Phân lập và định danh một số loài aspergillus trên hạt đậu phộng ở chợ Xuân Khánh

Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng i TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGUYỄN THU MAI PHÂN LẬP VÀ ðỊNH DANH MỘT SỐ LOÀI ASPERGILLUS TRÊN HẠT ðẬU PHỘNG Ở CHỢ XUÂN KHÁNH LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã ngành: 08 Người hướng dẫn LÂM THỊ VIỆT HÀ NGUYỄN BẢO LỘC Năm 2007 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng ii Luận văn tốt nghiệp ñính kèm tên ñề tài “Phân lập và ñịnh danh một số loài Aspergillus trên hạt ñậu phộng ở chợ Xuân Khánh” do NGUYỄN THU MAI thực hiện ñã ñược thông qua hội ñồng báo cáo luận văn. Giáo viên hướng dẫn Giáo viên phản biện LÂM THỊ VIỆT HÀ NGUYỄN CÔNG HÀ NGUYỄN BẢO LỘC Cần Thơ, 28 tháng 6 năm 2007 CHỦ TỊCH HỘI ðỒNG LÝ NGUYỄN BÌNH Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng iii LỜI CẢM TẠ Em xin chân thành cảm tạ: Quý thầy cô Trường ðại Học Cần Thơ và ñặc biệt là Quý thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Thực Phẩm nói riêng ñã tận tâm giảng dạy, truyền ñạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt những năm học qua. ðặc biệt em xin thành cảm ơn cô Lâm Thị Việt Hà và thầy Nguyễn Bảo Lộc - người ñã tận tình hướng dẫn và truyền ñạt kinh nghiệm cũng như kiến thức ñể giúp em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp ngành Công Nghệ Thực Phẩm. Tập thể cán bộ phòng thí nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Thực Phẩm, tập thể lớp Công Nghệ Thực Phẩm K28 ñã giúp ñỡ và cùng trao ñổi những kiến thức trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp này. Cần Thơ, ngày 14 tháng 06 năm 2007 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thu Mai Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng iv MỤC LỤC Trang LỜI NÓI ðẦU..................................................................................................................i MỤC LỤC ................................................................................................................ ..ii DANH MỤC BẢNG................................................................................................. .iv DANH MỤC HÌNH........................................................................................................v TÓM TẮT................................................................................................................. vii CHƯƠNG I: ðẶT VẤN ðỀ ........................................................................................ i 1.1. ðẶT VẤN ðỀ .................................................................................................. 1 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU.............................................................................. 1 CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ......................................................................2 2.1. HẠT ðẬU PHỘNG.......................................................................................... 2 2.1.1. Cấu tạo hạt ñậu phộng ................................................................................ 2 2.1.2. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng hạt ñậu phộng ........................... 2 2.2. NẤM MỐC ASPERGILLUS HIỆN DIỆN TRÊN ðẬU PHỘNG...................... 6 2.2.1. ðặc tính chung của nấm mốc Aspergillus ................................................... 6 2.2.2. Cấu tạo sợi nấm và hệ sợi nấm ................................................................... 7 2.2.3. Hình thái nấm mốc ..................................................................................... 7 2.2.4. Một số loài Aspergillus............................................................................... 8 2.2.5. Aflatoxin và tác ñộng của nó ñối với sức khỏe con người........................... 9 2.2.6. Sự nhiễm ñộc aflatoxin trên ñậu phộng và biện pháp phòng tránh ............ 10 CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ......................16 3.1. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU .................................................................... 16 3.1.1. ðịa ñiểm................................................................................................... 16 3.1.2. Thời gian nghiên cứu................................................................................ 16 3.1.3. Nguyên liệu.............................................................................................. 16 3.1.4. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................... 16 3.1.5. Hóa chất ................................................................................................... 16 3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................... 17 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng v 3.3. NỘI DUNG VÀ TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM ............................................... 17 3.3.1. Phân lập nấm mốc Aspergillus.................................................................. 17 3.3.2. Tiến hành thí nghiệm................................................................................ 17 a. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy..................................................................... 17 b. Chuẩn bị mẫu ............................................................................................. 17 c. Phân lập nấm mốc....................................................................................... 17 d. ðịnh danh................................................................................................... 18 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………………… 21 4.1. Aspergillus flavus..................................................................................... 23 4.2. Aspergillus niger…………………………………………………......................25 4.3. Aspergillus oryzae………………………………………………………………..27 4.4. Aspergillus ficuum…………………………………………………………29 CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ………………………………………30 5.1. KẾT LUẬN………………………………………………………………………30 5.2. ðỀ NGHỊ………………………………………………………………………...30 TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................31 PHỤ LỤC…………………………………………………………………….............32 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng vi DANH MỤC BẢNG Trang Error! No table of contents entries found.Bảng 7: Qui trình ñịnh loại một chủng nấm mốc (ñối với nhiều chi nấm mốc)............12 Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1. Hình thái học nấm mốc..................................................................................... 10 Hình 2. Mẫu hạt ñậu phộng có nấm mốc phát triển trên môi trường nuôi cấy PGA sau 3 - 5 ngày, nhiệt ñộ 27 - 320C........................................................................................ 21 Hình 3. Aspergillus flavus với những giọt tiết có màu trắng ñục xung quanh rìa khuẩn lạc sau 4 –5 ngày nuôi cấy trên môi trường Czapek....................................................... 23 Hình 4. Aspergillus flavus có bông hình cột với những chuỗi bào tử rất dài................... 23 Hình 5. Cấu tạo hiển vi một bông với thể bình hai tầng ................................................. 23 Hình 6. Cấu tạo một bọng có hình gần cầu. ................................................................... 23 Hình 7. Các bào tử kết lại thành chuỗi rất dài ................................................................ 23 Hình 8. Bào tử của A. flavus ......................................................................................... 24 Hình 9. Cấu tạo một thể bình hai tầng với cuống ñính thể bình có hình trụ và thể bình có hình chai................................................................................................................... 24 Hình 10. Aspergillus niger sau 3 ngày và sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường Czapek, nhiệt ñộ 27 - 320C. ........................................................................................................ 26 Hình 11. Cấu tạo sợi nấm A. niger mang chức năng sinh sản có bông hình cầu toả tia... 26 Hình 12. Bông với thể bình hai tầng và bọng hình cầu. ................................................. 26 Hình 13. Cấu tạo hiển vi một thể bình hai tầng với lớp thể bình thứ nhất dài gấp ñôi thể bình thứ hai. Lớp thứ nhất có hình trụ, lớp thứ hai có hình chai ............................... 26 Hình 14. Aspergillus oryzae có màu vàng lục khi non và chuyển sang màu vàng lục nâu khi già .................................................................................................................... 28 Hình 15. Aspergillus oryzae có bông hình cầu khi non và xé rách tạo hình trụ hay những chuỗi tua rua khi già. .......................................................................................... 28 Hình 16. Cấu tạo bông lớn với thể bình hai tầng và bọng có hình cầu ........................... 28 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng vi Hình 17. Cấu tạo bông nhỏ với thể bình một tầng.......................................................... 28 Hình 18. Aspergillus ficuum có màu nâu trên môi trường Czapek sau 7 ngày tuổi…..... .28 Hình 19. Aspergillus ficuum có bông hình cầu tỏa tia rất ñều và ñặc biệt cuống khá dài..... ............................................................................................................................ 30 Hình 20. Khi già, bông xé rách tạo dạng cột. ................................................................. 30 Hình 21. Cấu tạo hiển vi một bông có bọng hình cầu và quan sát thấy rõ thể bình một lớp................................................................................................................................. 30 Hình 22. Bông ñược ñính trên cuống rất dài .................................................................. 30 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng vii TÓM TẮT ðậu phộng là một trong những loại hạt có giá trị dinh dưỡng cao và nó là mặt hàng xuất khẩu quan trọng ở nước ta, ñem lại nguồn thu ngoại tệ khá lớn. Tuy nhiên do nước ta có ñiều kiện khí hậu nhiệt ñới nóng ẩm nên rất thuận lợi cho các loài nấm mốc phát triển và gây hại. ðặc biệt trên ñậu phộng thường có loài Aspergillus xâm nhập và gây hư hỏng, chẳng những thế chúng còn tiết ra ñộc tố gây ung thư cho người khi ăn phải. Sự có mặt của các loài này phụ thuộc vào vùng ñịa lý cũng như loại thực phẩm thích hợp cho sự sinh trưởng của chúng. Phần luận văn này ñược tiến hành với mục ñích “Phân lập và ñịnh danh một số Aspergillus trên hạt ñậu phộng ở chợ Xuân Khánh - thành phố Cần Thơ”. Kết quả sau khi phân lập và tiến hành ñịnh danh ñược bốn loài Aspergillus sau: Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus ficuum. ðiều này cho thấy các loài trên phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên và xuất hiện trên ñậu phộng với tần số rất cao. Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 1 CHƯƠNG I: ðẶT VẤN ðỀ 1.1. ðẶT VẤN ðỀ ðậu phộng là loại cây công nghiệp phổ biến trên thế giới và ở nước ta, nó ñược xem là một trong những cây mũi nhọn về chiến lược kinh tế trong việc sản xuất và khai thác lợi thế của vùng khí hậu nhiệt ñới. Hạt ñậu phộng có giá trị dinh dưỡng cao, chứa nhiều protein và lipid với hàm lượng khá cao, nó cũng là nguồn cung cấp vitamin E, K, B rất quan trọng và cả nguồn thiamine và niacine là những vitamin có rất ít trong các loại ngũ cốc khác. Từ ñậu phộng, người ta có thể chế biến thành các sản phẩm thực phẩm như bánh, mứt, kẹo,...(chiếm khoảng 12% sản lượng ñậu phộng), ngoài ra còn có khoảng 6% sử dụng cho chăn nuôi, 1% cho xuất khẩu và khoảng 80% số ñậu phộng sản xuất ra ñược dùng ñể sản xuất dầu ăn. Ở nước ta, sản lượng ñậu phộng sản xuất ra hàng năm chủ yếu dùng cho xuất khẩu (70 - 80%) cho nên nó là cây ñem lại nguồn thu ngoại tệ rất quan trọng. Tuy nhiên, ở nước ta do ñiều kiện khí hậu nhiệt ñới nóng ẩm cộng với ñiều kiện bảo quản không ñảm bảo nên hạt ñậu phộng rất dễ bị nấm mốc tấn công, gây hư hỏng và không thể sử dụng ñược nữa. Phần lớn nấm mốc trên ñậu phộng thuộc giống Aspergillus, Penicillium, Fusarium và trong số chúng lại sản sinh ra ñộc tố. Theo nghiên cứu, người ta kết luận có 4 ñộc tố hiện diện trên hạt ñậu phộng là: Aflatoxin, Citrinin, Ochratoxin A và Zearalenone trong ñó Aflatoxin ñược ñặc biệt chú ý vì tính ñộc của nó. Sự hiện diện của nấm mốc nhất là Aspergillus sản sinh ñộc tố gây ra những vụ ngộ ñộc, gây chết người và gia súc,... ðặc biệt, chúng còn dẫn ñến gây ung thư gan. Việc biết ñược sự có mặt của các loài Aspergillus trong ñậu phộng có ý nghĩa rất quan trọng, ñể từ ñó có hướng ứng dụng thực tế (vài loài ñược sử dụng ñể sản xuất enzyme, sản phẩm lên men,...), biết ñược sự phân bố của giống ña dạng, ñồng thời phòng chống sự xâm nhập của chúng vào hạt ñậu phộng nói riêng và các loại thực phẩm khô nói chung. Bám sát mục tiêu trên, tôi tiến hành thực hiện ñề tài “Phân lập và ñịnh danh một số loài Aspergillus trên hạt ñậu phộng ở chợ Xuân Khánh - thành phố Cần Thơ”. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Phân lập và làm thuần chủng các loài Aspergillus hiện diện trên ñậu phộng trong quá trình tồn trữ và sự xâm nhiễm trong quá trình vận chuyển hạt. - Xác ñịnh tên gọi từng loài dựa trên các ñặc ñiểm về hình thái và các ñặc ñiểm loài của chúng. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 2 CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. HẠT ðẬU PHỘNG 2.1.1. Cấu tạo hạt ñậu phộng - Về hình dạng: hạt có nhiều hình dạng khác nhau: tròn, bầu dục, ... - Về màu sắc: hạt có màu trắng, hồng, ñỏ sậm,... - Cấu tạo: hạt có 3 bộ phận chính là vỏ lụa, nội nhũ và phôi. + Vỏ lụa: rất mỏng, ở ngoài bao bọc lấy nội nhũ và phôi. Màu sắc của lớp vỏ lụa thay ñổi tùy thuộc vào giống. + Nội nhũ (tử diệp): gồm hai phiến có màu trắng sữa hoặc trắng ngà, hình phẳng lồi, hai mặt phẳng úp vào nhau. + Phôi gồm có ba lá phôi: mầm, phôi lá, phôi rễ. 2.1.2. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng hạt ñậu phộng Hạt ñậu phộng có chứa một hàm lượng lớn lipid, protein, ngoài ra trong ñậu phộng còn có các vitamin, chất khoáng, nước,...Thành phần hóa học hạt ñậu phộng thay ñổi tùy thuộc vào giống và ñiều kiện sinh trưởng. Trong protein ñậu phộng có rất nhiều các acid amin, ñặc biệt là các acid amin cần thiết hiện diện trong ñậu phộng với một tỷ lệ rất cao. Hạt ñậu phộng là nguồn chứa hàm lượng lipid rất cao bao gồm cả các acid béo no và chưa no Bảng 1: Thành phần hóa học hạt ñậu phộng. Thành phần gr/100grams Nước 6,50 Protein 25,80 Lipid 49,24 Tro 2,33 Carbohydrate 16,13 ðường 3,97 Nguồn: USDA National Database for Standard Reference Release 19, 2006. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 3 *Lipid Trong dầu ñậu phộng có khoảng 80% các acid béo chưa no và 20% các acid béo no.Thành phần chính xác các acid béo thay ñổi tùy theo giống và ñiều kiện canh tác.Trong ñó acid oleic và acid linoleic chiếm trên 80% hàm lượng acid béo và trong các acid béo no, acid palmitic chiếm 10%; 10% còn lại là các acid béo tương ñối quan trọng ñã ñược phát hiện gần ñây. Bảng 2: Thành phần các acid béo trong dầu ñậu phộng. Thành phần gr/100grams Tổng lượng acid béo bão hòa 6,834 Acid myristic, 14:0 0.025 Acid palmitic, 16:0 5.154 Acid steric, 18:0 1.100 Tổng lượng acid béo chưa bão hòa 24.429 Acid palmitoleic, 16:1 0.009 Acid oleic, 18:1 23.756 Acid linoleic, 18:3 0.003 Acid α-linoleic, 18:2 15.555 Nguồn: USDA National Database for Standard Reference Release 19, 2006. Dầu ñậu phộng chứa ít phospholipid, trung bình 0,3% (Chu Thị Thơm và cộng sự, 2006 ). Các phospholipid của dầu ñậu phộng là một trong những trụ cột của ngành công nghiệp dầu do khả năng tạo nhũ tương và ñặc tính chống oxy hóa của chúng. Dầu ñậu phộng tương ñối ổn ñịnh so với nhiều dầu thực vật khác do trong dầu ñậu phộng có tocopherol là chất chống oxy hóa chủ yếu. *Protein ðậu phộng có chứa khoảng 26% protein trong ñó globulin là cao nhất, khoảng 97% hàm lượng protein. Ngoài ra còn có hàm lượng không ñáng kể các albumin, prolamin, glutein. Hệ số tiêu hóa của protein ñậu phộng khoảng 89%. Trong protein ñậu phộng có chứa các acid amin cần thiết cho dinh dưỡng người. Tuy nhiên, dựa trên kết quả phân tích và trên nhiều thí nghiệm người ta nhận thấy rằng cac protein của ñậu phộng bị hạn chế trước hết bởi methionin rồi tới lysine và threonin. Ngoài ra còn có ít nhất 16 acid amin ñược tìm thấy ở dạng tự do, những acid amin này có liên quan ñến phản ứng hóa nâu trong quá trình chế biến. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 4 Bảng 3: Thành phần các acid amin trong protein ñậu phộng. Amino acids gr/100grams Tryptophan 0,250 Threonin 0,883 Isoleucine 0,907 Leucine 1,672 Lysine 0,926 Methionine 0,317 Cystine 0,331 Phenylalanine 1,337 Tyrosine 1,049 Valine 1,082 Arginine 3,085 Histidine 0,652 Alanine 1,025 Aspartic acid 3,146 Glutamic acid 5,390 Glycine 1,554 Proline 1,138 Serine 1,271 Nguồn: USDA National Database for Standard Reference Release 19, 2006. * Vitamin - Vitamin tan trong dầu: ðậu phộng có lượng rất ít các vitamin A, D và caroten. Trong khi ñó các vitamin E chiếm số lượng ñáng kể tồn tại ở dạng tocopherol và là tác nhân chống oxy hóa chủ yếu trong dầu ñậu phộng. - Vitamin tan trong nước: ðậu phộng là nguồn khá dồi dào về các vitamin tan trong nước. + ðậu phộng không chứa vitamin C. + Vitamin B1 (thiamine) ñược thấy trong ñậu phộng ít nhất ở ba dạng thiamine, thiamine monophosphate và thiamine pyrophosphate với tỷ lệ 33:10:1 (Chu Thị Thơm và cộng sự, 2006). Ngoài ra, còn có riboflavin, niacine,... Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 5 Bảng 4: Thành phần các vitamin trong hạt ñậu phộng. Vitamin mg/100grams Vitamin C 0,000 Thiamine 0,640 Riboflavin 0,135 Niacine 12,006 B6 0,348 E (tocopherol) 8,330 Folate, tổng số (mcg/100gr) 240 Nguồn: USDA National Database for Standard Reference Release 19, 2006. * Chất khoáng Hạt ñậu phộng là nguồn cung cấp các chất khoáng như Ca, P, Mg, Na, Fe,... Trong hạt các cây lấy dầu trong ñó có ñậu phộng, hàm lượng các nguyên tố khoáng thường lớn hơn 1,8 - 2,2 lần so với hạt các loại cây khác. Bánh dầu ñậu phộng (hạt ñậu phộng sau khi lấy dầu) chứa rất nhiều các khoáng vi lượng và protein. Bảng 5: Thành phần các chất khoáng trong hạt ñậu phộng. Chất khoáng mg/100grams Ca 92 Fe 4,58 Mg 168 P 376 K 705 Na 18 Zn 3,27 Cu 1,144 Mn 1,934 Nguồn: USDA National Database for Standard Reference Release 19, 2006. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 6 Ta thấy rằng, ñậu phộng là một loại hạt có nhiều lipid và protein. Sau thu hoạch nhất là trong ñiều kiệu khí hậu nhiệt ñới nóng ẩm như ở nước ta hạt ñậu phộng có nhiều diễn biến hóa sinh làm thay ñổi th