảm ứng và thích hợp virut nhân lên tốc độ nhanh, thời gian tạo CPE nhanh sau 1-2 ngày gây nhiễm (Tế bào C6/36, Vero và BHK21) [117]. Hình ảnh tế bào tổn thương quan sát trên kính hiển vi quang học cho thấy: tế bào phình to, các tiểu thể hạt xuất hiện ở lưới nội chất làm rối loạn chức năng phân chia tế bào, vỏ màng nội bào tạo thành các không bào căng phồng và các tiểu thể trong nhân bị méo mó. Tăng sinh tiểu thể Lysosom và làm loãng nguyên sinh chất của tế bào. Hoạt tính enzym lysosom tăng lên trong tổ chức tế bào nhiễm [132]. 5. Sinh bệnh học Virut VNNB có cấu trúc kháng nguyên giống như các flavivirus khác, bao gồm virut viêm não St. Louis, virut West Nile... vì vậy, chúng có phản ứng chéo với các epitop trung hòa với virut VNNB trên kháng nguyên bề mặt E. Một số phân typ của kháng nguyên đã được nghiên cứu, mặc dù vậy cho đến nay nghiên cứu sự khác nhau giữa các phân typ về độc tính thần kinh, vật chủ vẫn còn nghèo nàn. Vẫn các giả thiết, muỗi đốt qua da rồi virut nhân lên tại chỗ sau đó tiến đến các hạch lympho vùng. Virut tấn công đến hệ thần kinh trung ương và chắc chắn sẽ đến hệ tuần hoàn... tổn thương tế bào thần kinh trung ương rồi hủy hoại hệ thần kinh trung ương [92]. Virut nhân lên và khu trú ở não, vùng chất xám, vùng đồi thị, tiểu não và có mặt trong nước não tủy [40, 74, 75, 76]. Chẩn đoán căn nguyên VNNB chủ yếu dựa vào huyết thanh học [61, 80]. Sử dụng bộ sinh phẩm MAC-ELISA để phát hiện sớm IgM đặc hiệu kháng virut VNNB trong nước não tủy hoặc trong máu bệnh nhân trong vòng 4-7 ngày sau khởi bệnh [8, 22, 25, 26, 48, 71, 194]. Những phương pháp chẩn đoán khác như dot-blot hoặc kỹ thuật tủa miễn dịch (immuniprecipitation IgM assay) phát hiện IgM [167]. Có thể phân lập virut từ máu bệnh nhân trong giai đoạn sớm, từ dịch não tủy hoặc từ não tử thi. Kỹ thuật PCR để phát hiện hệ gen đặc hiệu của virut, đặc biệt trong dịch não tủy cũng dễ dàng phát hiện được sự có mặt của hệ gen virut VNNB [68, 93, 107, 133]. Mô hình nghiên cứu thí nghiệm trên chuột nhắt trắng là rõ ràng nhất [40]. Những nghiên cứu sâu về các thể lâm sàng và nhiễm virut thể ẩn cho thấy mức độ thể hiện lâm sàng: từ từ, đột ngột, thể nhẹ, thể nặng, thể ẩn phụ thuộc vào các yếu tố: đường gây nhiễm (dưới da, phúc mạc, não); số lượng virut xâm nhập vào cơ thể; tính độc lực của chủng virut; tuổi cảm nhiễm của vật chủ... Vật chủ là yếu tố rất quan trọng về tạo miễn dịch, sinh interferon. Sức khỏe của vật chủ ảnh hưởng đến tính sinh bệnh [73]. Thử nghiệm tiêm vào não chuột liều cao thì bệnh thể hiện dồn dập, đột ngột. Nếu liều gây nhiễm qua da, lượng virut thấp nên diễn biến trước tiên virut nhân lên ở máu ngoại vi rồi 10 hướng thần kinh trung ương và sau đó gây ra Hội chứng não cấp. Tính từ khi virut nhân lên đến thời điểm sốt, đó là giai đoạn ủ bệnh. Thời gian này có thể 6-16 ngày, tùy thuộc vào các yếu tố trên. Hệ miễn dịch hoạt động trước khi xuất hiện các triệu chứng lâm sàng. Do đó, khởi bệnh sau 3-4 ngày đã có thể phát hiện kháng thể IgM và chính giai đoạn sớm này có thể phân lập được virut một cách dễ dàng từ dịch não tủy [25] . Hình 4: Quá trình xâm nhập và phát triển trong cơ thể sau nhiễm virut VNNB [121] Theo sơ đồ trên cho thấy: muỗi đốt, virut truyền qua da, nhân lên tại chỗ và tiến tới hạch lympho vùng, tuyến ức (hệ miễn dịch) rồi vào máu. Trước tiên, gây nhiễm virut huyết và các tổ chức ngoài thần kinh như cơ vân, cơ trơn, cơ tim, nội mao mạch, các tổ chức lympho, tuyến nội tiết, ngoại tiết và vào hệ tuần hoàn. Nhiễm virut huyết dao động bởi tỷ lệ di chuyển của macrophage và cuối cùng kích thích sinh kháng thể dịch thể, qúa trình này diễn biến khoảng một tuần sau khi nhiễm virut. Khi virut tiến tới hệ thần kinh trung ương, ngay lập tức gây cảm ứng thần kinh: thử nghiệm rất rõ ở chuột nhắt và khỉ, biểu hiện thương tổn chủ yếu ở vùng chất xám, đồi thị và tiểu não. Huang và Wong đã Tổ chức ngoài thần kinh - Cơ vân, cơ trơn - Tuyến tụy, thượng thận - Các tổ chức liên quan Virut truyền qua da Hạch Lympho vùng Tuyến ức Máu Huyết tương Tổ chức biểu mô Kháng thể thể dịch Nội mô mao mạch Tế bào nội mạc võng mô - Rối loạn chức năng